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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Resumen

Análisis de alta resolución de la morfología y función de las neuronas de mamíferos a menudo requiere la determinación del genotipo de los animales individuales, seguido por el análisis de cultivos primarios de neuronas. Se describe un conjunto de procedimientos para: etiquetado de los ratones recién nacidos que se genotipo, genotipificación rápida, y el establecimiento de cultivos de baja densidad de las neuronas del cerebro de estos ratones. Ratones individuales están etiquetados por los tatuajes, que permite la identificación a largo plazo que dura hasta la edad adulta. Genotipado por el protocolo descrito es rápido y eficiente, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico con una buena fiabilidad. Esto es útil en circunstancias donde el tiempo suficiente para el genotipado convencional no está disponible, por ejemplo, en los ratones que sufren de letalidad neonatal. Cultivos primarios de neuronas se generan a baja densidad, que permite a los experimentos de imagen a alta resolución espacial. Este método de cultivo requiere la preparación de capas de alimentación gliales antes de chapado neuronal. El protocol se aplica en su totalidad a un modelo de ratón de la distonía trastorno del movimiento DYT1 (AE-torsinA ratones knock-in), y cultivos neuronales se prepara a partir del hipocampo, la corteza cerebral y el estriado de estos ratones. Este protocolo se puede aplicar a los ratones con otras mutaciones genéticas, así como a animales de otras especies. Además, los componentes individuales del protocolo se pueden utilizar para los sub-proyectos aislados. Por lo tanto este protocolo tendrá amplias aplicaciones, no sólo en la neurociencia, sino también en otros campos de las ciencias biológicas y médicas.

Introducción

Modelos de roedores de enfermedades genéticas han demostrado ser útiles en el establecimiento de las funciones fisiológicas de las proteínas normales y ácidos nucleicos, así como las consecuencias fisiopatológicas de defectos en estos. Los ejemplos incluyen ratones deficientes para proteínas implicadas en funciones celulares clave, así como modelos de ratón de trastornos tales como la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, ciertas manipulaciones genéticas pueden conducir a la letalidad neonatal poco o unos pocos días después del nacimiento. En estos casos, los cultivos celulares primarios son una herramienta importante porque las células vivas se pueden obtener de las crías de embriones o neonatales antes de la muerte, que pueden mantenerse durante al menos un par de semanas in vitro, y durante este tiempo el desarrollo neuronal temprana pueden ser seguidos por experimentos bioquímicos, morfológicos y funcionales. Para los cultivos primarios, puede ser beneficioso para la placa de las neuronas a baja densidad; esto hace que sea posible visualizar la somata individual, dendritas, árboles axonal y termi nervionales en alta resolución espacial. Sin embargo, la supervivencia y la diferenciación de las neuronas a baja densidad típicamente requiere que se colocan en una capa alimentadora glial, co-cultivadas con células gliales en la ausencia de contacto físico con ellos, o se cultivaron en medio acondicionado por células gliales 1.

El establecimiento de cultivos neuronales de baja densidad en capas alimentadoras gliales puede depender de rápido y fiable de genotipado de antemano - dentro de unas pocas horas en contraste con unos pocos días. La velocidad es especialmente importante cuando el genotipo neuronal necesita ser adaptada a la de una capa alimentadora glial preparado de antemano. Como un ejemplo más práctico, puede ser necesario decidir que las crías de que el genotipo para usar en cultivos de generación, para optimizar la eficiencia de un experimento.

Aquí demostramos el protocolo de trabajo que se ha utilizado para una rápida y simplificada y fiable de genotipado de ratón en publicaciones anteriores 2-6. Colas de ratón yse utilizó un kit disponible comercialmente. Este protocolo incluye la extracción de una sola etapa de los ácidos nucleicos a partir del tejido, y no requiere ni una etapa de purificación de ácido nucleico ni el uso de un tampón de terminación ("solución de parada '). La fiabilidad de este método de genotipificación se ilustra mediante la presentación de los resultados de una serie de pruebas cuando se introducen las diferencias con respecto a la cantidad de partida de los especímenes, la edad de los animales y la longitud de los amplicones de PCR. Este kit ofrece las ventajas de la extracción y la fiabilidad automatizado.

