JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Zusammenfassung

Hochauflösende Analyse der Morphologie und Funktion von Säuger-Neuronen erfordert oft die Genotypisierung von Einzeltieren, gefolgt von der Analyse der Primärkulturen von Neuronen. Wir beschreiben eine Reihe von Verfahren für: Etikettieren neugeborenen Mäusen die genotypisiert werden, schnelle Genotypisierung und die Einrichtung mit niedriger Dichte Kulturen von Nervenzellen im Gehirn von diesen Mäusen. Einzelne Mäuse werden von Tätowierungen, die für langfristigen Identifikations dauerhaft in das Erwachsenenalter ermöglicht markiert. Genotypisierung von dem beschriebenen Protokoll ist schnell und effizient und ermöglicht eine automatisierte Extraktion von Nukleinsäure mit guter Zuverlässigkeit. Dies ist unter Umständen, wenn genügend Zeit für herkömmliche Genotypisierung nicht verfügbar ist, beispielsweise nützlich, in Mäusen, die aus Neugeborenen-Letalität leiden. Primären neuronalen Kulturen werden bei niedriger Dichte, die Abbildungsexperimente mit hoher räumlicher Auflösung ermöglicht erzeugt. Diese Kulturverfahren erfordert die Herstellung von glial-Feeder-Schichten vor dem neuronalen Plattierung. Die protocol ist in seiner Gesamtheit an einem Mausmodell für die Bewegungsstörung DYT1 Dystonie (& Dgr; E-Torsina Knock-in-Mäusen) aufgebracht und Neuronenkulturen werden von Hippocampus, Kortex und Striatum dieser Mäuse hergestellt. Dieses Protokoll kann auf Mäuse mit anderen genetischen Mutationen, um andere Tierarten angewendet werden, wie gut. Ferner können einzelne Komponenten des Protokolls isoliert Teilprojekte verwendet werden. Dabei dient dieses Protokoll haben breite Anwendungen, nicht nur in den Neurowissenschaften, aber auch in anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften.

Einleitung

Nagetiermodellen von genetischen Krankheiten als nützlich bei der Schaffung der physiologischen Funktionen von normalen Proteinen und Nukleinsäuren sowie die pathophysiologischen Folgen von Defekten in diesen erwiesen. Beispiele umfassen Mäuse für Proteine ​​in zelluläre Schlüsselfunktionen beteiligt defizient sowie Mausmodelle von Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit. Allerdings können bestimmte genetische Manipulationen an neonatale Letalität kurz oder ein paar Tage nach der Geburt führen. In diesen Fällen sind die primären Zellkulturen ein wichtiges Werkzeug, da lebende Zellen können aus den embryonalen oder neonatalen Welpen vor dem Tod erhalten werden, können sie für wenigstens einige Wochen in vitro gehalten werden, und während dieser Zeit frühe neuronale Entwicklung kann gefolgt werden biochemische, morphologische und funktionelle Experimente. Für die Primärkulturen, kann es vorteilhaft sein, die Nervenzellen bei niedriger Dichte Platte; dies macht es möglich, die einzelnen Zellkörper, Dendriten, Axonen und Nervenwellen termi visualisierennale mit hoher räumlicher Auflösung. Jedoch das Überleben und die Differenzierung von Neuronen bei niedriger Dichte erfordert typischerweise, dass sie auf einer glialen Feeder-Schicht plattiert sind, co-kultiviert mit Glia-Zellen in Abwesenheit von physikalischen Kontakt mit ihnen oder in einem Medium kultiviert, durch Glia 1 konditioniert.

Die Einrichtung von niedriger Dichte neuronalen Kulturen auf Gliazellen Feeder-Schichten kann abhängig von schnellen und zuverlässigen Genotypisierung voraus sein - innerhalb von ein paar Stunden im Gegensatz zu ein paar Tagen. Geschwindigkeit ist besonders wichtig, wenn das neuronale Genotyp muss derjenigen einer glialen Nährschicht vorher vorbereitet angepaßt werden. Als ein praktisches Beispiel kann es notwendig sein, zu entscheiden, welche backs dem Genotyp in Erzeugen Kulturen zu verwenden, um die Effizienz eines Experiments zu optimieren.

