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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons les procédures pour l'étiquetage et le génotypage des souris nouveau-nés et de générer des cultures de neurones primaires d'eux. Le génotypage est rapide, efficace et fiable, et permet pour l'extraction de l'acide nucléique automatisé. Ceci est particulièrement utile pour les souris néonatale létales et leurs cultures qui nécessitent l'achèvement préalable de génotypage.

Résumé

Analyse à haute résolution de la morphologie et la fonction des neurones de mammifères nécessite souvent le génotypage des animaux individuels, suivie par l'analyse des cultures primaires de neurones. Nous décrivons un ensemble de procédures pour: l'étiquetage souriceaux nouveau-nés pour être génotypés, le génotypage rapide, et l'établissement de cultures à faible densité de neurones du cerveau de ces souris. Souris individuels sont repérés par le tatouage, ce qui permet une identification à long terme durable à l'âge adulte. Génotypage par le protocole décrit est rapide et efficace, et permet l'extraction automatisée des acides nucléiques avec une bonne fiabilité. Ce est utile dans des circonstances où le temps suffisant pour le génotypage conventionnelle ne est pas disponible, par exemple, chez les souris qui souffrent de létalité néonatale. Cultures de neurones primaires sont générés à faible densité, qui permet des expériences d'imagerie à haute résolution spatiale. Cette méthode de culture nécessite la préparation de couches nourricières gliales avant le placage neuronale. Le pPROTOCOLE est appliquée dans sa totalité à un modèle de souris de la dystonie trouble du mouvement DYT1 (souris knock-in-torsinA AE), et les cultures neuronales sont préparées à partir de l'hippocampe, le cortex cérébral et le striatum de ces souris. Ce protocole peut être appliqué à des souris avec d'autres mutations génétiques, ainsi que pour d'autres espèces d'animaux. En outre, les composants individuels du protocole peut être utilisé pour les sous-projets isolés. Ainsi ce protocole aura de larges applications, non seulement en neurosciences, mais aussi dans d'autres domaines des sciences biologiques et médicales.

Introduction

des modèles de rongeurs de maladies génétiques se sont révélés utiles dans l'établissement des fonctions physiologiques normales de protéines et d'acides nucléiques, ainsi que les conséquences pathophysiologiques de défauts de ceux-ci. Des exemples comprennent les souris déficientes pour des protéines impliquées dans des fonctions cellulaires clés, ainsi que des modèles murins de maladies telles que la maladie d'Alzheimer. Cependant, certaines manipulations génétiques peuvent conduire à létalité néonatale peu ou quelques jours après la naissance. Dans ces cas, des cultures de cellules primaires sont un outil important parce que les cellules vivantes peuvent être obtenus auprès des chiots embryonnaires ou néonatales avant la mort, ils peuvent être conservés pendant au moins quelques semaines in vitro, et pendant ce temps le développement neuronal début peuvent être suivies par expériences biochimiques, morphologiques et fonctionnelles. Pour les cultures primaires, il peut être bénéfique à l'assiette les neurones à faible densité; ce qui permet de visualiser le soma individuel, dendrites, arbres axonales et le nerf termisignaux à haute résolution spatiale. Toutefois, la survie et la différenciation des neurones à faible densité nécessite généralement qu'ils sont étalées sur une couche nourricière gliale, co-cultivées avec des cellules gliales en l'absence de contact physique avec eux, ou cultivées dans du milieu conditionné par des cellules gliales 1.

L'établissement de faible densité des cultures de neurones sur des couches nourricières gliales peut dépendre rapide et fiable génotypage préalable - dans un peu d'heures à la différence de quelques jours. La vitesse est particulièrement importante lorsque le génotype neuronal doit être adaptée à celle d'une couche d'alimentation gliale préparé à l'avance. A titre d'exemple plus pratique, il peut être nécessaire de décider lequel des chiots qui génotype à utiliser dans des cultures de production, afin d'optimiser l'efficacité d'une expérience.