Por el bien de ser integral, también se demuestra el uso de los tatuajes para la identificación a largo plazo de los ratones con genotipo. El tatuaje se logra mediante la aplicación de la tinta de tatuaje en la dermis de la piel (debajo de la epidermis) 7. Se describe un procedimiento para el tatuaje las almohadillas de las patas de ratones recién nacidos o 1 día de edad, aunque los tatuajes se pueden aplicar a otras partes del cuerpo, tales como colas y dedos de los pies, y para animals, de todas las edades. Además, los procedimientos se demostrarán para el recubrimiento y el cultivo de neuronas de ratón a una densidad baja, basado en la preparación optimizada de diferentes tipos de capas de alimentación gliales 2,8.

Usamos un modelo genético de ratón de la enfermedad neurológica DYT1 distonía heredado - un trastorno de movimiento autosómica dominante causada por una mutación en el gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteína codificada, torsinA, pertenece a los "ATPasas asociados a diversas actividades celulares" (AAA +) familia de proteínas, cuyos miembros en general, desempeñará las funciones de tipo chaperón, la asistencia en: proteína que se desarrollan, desmontaje-proteína compleja, el tráfico de membrana, y la fusión de vesículas 10-13. La mutación en un marco de supresión de un codón para el ácido glutámico, y pueden llevar a la manifestación de "inicio temprano generalizado aislado distonía '14,15. Sin embargo, el caminomecanismos ophysiological responsables de este trastorno siguen siendo poco conocidos. En un modelo de ratón knock-in, el alelo mutante es TOR1A tm2Wtd, mencionado en lo sucesivo como TOR1A AE. Heterocigota? E-torsinA knock-en ratones son pacientes humanos viables genéticamente y mímicas con distonía DYT1, mientras homocigotos ronda en ratones mueren después del nacimiento 16,17, con la latencia a la muerte postnatal afectados por los antecedentes genéticos 18. La temprana muerte de homocigotos ratones knock-in requiere que tanto la determinación del genotipo de los animales y el establecimiento de cultivos neuronales se completan rápidamente. Como otro ejemplo de genotipado, TFAP2A (factor de transcripción AP-2α, la activación de la proteína de unión a 2α potenciador) se utilizará. La proteína codificada por este gen es importante en la regulación de múltiples procesos celulares, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y apoptosis 19.

Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Iowa.

Identificación 1. a largo plazo de ratones utilizando Tatuaje las almohadillas de las patas

  1. Inmovilizar una pata con la (superficie plantar) almohadilla plantar cara al experimentador. Sostenga la pata con el pulgar y el dedo índice. Tenga cuidado de no pellizcar la pata.
    NOTA: inmovilización estable es importante asegurarse de que el pigmento del tatuaje se coloca en la dermis de la almohadilla de la pata, y por lo tanto es permanente 7.
  2. Limpiar la almohadilla de la pata con etanol al 70% sobre una esponja de gasa o hisopo.
  3. Aplicar aceite de la piel a un aplicador con punta de algodón, y presionar suavemente la punta contra la superficie de la almohadilla de la pata varias veces. Utilice sólo una pequeña cantidad de aceite de la piel; cuando está presente en grandes cantidades, se evitará que el pigmento del tatuaje de llegar a la piel.
  4. Sumerja las puntas de las agujas de tatuaje en la tinta de tatuaje justo antesa los tatuajes. Utilice limpia, aséptica y agujas de tatuaje afilados, para disminuir el dolor y la posibilidad de infección, y también para aumentar la eficiencia de tatuaje.
  5. Mientras que la superficie de la almohadilla de la pata se cubre con el aceite de la piel, presione la punta de aguja del tatuaje vertical y ligeramente contra la piel en el centro de la almohadilla de la pata, y se inyecta la tinta en múltiples ocasiones. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para la información sobre el sistema de tatuaje eléctrica.
  6. Rocíe etanol al 70% en una esponja de gasa, presione suavemente contra la pata de eliminar pigmento del tatuaje extra en la superficie de la piel, e inspeccionar la calidad del tatuaje. Compruebe que el medio de la almohadilla de la pata tiene un punto oscuro, redondo que difiere de la pigmentación normal de la piel. Si el tatuaje no es oscuro o lo suficientemente grande como para facilitar la visualización, repita los pasos anteriores para tatuajes.