Hier zeigen wir die Arbeitsprotokoll, das für die schnelle, vereinfachte und zuverlässige Maus Genotypisierung in früheren Publikationen 2-6 verwendet wurde. Mäuseschwänzen undein im Handel erhältlicher Kit verwendet. Dieses Protokoll umfasst einstufigen Extraktion von Nukleinsäuren aus dem Gewebe und erfordert weder eine Nukleinsäure-Reinigungsschritt noch der Einsatz eines Aufhebungspuffer ("Stop-Lösung"). Die Zuverlässigkeit dieser Genotypisierungsverfahrens wird erreicht, indem die Ergebnisse einer Reihe von Tests, wenn Unterschiede in Bezug auf die Ausgangsmenge der Proben, dem Alter der Tiere und die Länge der PCR-Produkte eingebracht dargestellt. Dieses Kit bietet die Vorteile der automatischen Extraktion und Zuverlässigkeit.

Aus Gründen der als umfassende, ist die Verwendung von Tätowieren für langfristige Identifikations der genotypisiert Mäusen demonstriert. Tätowieren wird durch Anlegen Tätowierfarbe in die Dermis der Haut (unter der Epidermis) erreicht 7. Es wird ein Verfahren für die Tätowierung Fußballen von Neugeborenen oder 1 Tag alten Mäusen beschrieben, obwohl Tätowierungen kann auch auf andere Teile des Körpers, wie zum Beispiel Schwänze und Zehen angewendet werden, und animals aller Altersgruppen. Darüber hinaus werden Verfahren für die Beschichtung und das Kultivieren der Maus-Neuronen bei einer niedrigen Dichte nachgewiesen werden, basierend auf einer optimierten Herstellung von verschiedenen Arten von glial-Feeder-Schichten 2,8.

Wir verwenden einen genetischen Mausmodell des geerbten neurologische Erkrankung DYT1 Dystonie - eine autosomal-dominante Bewegungsstörung durch eine Mutation im Gen verursacht TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Das codierte Protein, Torsina, gehört zu den "ATPasen mit verschiedenen Zellaktivitäten verbunden" (AAA +) Proteinfamilie, deren Mitglieder in der Regel durchführen Chaperon-ähnliche Funktionen, Unterstützung bei: Proteinentfaltung, Protein-Komplex Demontage, Membrantransport und Vesikelfusion 10-13. Die Mutation führt zu einer in-frame-Deletion eines Codons, das für Glutaminsäure, und kann eine Manifestation der "early-onset generali isoliert Dystonie '14,15 führen. Jedoch ist die Pfadophysiological Mechanismen für diese Erkrankung verantwortlich bleiben weitgehend unverstanden. In einer Knock-in-Maus-Modell ist der mutierte Allel Tor1a tm2Wtd, im folgenden als Tor1a AE erwähnt. Heterozygote AE-Torsina knock-in Mäuse sind lebensfähig und genetisch imitieren menschlichen Patienten mit DYT1 Dystonie, während homozygote Knock-in Mäusen nach der Geburt sterben, 16,17, mit der Latenzzeit zu postnatalen Tod von genetischen Hintergrund 18 betroffen. Der frühe Tod von homozygoten Knockout-Mäusen erforderlich, daß sowohl die Genotypisierung von Tieren und die Einrichtung von neuronalen Kulturen schnell abgeschlossen. Als weiteres Beispiel für die Genotypisierung Tfap2a (Transkriptionsfaktor AP-2α, Aktivieren Enhancer bindendes Protein 2α) verwendet. Das durch dieses Gen kodierte Protein ist in der Regulierung mehrerer zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Differenzierung, Überleben und Apoptose 19 wichtig.

Protokoll

HINWEIS: Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Iowa zugelassen.