Ici, nous démontrons le protocole de travail qui a été utilisé pour le génotypage de la souris rapide, simplifiée et fiable dans les publications précédentes 2-6. Queues de souris etun kit disponible dans le commerce sont utilisés. Ce protocole comprend une seule étape d'extraction d'acides nucléiques à partir du tissu, et ne nécessite ni une étape de purification des acides nucléiques, ni l'utilisation d'un tampon de terminaison («stop solution"). La fiabilité de cette méthode de génotypage est illustré en présentant les résultats d'une série d'essais lorsque des différences sont introduites par rapport à la quantité de départ des échantillons, l'âge de l'animal et la longueur des amplicons PCR. Ce kit offre les avantages de l'extraction et la fiabilité automatisé.

Par souci d'être complet, l'utilisation du tatouage d'identification à long terme des souris génotypés est également démontrée. Le tatouage est réalisé par application d'une encre de tatouage dans le derme de la peau (sous l'épiderme) 7. Un procédé est décrit pour le tatouage les coussinets des pattes de souris nouveau-nés ou de vieux un jour, bien que les tatouages ​​peuvent être appliqués à d'autres parties du corps, telles que les queues et les orteils, et animals de tous âges. En outre, les procédures seront montrées pour le placage et la culture de neurones de souris à une faible densité, sur la base de la préparation optimisée des différents types de couches nourricières gliales 2,8.

On utilise un modèle de souris génétique du trouble neurologique héréditaire DYT1 dystonie - un trouble du mouvement autosomique dominante causée par une mutation dans le gène de TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La protéine codée, torsinA, fait partie des "ATPases associées à diverses activités cellulaires" (AAA +) de la famille des protéines, dont les membres accomplissent généralement des fonctions de chaperon, en aidant à: dépliement des protéines, la protéine complexe de démontage, le trafic membranaire, et la fusion des vésicules 10-13. Les résultats de mutation dans une délétion en cadre d'un codon pour l'acide glutamique, et peuvent conduire à la manifestation de «l'apparition précoce de la dystonie généralisée isolé» 14,15. Cependant, la voieophysiological mécanismes responsables de cette maladie sont encore mal compris. Dans un modèle de souris knock-in, l'allèle mutant est Tor1a tm2Wtd, mentionné ci-après comme Tor1a AE. Hétérozygote AE-torsinA souris knock-in sont des patients humains viables et génétiquement imitent avec DYT1 dystonie, alors homozygote souris knock-in meurent après la naissance 16,17, avec la latence à mort postnatale touchés par bagage génétique 18. La mort précoce de souris knock-in homozygote nécessite que tant l'analyse génotypique des animaux et l'établissement de cultures de neurones sont achevées rapidement. Comme autre exemple de génotypage, TFAP2A (facteur de transcription AP-2α, la protéine de liaison d'activation activateur 2α) sera utilisée. La protéine codée par ce gène est important dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la survie et l'apoptose 19.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Iowa.

1. identification à long terme des souris en utilisant tatouage les coussinets

  1. Immobiliser une patte avec le coussinet (surface plantaire) face à l'expérimentateur. Maintenez la patte avec le pouce et l'index. Veillez à ne pas pincer la patte.
    NOTE: Stable immobilisation est important de veiller à ce que le pigment de tatouage est placé dans le derme de la coussinet, et est donc permanent 7.
  2. Badigeonner le coussinet avec 70% d'éthanol sur une éponge ou un tampon de gaze.
  3. Appliquer de l'huile de la peau pour un applicateur de coton-tige, et appuyez doucement la pointe contre la surface de la tablette de la patte à plusieurs reprises. Utilisez seulement une petite quantité d'huile de la peau; lorsqu'il est présent en grandes quantités, elle permet d'éviter le pigment de tatouage d'atteindre la peau.
  4. Tremper les pointes des aiguilles de tatouage dans l'encre de tatouage juste avantau tatouage. Utilisez propre, aseptique et aiguilles de tatouage pointus, à diminuer la douleur et la possibilité de l'infection, et aussi pour augmenter l'efficacité de tatouage.
  5. Bien que la surface de coussinet est couvert avec l'huile de la peau, appuyez sur les pointes d'aiguilles de tatouage verticalement et légèrement contre la peau dans le centre du pavé de la patte, et injecter l'encre plusieurs fois. Voir la Table des Matières / Equipement pour informations sur le système de tatouage électrique.
  6. Vaporiser éthanol à 70% sur une éponge de gaze, appuyez doucement contre la patte pour enlever le pigment de tatouage supplémentaire sur la surface de la peau, et d'inspecter la qualité de tatouage. Vérifiez que le milieu de coussinet a une tache ronde sombre qui diffère de la pigmentation de la peau normale. Si le tatouage ne est pas sombre ou assez grand pour le visionnement facile, répétez les étapes de tatouage antérieures.