2. Los ratones recién nacidos Genotipado utilizando un kit de PCR genotipificación rápida

  1. Desinfectar el extremo distal de una cola de ratón con etanol al 70%, corte 5 mm o menos de la colala punta y la transfiere a un tubo de una tira 8 de tubo del tipo utilizado para la PCR. Use una hoja de afeitar no-utilizado para cada cachorro para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. Alternativamente, utilice un par de tijeras, pero en este caso, con cuidado y eliminar completamente el tejido restante en las palas utilizando etanol al 70%. Compruebe si hay sangrado. Si se produce sangrado, aplique presión en la parte de corte de la cola con una esponja de gasa hasta que el sangrado se ha detenido.
  2. Añadir 200 l de solución de extracción de ADN a cada tubo de PCR que contiene una muestra. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para su composición e información sobre el kit.
  3. Coloque la tira tubo en un termociclador de PCR, y comenzar la extracción de ADN utilizando el siguiente programa: 1 ciclo a 55 ° C durante 10 min, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, y mantenimiento a 4 ° C.
    NOTA: Este es el mismo termociclador de PCR que se utiliza después para PCR.
  4. Una vez finalizada la extracción de ADN, retire la tira del tubo del termociclador unnd invertir 5 veces.
  5. Transferencia de 4 l de la solución (extracto de ADN) de cada muestra a un un-tubo utilizado de una tira de 8 tubos y mezclar con: 10 l de 2X PCR Ready Mix II, 2 l de mezclado adelante y atrás primers (se recomienda 0,5 M; véase la Tabla de Materiales / Equipo de secuencias), y 4 l de nucleasa libre de H 2 O, para cada muestra. Centrifugado brevemente (por ejemplo, 3 segundos) usando una centrífuga de mesa. Mantener los tubos en hielo en todo momento excepto durante la manipulación.
  6. Realizar ciclos térmicos. Ver Tabla de Materiales / Equipo para el programa térmico.
  7. Detectar los productos de ADN amplificados. Cargar la solución de reacción total de la PCR (20 l) directamente en un pocillo de un gel de agarosa. Cargar los marcadores de peso molecular en un pozo separado. Aplicar un campo eléctrico.
  8. Adquirir imágenes de fluorescencia de las bandas bajo la luz ultravioleta.

3. cultivo primario de cerebro de ratón Neuronas en glial conexión de la capa

NOTA: Los procedimientos para la disección de cerebro y de disociación de células (3,1) son comunes a todos los procedimientos posteriores. Los procedimientos de culturas gliales ratón (3.2), las culturas gliales de rata (3,3), y cultivos neuronales de ratón (3.4) se describen por separado después.