1. Langfristige Bezeichnung Mäuse Mit Tätowieren den Fußballen

  1. Immobilisieren eine Pfote mit der Pfote Pads (Fußsohle) mit Blick auf den Experimentator. Halten Sie die Pfote mit dem Daumen und dem Zeigefinger. Achten Sie darauf, die Pfote zu kneifen.
    HINWEIS: Stabil Immobilisierung ist darauf zu achten, dass die Tattoo-Pigment in die Dermis der Pfote Pads platziert und damit dauerhaft 7.
  2. Wischen Sie die Pfotenpolster mit 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm oder Tupfer.
  3. Bewerben Hautöl zu einem Wattestäbchen, und drücken Sie vorsichtig die Spitze gegen die Oberfläche der Pfote Pad mehrmals. Verwenden Sie nur eine kleine Menge von Hautöl; wenn sie in großen Mengen, es wird die Tätowierpigment vom Erreichen der Haut zu verhindern.
  4. Tauchen Sie die Spitzen der Tattoo-Nadeln in der Tätowierfarbe gerade vorzum Tätowieren. Verwenden Sie saubere, keimfreie und scharfe Tätowiernadeln, um die Schmerzen und die Möglichkeit einer Infektion zu verringern, und auch um die Tätowierung Effizienz zu steigern.
  5. Während die Pfotenpolster Oberfläche mit der Haut Öl bedeckt ist, drücken Sie die Tattoo-Nadelspitzen vertikal und leicht auf der Haut in der Mitte der Pfote Pad, und spritzen die Tinte mehrere Male. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Informationen über elektrische Tätowierung-System.
  6. Spray 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm, drücken Sie sie vorsichtig gegen die Pfote zu zusätzlichen Tätowierungspigmente auf der Hautoberfläche zu entfernen, und überprüfen Sie die Qualität der Tätowierung. Prüfen, ob die Mitte des Pfotenpolster hat einen dunklen, runden Fleck, die von der normalen Pigmentierung der Haut unterscheidet. Wenn das Tattoo nicht dunkel oder groß genug für die einfache Anzeige, wiederholen Sie die vorherigen Schritte Tätowieren.

2. Genotypisierung Neugeborene Mäuse mit einem schnellen PCR Genotypisierung Kit

  1. Desinfizieren des distalen Endes eines Maus Schwanz mit 70% Ethanol, schneiden 5 mm oder weniger der Schwanzkippen und sie auf einem Rohr aus einem 8er Streifen des Typs, für die PCR verwendet. Verwenden Sie eine unbenutzte Rasierklinge für jeden Welpen um eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu vermeiden. Alternativ dazu können eine Schere, aber in diesem Fall sorgfältig durch das verbleibende Gewebe an die Klingen unter Verwendung von 70% Ethanol. Prüfen Sie, ob Blutungen. Wenn die Blutung auf, Druck auf die ausgeschnittenen Bereich des Schwanzes mit einem Gaze-Schwamm, bis Blutung aufgehört hat.
  2. Fügen Sie 200 ul der DNA-Extraktionslösung zu jedem PCR-Röhrchen mit einer Probe. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für seine Zusammensetzung und Informationen über das Set.
  3. Das Röhrchen Streifen in einen PCR-Thermocycler und Beginn der DNA-Extraktion, mit dem folgenden Programm: 1 Zyklus bei 55 ° C für 10 min, 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 Minuten, und Halten bei 4 ° C.
    Anmerkung: Dies ist das gleiche PCR-Thermocycler, die später für die PCR verwendet.
  4. Nachdem die DNA-Extraktion beendet ist, entfernen Sie das Rohr Streifen aus dem Thermocycler einnd invertieren 5mal.
  5. Überweisung 4 ul der Lösung (DNA-Extrakt) jeder Probe auf einer unbenutzten Röhre eines 8-Röhrenstreifen und mischen mit: 10 ul 2X PCR Ready Mix II, 2 ul vorne und Reverse-Primer gemischt (bei empfohlen 0,5 uM, siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Sequenzen) und 4 ul Nuklease-freies H 2 O, für jede Probe. Spin kurz (zB 3 sec) mit einer Tischzentrifuge. Halten Sie das Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten außer bei der Handhabung.
  6. Führen Temperaturwechsel. Sehen Tabelle der Materialien / Ausrüstung für die thermische Programm.
  7. Detektieren die amplifizierte DNA-Produkte. Laden die gesamte Reaktionslösung aus der PCR (20 & mgr; l), die direkt in ein Bohrloch eines Agarosegels. Laden Sie die Molekulargewichtsmarker in eine separate gut. Anwenden eines elektrischen Feldes.
  8. Erwerben Fluoreszenzbilder der Banden unter UV-Licht.