2. Les souris nouveau-nés génotypage utilisant un kit de génotypage PCR rapide

  1. Désinfecter l'extrémité distale d'une queue de souris avec 70% d'éthanol, couper 5 mm ou moins de la queueincliner et de le transférer dans un tube d'une bande de 8 tubes du type utilisé pour la PCR. Utilisez une lame de rasoir de non-utilisé pour chaque chiot à éviter la contamination croisée entre les spécimens. Sinon, utilisez une paire de ciseaux, mais dans ce cas, avec soin et enlever complètement le tissu restant sur les lames en utilisant 70% d'éthanol. Vérifiez saignement. En cas de saignement, appliquer une pression sur la partie de coupe de la queue avec une éponge de gaze jusqu'à ce saignement se est arrêté.
  2. Ajouter 200 pi de solution d'extraction de l'ADN à chaque tube PCR contenant un spécimen. Voir la Table des Matières / Equipement pour sa composition et des informations sur le kit.
  3. Placer la bande tubulaire dans un cycleur thermique de PCR, et démarrer l'extraction d'ADN en utilisant le programme suivant: 1 cycle à 55 ° C pendant 10 min, 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, et maintien à 4 ° C.
    NOTE: Ce est le même cycleur thermique PCR qui est ensuite utilisé pour la PCR.
  4. Après l'extraction d'ADN est terminée, retirez la bande de tube de l'un cycleur thermiquee inverser 5 fois.
  5. Transfert 4 pi de la solution (extrait d'ADN) de chaque échantillon à un non utilisés tubes d'une bande 8 tube, et mélanger avec: 10 pi de 2X PCR Ready Mix II, 2 pi de mélange de l'avant et marche arrière amorces (recommandé au 0,5 uM; voir le tableau des matériaux / équipement pour les séquences), et 4 pi de sans nucléase H 2 O, pour chaque spécimen. Centrifuger brièvement (par exemple, 3 sec) à l'aide d'une centrifugeuse de table. Gardez les tubes sur la glace en tout temps, sauf lors de la manipulation.
  6. Effectuer le cyclage thermique. Voir Table des Matières / Equipement pour le programme thermique.
  7. Détecter les produits d'ADN amplifiés. Charger la solution de réaction totale de la PCR (20 ul) directement dans un puits de gel d'agarose. Charger les marqueurs de poids moléculaire dans un puits séparé. Appliquer un champ électrique.
  8. Acquérir les images de fluorescence des bandes sous une lumière ultraviolette.

3. Culture primaire de cerveau de souris Neurons sur gliales Feeder couche

REMARQUE: Les procédures de dissection du cerveau et de la dissociation de la cellule (3,1) sont communs à toutes les procédures ultérieures. Les procédures de cultures gliales de la souris (3,2), cultures de cellules gliales de rat (3,3), et des cultures de neurones de souris (3,4) sont décrits séparément par la suite.