  1. Cerebro Disección y Celular Dissocaiation
    1. Sacrificar un ratón o una rata crías por decapitación, retire rápidamente el cerebro, y lo coloca en una solución de Hanks (ver Tabla 1 para la composición) + 20% de suero fetal bovino (SFB) en una placa de 35 mm (conservado en hielo).
    2. Cortar el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios. Retire la región de interés (por ejemplo, la corteza cerebral, cuerpo estriado e hipocampo) de cada hemisferio del cerebro. Retire las meninges y los principales vasos sanguíneos de la superficie. Cortar la región del cerebro en 4-10 rodajas finas utilizando una cuchilla quirúrgica.
    3. Enjuague las rodajas de cerebro en un tubo de centrifugación de 15 ml, una vez que el ingenioLa solución de + 20% de FBS, y luego 3 veces con la Hanks 'h Hanks solución (es decir, sin suero) (todos a 4 ° C). Para enjuagar, añadir solución de 5-10 ml, dejar que el cerebro rebanadas se depositan en el fondo del tubo, aspirar la solución desde la parte superior, y añadir una solución fresca. Finalice el procedimiento de enjuague mediante la aspiración de la solución.
    4. Filtra 2 ml de la solución de digestión que contiene tripsina (véase la Tabla 1 para la composición) usando una jeringa de 3 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente en el tubo que contiene las rodajas de cerebro. Deje que el tratamiento con tripsina proceder durante 13 minutos a temperatura ambiente.
    5. Neutralizar la solución de tripsina primero mediante la aspiración de la mayor parte de ella y luego mediante la adición de 7-10 ml de solución de Hanks '+ 20% FBS (4 ° C).
    6. Enjuagar las rodajas de cerebro, dos veces con Hanks '+ solución de FBS al 20%, y luego tres veces con la Hanks' solución (es decir, sin suero) (todos a 4 ° C). Finalice el procedimiento de enjuague aspirando el solutde iones.
    7. Filtra 2 ml de la solución de disociación (véase la Tabla 1 para la composición) usando una jeringa de 3 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente al tubo con las rodajas de cerebro.
    8. Mecánicamente disociar las células por trituración suave 10-20 veces, hasta que las piezas de tejido visibles desaparecen. Use una pipeta Pasteur pulida al fuego algodón tapado y evitar hacer burbujas durante la trituración.
    9. Espere 3 minutos para piezas pequeñas para establecerse.
    10. Transferir la mayoría de la solución (~ 1,5 ml, dejando un poco de solución en la parte inferior) a un tubo de 15 ml de centrifugación que contiene 3 ml de solución de Hanks solución de FBS + 20% (4 ° C), utilizando el algodón enchufado, fuego pulido pipeta Pasteur. No transfiera toda la solución, porque la inserción de ningún sedimento en el fondo general resulta en el deterioro de la cultura.
    11. Se centrifuga durante 13 min a ~ 185 g (~ 1100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirar el sobrenadante con cuidado,añadir 1 ml de pre-calentado medio de baño (37 ° C) al sedimento, y resuspender que pipeteando suavemente varias veces utilizando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego.
      NOTA: Hay tres tipos diferentes de chapado medios se utilizan para diferentes propósitos cultura: chapado medio-1 para las células gliales del ratón, enchapado medio-2 para las neuronas de ratón, y enchapado medio-3 para las neuronas de rata y células gliales (ver Tabla 1 para las composiciones) .
    13. Sacar 10 l de la suspensión celular, se mezcla con 10 l de solución de azul de tripano al 0,4%, y medir la densidad de células vivas, utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  2. Culturas del ratón gliales
    1. Lavar los cubreobjetos para ayudar a establecer culturas saludables de células de ratón.
      1. Sumerja cubreobjetos de vidrio (redondo, diámetro 12 mm) en ácido nítrico al 70% en una placa de Petri de vidrio. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio y colocarlo en un orbital agitador O / N.
      2. Enjuague el vaso coverslips en la placa de Petri al menos tres veces con agua destilada. Sumergir en agua destilada. Coloque el plato en un orbital agitador O / N.