  1. Dissection du cerveau et cellulaire Dissocaiation
    1. Sacrifiez une souris ou rat chiot par décapitation, retirez rapidement le cerveau, et le placer dans une solution de Hanks (voir le tableau 1 pour la composition) + 20% de sérum de veau fœtal (FBS) dans une boîte de 35 mm (conservé dans la glace).
    2. Couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères. Retirer la région d'intérêt (par exemple, le cortex cérébral, le striatum et hippocampe) de chaque hémisphère de cerveau. Retirez les méninges et les principaux vaisseaux sanguins de la surface. Couper la région du cerveau en 4-10 fines tranches à l'aide d'une lame chirurgicale.
    3. Rincer les tranches de cerveau dans un tube à centrifugation de 15 ml, une fois espritLa solution de + 20% de FBS, puis 3 fois avec de l'Hanks h la solution de Hanks (ie sans sérum) (le tout à 4 ° C). Pour rincer, ajouter 5-10 ml de solution, laisser le cerveau tranches se déposent au fond du tube, aspirer la solution par le haut, et ajouter une solution fraîche. Terminez la procédure de rinçage par aspiration de la solution.
    4. Filtre à 2 ml de la solution de digestion contenant de la trypsine (voir le tableau 1 pour la composition) en utilisant une seringue de 3 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement dans le tube contenant les tranches de cerveau. Laissez le trypsinisation dérouler pendant 13 min à température ambiante.
    5. Neutraliser la solution de trypsine première par aspiration la plus grande partie, puis en ajoutant 7 à 10 ml d'une solution de Hanks + 20% de FBS (4 ° C).
    6. Rincer les tranches de cerveau, deux fois avec une solution de Hanks + 20% de FBS, puis trois fois avec la solution de Hanks (sans sérum) (le tout à 4 ° C). Terminez la procédure de rinçage par l'aspiration du solution.
    7. Filtre à 2 ml de la solution de dissociation (voir le tableau 1 pour la composition) en utilisant une seringue de 3 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement dans le tube avec les tranches de cerveau.
    8. Mécaniquement dissocier les cellules par trituration doucement 10-20 fois, jusqu'à ce que les morceaux de tissu visibles disparaissent. Utilisez une pipette Pasteur polie au feu coton branché et éviter de faire des bulles lors de la trituration.
    9. Attendre 3 min pour les petites pièces se installer.
    10. Transférer la majorité de la solution (~ 1,5 ml, ce qui laisse une solution en bas) à un tube de 15 ml de centrifugation qui contient 3 ml de solution de Hanks solution de FBS + 20% (4 ° C), en utilisant le coton branché, au feu polie pipette Pasteur. Ne pas transférer toute la solution parce que l'inclusion de tout sédiment au fond se traduit généralement par la détérioration de la culture.
    11. Centrifugeuse pour 13 min à ~ 185 g (~ 1100 rpm) à 4 ° C.
    12. Aspirer délicatement le surnageant,ajouter 1 ml de pré-chauffé milieu d'étalement (37 ° C) de la pastille, et remettre en suspension en pipetant doucement plusieurs fois en utilisant le coton branché, polie au feu pipette Pasteur.
      REMARQUE: Trois types de milieux d'étalement différents sont utilisés à différentes fins de culture: placage moyen 1 pour les cellules gliales de la souris, le placage moyen 2 pour les neurones de souris, et le placage à moyen 3 de neurones de rat et de cellules gliales (voir le tableau 1 pour des compositions) .
    13. Sortez 10 ul de la suspension cellulaire, mélanger avec 10 pi de solution de bleu de trypan 0,4%, et de mesurer la densité de cellules vivantes, en utilisant soit un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé.
  2. Cultures souris gliales
    1. Laver les lamelles pour aider à établir des cultures saines de cellules de souris.
      1. Plonger des lamelles de verre (rond, diamètre 12 mm) dans de l'acide nitrique à 70% dans une boîte de Pétri en verre. Protéger de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium, et le placer sur une orbitale agitateur O / N.
      2. Rincer le coversli de verreps dans la boîte de Pétri au moins trois fois à l'eau distillée. Plongez-les dans de l'eau distillée. Placer le plat sur un agitateur orbital O / N.