      3. Seque el cubreobjetos sobre un papel de filtro Whatman 150 mm en la cabina de seguridad biológica.
      4. Autoclave los cubreobjetos.
      5. Coloque el cubreobjetos en 24 pocillos placa de cultivo.
    2. Etiqueta y genotipo ratones recién nacidos de acuerdo con los pasos 1 y 2.
    3. Obtener las células cerebrales de las crías de ratón, según el paso 3.1.
      NOTA: El uso de la corteza cerebral es típico para la preparación de la capa alimentadora glial ratón. Sin embargo, otras regiones del cerebro, como el hipocampo y el cuerpo estriado, trabajarán después del ajuste adecuado de la densidad celular debido a diferentes números y los rendimientos de las células de diferentes regiones.
    4. Añadir ~ 4 ml de pre-calentado chapado medio-1 a la suspensión final de células (~ 1 ml). Para pre-calentamiento medios de cultivo, colocar la solución en la incubadora de cultivo (5% de CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, parapermiten que los valores de temperatura y de pH se estabilice.
    5. Transferir la suspensión celular a un matraz de cultivo T25 sin revestir, usando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar el frasco en la incubadora de cultivo.
    6. En 1 día in vitro (DIV), enjuagar las células cultivadas en el frasco T25 dos veces con medio de baño-1 (4 ° C). Colocar el matraz de nuevo en la incubadora. Realizar aclarado por aspiración el medio interior del matraz completamente con una pipeta Pasteur, añadiendo ~ 5 ml de medio fresco y inclinando suavemente el matraz varias veces en un movimiento de torbellino.
    7. En 6-9 DIV, (es decir, un día antes de la tripsinización y enchapado en cubreobjetos, en pasos 3.2.8-3.2.13), colocar 100 l de material de recubrimiento con proteínas de la matriz extracelular (véase la Tabla de Materiales / Equipo para comentarios acerca de el material de revestimiento) en los cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo, y coloque la placa de cultivo en el incubador de cultivo.
    8. En 7-10 DIV, cuando las células son 20-40% confluentes (espacialmente continua), trypsinize ellos.
      1. Lavar el matraz una vez, por aspiración de toda la solución en el matraz y la adición de ~ 13 ml de solución de Hanks (4 ° C), inclinar suavemente el matraz varias veces en un movimiento de torbellino, y aspirar la solución completamente.
      2. Añadir 40 l de solución de DNasa (concentración final, 750 unidades / ml) a 4 ml de solución de tripsina-EDTA, pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente a las células en el matraz.
      3. Deje que el tratamiento con tripsina proceder durante 13 minutos a 37 ° C en la incubadora.
      4. Neutralizar la solución de tripsina mediante la adición de 2 ml de 100% de SFB (4 ° C) en el matraz.
      5. Transferencia de las células tratadas con tripsina a un tubo de 15 ml utilizando una centrifugación de 5 a 10 ml pipeta, añadir ~ 4 ml de solución de Hanks '+ 20% FBS (4 ° C), se centrifuga a ~ 185 g y 4 ° C durante 13 min y aspirar el sobrenadante.
    9. Resuspender el precipitado en 1 ml de pre-Warmemedio-1 d chapado.
    10. Medir la densidad de las células de acuerdo con la etapa 3.1.13.
    11. Aspirar el material de revestimiento completamente de los cubreobjetos de vidrio, y la placa de ~ 50 l de las células gliales se volvieron a suspender en cubreobjetos.
      NOTA: Estas células establecerán la capa alimentadora glial.
    12. Coloque la placa de cultivo con cubreobjetos en la incubadora.
    13. 20-60 min después, añadir 1 ml de pre-calentado medio de baño-1 a cada pocillo, y colocar el plato de nuevo en la incubadora. Nota: Mientras se añade el medio de recubrimiento, será útil usar otra pipeta para presionar hacia abajo la periferia del cubreobjetos (donde no hay células sembradas), de modo que el cubreobjetos no flotar en el medio.
    14. En DIV 1 de la capa alimentadora glial (es decir, en el cubreobjetos de vidrio), sustituir el medio con 1 ml de pre-calentado chapado medio-1, mediante la aspiración de toda la solución en un pozo y después de llenarlo con medio fresco.
    15. En 2-3 DIV de la capa alimentadora glial cuando el cells son 80-100% confluentes, añadir inhibidor mitótico (10 l de una mezcla de 5-fluoro-2 'desoxiuridina + uridina; concentraciones finales de 81,2 y 204,8 mu M, respectivamente) a cada pocillo, para inhibir la replicación del ADN y por lo tanto suprimir la proliferación de células gliales.
    16. En 7-9 DIV, cuando las células son 90-100% de confluencia (1-2 h antes de chapado neuronas en la capa alimentadora glial), sustituir el medio de cultivo con pre-calentado chapado medio-2 (37 ° C).
      NOTA: Las neuronas se sembraron en el mismo día, con el paso 3.4.
  3. Culturas Rata gliales
    1. Escudo un matraz de cultivo T25 con el mismo material de recubrimiento.
      NOTA: Esto es necesario para la posterior extracción de las células no adherentes en el paso 3.3.5.
      1. Añadir 2,0 ml del material de revestimiento al matraz, y colocar el matraz en el incubador de cultivo.
      2. Después de 2-3 horas, aspirar el material de recubrimiento por completo, de tal manera que el suelo del matraz se vuelve seca.
    2. Obtener las célulasde las crías de rata, según la etapa 3.1.
      NOTA: La región CA3-CA1 del hipocampo se utiliza para la preparación de la capa alimentadora glial de rata. Sin embargo, otras regiones del cerebro, tales como la corteza cerebral y el cuerpo estriado, trabajarán después de ajustar por diferencias en la densidad celular debido a diferentes números y rendimientos de células de diferentes regiones.
    3. Añadir ~ 4 ml de pre-calentado chapado medio-3 a la suspensión final de células (~ 1 ml).
    4. Transferir la suspensión celular en el matraz de cultivo T25 recubiertos, usando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar el frasco en la incubadora de cultivo (5% de CO 2 -95% de O 2, 37 ° C).
    5. En 2-3 DIV, cuando las células son 20-40% de confluencia, retire no adherente o débilmente células adherentes, mediante el cierre de la tapa con fuerza, agitando el matraz vigorosamente ~ 10 veces, aspirando la solución, y la adición de 4-5 ml de chapado medio-3 (a 4 ° C). Repita este procedimiento una vez. Examinar las células cultivadas a través de toda la planta matraz (por ejemplo,usando microscopio de contraste de fase) para confirmar que los que aparecen neuronal (es decir, aquellos para los que el borde exterior del cuerpo celular aparece en fase brillante) se elimina por completo. Repita el procedimiento con la frecuencia necesaria para eliminar estas células y, a continuación, devolver el frasco a la incubadora.
      NOTA: La fuerza y ​​el número total de 'sacudidas' requeridas pueden variar entre los experimentadores individuales. Lo importante no es mantener el número total de batidos a un número determinado, pero para confirmar que las células tipo neuronas son eliminados.
    6. En 6-8 DIV, cuando las células son 90-100% de confluencia, el paso de las células gliales por tripsinización como en el paso 3.2.8.
    7. Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de baño-3 (4 ° C), añadir 10 ml de medio de baño-3 (4 ° C), la transferencia de las células tratadas con tripsina a un matraz T75-un recubiertos, y la cultura en la incubadora.
      NOTA: Las células gliales de rata se pasaron dos veces; en contraste las células gliales del ratón are pases sólo una vez porque se vuelven poco saludable después de varios pasajes. Las células gliales de rata se pasaron en matraces T75 que no están recubiertos con cualquier material de recubrimiento. El recubrimiento permite que las células gliales de rata crezcan demasiado rápido y producen muchas células ciliadas (células ependimarias putativos), que se deterioran las condiciones de cultivo neuronal después.
    8. En 17-19 DIV de la cultura glial en un matraz (es decir, 11 días después de pases y un día antes de la tripsinización y enchapado en cubreobjetos por pasos 3.3.9-3.3.14), 100 l de colocar el material de revestimiento en cubreobjetos de vidrio sin lavar ( redonda, 12 mm de diámetro) en una placa de cultivo, y coloque la placa de cultivo en el incubador de cultivo.