      3. Sécher les lamelles sur un papier filtre Whatman 150 mm dans le cabinet de sécurité biologique.
      4. Autoclave les lamelles.
      5. Placez les lamelles dans 24 puits boîte de culture.
    2. Souriceaux nouveau-nés d'étiquettes et de génotype selon les étapes 1 et 2.
    3. Obtenir les cellules du cerveau des souriceaux, selon l'étape 3.1.
      REMARQUE: L'utilisation du cortex cérébral est typique pour préparer la couche souris gliale d'alimentation. Toutefois, d'autres régions du cerveau, telles que l'hippocampe et le striatum, travailleront après ajustement approprié de la densité cellulaire en raison de différents nombres et les rendements des cellules provenant de différentes régions.
    4. Ajouter ~ 4 ml de pré-chauffé placage moyen 1 de la suspension cellulaire finale (~ 1 ml). Pour pré-réchauffement des milieux de culture, placer la solution dans l'incubateur de culture (5% de CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, àlaisser les valeurs de température et de pH se stabilise.
    5. Transférer la suspension cellulaire à un flacon de culture T25 non couché, en utilisant le coton-branché, polie au feu pipette Pasteur. Placer la fiole dans l'incubateur de culture.
    6. A un jour in vitro (DIV), rincer les cellules en culture dans le flacon T25 à deux reprises avec une moyenne de placage (4 ° C). Placer le ballon de nouveau dans l'incubateur. Effectuer rinçage par aspiration du milieu dans le flacon complètement avec une pipette Pasteur, en ajoutant environ 5 ml de milieu frais et en inclinant doucement le flacon plusieurs fois en un mouvement tourbillonnant.
    7. À 6-9 DIV, (ce est à dire, un jour avant la trypsine et le placage sur des lamelles, dans les étapes 3.2.8-3.2.13), placer 100 pi du matériau de revêtement avec des protéines de la matrice extracellulaire (voir le tableau des matériaux / équipement pour les commentaires sur le matériau de revêtement) sur les lamelles de verre dans une boîte de culture, et placer la boîte de culture dans l'incubateur de culture.
    8. A 7-10 DIV, lorsque les cellules sont 20-40% de confluence (spatialement continue), Trypsiniser eux.
      1. Rincer la fiole une fois, tout en aspirant la solution dans le ballon et l'ajout de ~ 13 ml d'une solution de Hanks (4 ° C), incliner doucement le flacon plusieurs fois en un mouvement tourbillonnant, et aspirer la solution totalement.
      2. Ajouter 40 ul de solution de DNase (concentration finale de 750 unités / ml) à 4 ml de solution de trypsine-EDTA, passer la solution à travers un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement aux cellules dans le flacon.
      3. Laissez le trypsinisation procéder pour 13 min à 37 ° C dans l'incubateur.
      4. Neutraliser la solution de trypsine par addition de 2 ml de 100% de FBS (4 ° C) dans le ballon.
      5. Transférer les cellules trypsinisées dans un tube de 15 ml par centrifugation en utilisant un cycle de 5 à 10 ml pipette, ajouter ~ 4 ml d'une solution de Hanks + 20% FBS (4 ° C), centrifuger à ~ 185 g et 4 ° C pendant 13 min et aspirer le surnageant.
    9. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de la pré-warmeune moyenne d placage.
    10. Mesure de la densité des cellules selon l'étape 03.01.13.
    11. Aspirer le matériau de revêtement complètement des lamelles de verre et la plaque ~ 50 ul des cellules gliales remises en suspension sur des lamelles.
      NOTE: Ces cellules vont établir la couche d'alimentation gliale.
    12. Placer la boîte de culture avec des lamelles dans l'incubateur.
    13. 20-60 min plus tard, ajouter 1 ml de pré-chauffé placage moyen 1 dans chaque puits, et placez le plat dans l'incubateur. Remarque: Bien que le moyen de plaquage est ajouté, il sera utile d'utiliser une autre pipette à appuyer sur la périphérie de la lamelle (où il n'y a pas de cellules étalées), de sorte que la lamelle couvre-objet ne sera pas flotter dans le milieu.
    14. A une DIV de la couche d'alimentation gliale (par exemple, sur la lamelle de verre), remplacer le milieu par 1 ml de pré-chauffé placage moyen 1, en ​​aspirant la totalité de la solution dans un puits et en remplissant ensuite avec du milieu frais.
    15. À 2-3 DIV de la couche d'alimentation gliale lorsque le cells sont de 80 à 100% de confluence, ajouter un inhibiteur mitotique (10 ul d'un mélange de 5-fluoro-2'-désoxyuridine + uridine; des concentrations finales de 81,2 et 204,8 uM, respectivement) dans chaque puits, pour inhiber la replication de l'ADN et donc à supprimer la prolifération cellules gliales.
    16. A 9.7 DIV, lorsque les cellules sont confluentes à 90 à 100% (2/1 h avant l'étalement des neurones sur la couche d'alimentation des cellules gliales), remplacer le milieu de culture préchauffé avec placage moyen-2 (37 ° C).
      REMARQUE: Les neurones sont étalées sur le même jour, en utilisant l'étape 3.4.
  3. Cultures Rat gliales
    1. Manteau de un flacon de culture T25 avec le même matériau de revêtement.
      NOTE: Ceci est nécessaire pour le retrait ultérieur de cellules non-adhérentes à l'étape 3.3.5.
      1. Ajouter 2,0 ml de la matière de revêtement dans le ballon, et placer le ballon dans un incubateur de culture.
      2. Après 3/2 heure, aspirer le matériau de revêtement complètement, de telle sorte que la surface du ballon devient sec.
    2. Obtenir les cellulesdes ratons, selon l'étape 3.1.
      REMARQUE: La région CA3-CA1 de l'hippocampe est utilisé pour préparer la couche d'alimentation gliales de rat. Toutefois, d'autres régions du cerveau, comme le cortex cérébral et le striatum, travailleront après ajustement des différences de densité cellulaire due à différents numéros et les rendements des cellules provenant de différentes régions.
    3. Ajouter ~ 4 ml de pré-chauffé placage à moyen 3 de la suspension cellulaire finale (~ 1 ml).
    4. Transférer la suspension cellulaire dans le flacon de culture T25 revêtu, à l'aide de coton-branché, polie au feu pipette Pasteur. Placer la fiole dans un incubateur de culture (5% de CO 2 95% de O 2, 37 ° C).
    5. À 2-3 DIV, lorsque les cellules sont 20 à 40% de confluence, retirez non adhérente ou faiblement cellules adhérentes, en fermant le couvercle bien en agitant vigoureusement ~ 10 fois, aspiration de la solution, et en ajoutant 4-5 ml de plaquage moyen 3 (à 4 ° C). Répétez cette procédure une fois. Examiner les cellules cultivées à travers tout l'étage du flacon (par exemple,en utilisant un microscope à contraste de phase) pour confirmer que ceux qui apparaissent neuronale (par exemple, ceux pour lesquels le bord extérieur du corps de la cellule apparaît phase claire) sont complètement enlevés. Répétez la procédure aussi souvent que nécessaire pour supprimer ces cellules, puis retourner le ballon à l'incubateur.
      NOTE: La force et le nombre total de «shakes» requises peuvent différer entre les expérimentateurs individuels. La chose importante est de ne pas garder le nombre total de shakes à un numéro de série, mais pour confirmer que les cellules analogues à des neurones sont éliminés.
    6. À 6-8 DIV, lorsque les cellules sont de 90 à 100% de confluence, les passage des cellules gliales en les trypsinisation comme à l'étape 3.2.8.
    7. Après centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), ajouter 10 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), transférer les cellules trypsinisées dans un flacon T75 non revêtu, et la culture eux l'incubateur.
      REMARQUE: les cellules gliales de rat seront repiquées deux fois; En revanche, les cellules gliales de la souris are des passages qu'une seule fois, car ils deviennent insalubres après de multiples passages. Les cellules gliales de rat seront soumises à des passages dans des flacons T75 qui ne sont pas revêtues avec ne importe quel matériau de revêtement. Le revêtement permet aux cellules gliales de rat de grandir trop vite et donnent de nombreuses cellules ciliées (cellules épendymaires putatifs), qui se détérioreront la condition de culture neuronale plus tard.