      NOTA: Para los cultivos gliales de rata, una diferencia no se observó en los resultados de los cultivos con o sin lavarse los cubreobjetos.
    9. En 18-20 DIV de la cultura glial en un matraz (es decir, 12 días después de los pases), preparar la capa alimentadora glial por trypsinizing las células cultivadas, según step 3.2.8.
    10. Durante la centrifugación, aspirar el material de revestimiento completamente de los cubreobjetos de vidrio.
    11. Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de chapado-3 (4 ° C), y medir la densidad celular, según la etapa 3.1.13.
    12. Ajuste la densidad glial a 10 4 células / ml en vivo, y la placa 100 l de la suspensión de células gliales en los cubreobjetos de vidrio recubiertos.
      NOTA: Estas células establecerán la capa alimentadora glial.
    13. Coloque la placa de cultivo con cubreobjetos en la incubadora durante 20-60 min.
    14. Añadir 1 ml de medio de chapado-3 (4 ° C) a cada pocillo, y colocar el plato de nuevo en la incubadora.
    15. En 3-4 DIV de la capa alimentadora glial, cuando las células sobre cubreobjetos son 40-80% de confluencia, añadir 1 ml del medio de crecimiento pre-calentado (véase la Tabla 1 para la composición) que contiene citosina β-D-arabinofuranósido ( AraC, concentración final de 4 mM) para detener la proliferación de células gliales. Neurona Plates a 7-9 DIV de la capa alimentadora glial cuando las células son 60-80% de confluencia, con el paso 3.4.
  4. Culturas del ratón neuronales
    1. Etiqueta y genotipo ratones recién nacidos de acuerdo con los pasos 1 y 2.
    2. Utilice las crías de ratón para el paso 3.1.
    3. Ajuste la densidad de la suspensión de células vivas a ~ 2,0 x 10 5 células / ml utilizando pre-calentado chapado medio-2 para el recubrimiento sobre las células gliales del ratón, o el uso de chapado medio-3 para el recubrimiento sobre las células gliales de rata.
    4. Placa de las células en la capa alimentadora glial, añadiendo suavemente la suspensión celular al medio de cultivo de cada pocillo. Nota: El volumen de la suspensión celular que se añade será determinado por el número de destino de las células en un pocillo de cultivo. Por ejemplo, la placa de ~ 60 l de suspensión de células para alcanzar 12.000 células / pocillo.
    5. Tenga en cuenta que no hay solución cambios son necesarios después de que las neuronas se sembraron. Tenga cuidado para evitar la evaporación de la solución de los pozos en el transcurso de la cultura, por humidificar el interior of la incubadora de cultivo.

Resultados

Como ejemplo de la aplicación de este protocolo, los resultados representativos se muestran para el etiquetado de los ratones por los tatuajes, genotipificación fiable en diversas condiciones experimentales, y el establecimiento de cultivos primarios de neuronas en capas de alimentación gliales.

El tatuaje

Los cachorros recién nacidos fueron marcadas en las almohadillas de las patas utilizando un sistema de tatuajes ('recién nacido' ...

Discusión

El protocolo que aquí se presenta incluye procedimientos para tatuar etiquetar / identificar los ratones, para el genotipado de los ratones de cola consejos, y para el cultivo de neuronas del cerebro del ratón en baja densidad. En una ronda de experimentos utilizando 6-8 crías, estos procedimientos requieren típicamente ~ 0,5 h, ~ 4 horas y ~ 2 h, respectivamente, en un total de 07.06 h. Esto hace que sea práctico para un solo experimentador para completar todos los trámites necesarios desde el momento del nacimie...

Divulgaciones

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Agradecimientos

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

Referencias

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. , 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M., Banker, G., Goslin, K. . Ch. 18. Culturing Nerve Cells. , 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

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