    8. À 17-19 DIV de culture dans un flacon gliale (par exemple, 11 jours après repiquage, et un jour avant traitement à la trypsine et placage sur des lamelles par étapes 3.3.9-3.3.14), placer 100 ul de la matière de revêtement sur ​​des lamelles de verre non lavés ( rond, diamètre 12 mm) dans une boîte de culture, et de placer la boîte de culture dans l'incubateur de culture.
      NOTE: Pour les cultures gliales de rat, une différence n'a pas été remarqué dans les résultats de la culture avec ou sans se laver les lamelles.
    9. À 18-20 DIV de culture dans un flacon gliale (par exemple, 12 jours après repiquage), préparer la couche d'alimentation gliale par trypsinisation des cellules en culture, selon la rep 3.2.8.
    10. Pendant la centrifugation, aspirer le matériau de revêtement complètement des lamelles de verre.
    11. Après centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), et mesurer la densité de cellules, selon l'étape 03.01.13.
    12. Ajuster la densité des cellules gliales à 10 4 cellules / ml en direct, et la plaque 100 pl de la suspension de cellules gliales sur les lamelles de verre revêtues.
      NOTE: Ces cellules vont établir la couche d'alimentation gliale.
    13. Placez la boîte de culture avec des lamelles dans l'incubateur pour les 20-60 min.
    14. Ajouter 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C) dans chaque puits, et placez le plat dans l'incubateur.
    15. A 4.3 DIV de la couche d'alimentation gliale, lorsque les cellules sur la lamelle sont de 40 à 80% de confluence, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (voir le tableau 1 pour la composition) qui contient la cytosine β-D-arabinofuranoside ( AraC, concentration finale de 4 pM) pour arrêter la prolifération des cellules gliales. Plate neurones à 9.7 DIV de la couche d'alimentation lorsque les cellules gliales sont 60 à 80% de confluence, en utilisant l'étape 3.4.
  4. Cultures souris neuronaux
    1. Souriceaux nouveau-nés d'étiquettes et de génotype selon les étapes 1 et 2.
    2. Utilisez les souriceaux pour l'étape 3.1.
    3. Ajuster la densité de la suspension des cellules vivantes à 2,0 x 10 ~ 5 cellules / ml en utilisant préchauffé placage moyen 2 pour le placage sur les cellules gliales de la souris, ou à l'aide de placage moyen 3 pour le placage sur des cellules gliales de rat.
    4. Plaque les cellules sur la couche nourricière gliale, en ajoutant doucement la suspension de cellules dans le milieu de culture de chaque puits. Remarque: Le volume de la suspension cellulaire à ajouter est déterminée par le nombre cible de cellules dans un puits de culture. Par exemple, plaque de ~ 60 pi de suspension de cellules pour atteindre 12 000 cellules / puits.
    5. Notez qu'aucune modification de solutions sont nécessaires après que les neurones sont étalées. Soyez prudent pour éviter l'évaporation de la solution dans les puits au cours de la culture, en humidifiant l'intérieur of l'incubateur de culture.

Résultats

Comme exemple de l'application de ce protocole, des résultats représentatifs sont présentés pour l'étiquetage des souris par le tatouage, le génotypage fiable dans diverses conditions expérimentales, et l'établissement de cultures de neurones primaires sur des couches nourricières gliales.

Tatouage

Les nouveau-nés ont été marqués sur les coussinets en utilisant un système de tatouage ('nouveau-né' de la ...

Discussion

Le protocole présenté ici inclut des procédures pour le tatouage d'étiqueter / identifier les souris, pour le génotypage des souris de conseils de la queue, et pour la culture de neurones du cerveau de la souris à faible densité. Dans une série d'expériences utilisant 6-8 chiots, ces procédures exigent généralement ~ 0,5 h, ~ 4 h et ~ 2 heures, respectivement, à un total de 6-7 heures. Cela rend pratique pour une seule expérimentateur pour terminer toutes les procédures nécessaires à partir du m...

Déclarations de divulgation

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Remerciements

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

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