3. Primär Kultur der Maus Gehirn Neurons auf Gliazellen Feeder Layer-

HINWEIS: Die Vorgehensweisen zum Gehirn Dissektion und Dissoziation Zelle (3,1) sind, die für alle nachfolgenden Verfahren. Die Verfahren für die Maus Gliakulturen (3.2), Ratte Gliakulturen (3.3) und eine Maus neuronalen Kulturen (3.4) werden separat danach beschrieben.

  1. Gehirn Dissection and Cellular Dissocaiation
    1. Opfere eine Maus oder Ratte Welpen durch Enthauptung, schnell zu entfernen, das Gehirn, und legen Sie sie in Hanks-Lösung (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung) + 20% fötalem Rinderserum (FBS) in einem 35-mm-Schale (auf Eis gehalten).
    2. Schneiden Sie das Gehirn durch die Mittellinie in zwei Hemisphären. Entfernen der Region von Interesse (zB Großhirnrinde, Striatum und Hippocampus) von jeder Hemisphäre des Gehirns. Entfernen Sie die Hirnhaut und großen Blutgefäßen von der Oberfläche. Schneiden Sie die Hirnregion, in 4-10 dünne Scheiben mit einem Skalpell.
    3. Spülen Sie die Hirnschnitten in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, einmal Witzh Hanks-Lösung + 20% FBS, dann 3-mal mit der Hanks-Lösung (dh ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Zu spülen, fügen Sie 5-10 ml Lösung, lassen Sie den Hirnschnitten am Boden des Röhrchens zu regeln, saugen die Lösung von oben, und fügen Sie eine frische Lösung. Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der Lösung.
    4. Filter 2 ml der Trypsin-haltigen Aufschlußlösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in die Röhrchen mit den Gehirnschnitten. Lassen Sie die Trypsinierung fahren Sie für 13 Minuten bei Raumtemperatur.
    5. Neutralisieren die Trypsinlösung zuerst durch Absaugen meiste davon und dann durch Zugabe von 7-10 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C).
    6. Spülen der Gehirnscheiben, zweimal mit Hanks-Lösung + 20% FBS, und dann dreimal mit der Hanks-Lösung (ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der solutIonen.
    7. Filter 2 ml der Dissoziationslösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in der Röhre mit den Gehirnschnitten.
    8. Mechanisch distanzieren die Zellen durch leichtes Verreiben 10-20 mal, bis sichtbare Gewebestücke verschwinden. Verwenden Sie ein Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette und vermeiden Sie Luftblasen beim Zerreiben.
    9. Warten Sie 3 min für Kleinteile, sich niederzulassen.
    10. Übertragen der Mehrzahl der Lösung (~ 1,5 ml, so dass einige Lösung an der Unterseite) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das 3 ml Hanks-Lösung + 20% FBS-Lösung (4 ° C) enthält, wobei die baumwollsteckt, Feuer- polierten Pasteurpipette. Die gesamte Lösung nicht übertragen, da die Aufnahme eines Sediment am Boden führt typischerweise zu einer Verschlechterung der Kultur.
    11. Zentrifuge für 13 Minuten bei ~ 185 g (~ 1100 rpm) bei 4 ° C.
    12. Saugen Sie den Überstand vorsichtig,1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium (37 ° C) zu dem Pellet und resuspendieren durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette.
      HINWEIS: Drei verschiedene Arten von Plattenmedien sind für verschiedene Kultur zwecke Plattierungsmedium-1 für Maus Gliazellen Plattierungsmedium-2 für Maus-Neuronen und Plattierungsmedium-3 Rattenneuronen und Gliazellen (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzungen) .
    13. Nehmen Sie 10 ul der Zellsuspension, mischen Sie es mit 10 ul 0,4% Trypanblau-Lösung, und messen die Dichte der lebenden Zellen, entweder mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers.
  2. Maus Gliakulturen
    1. Waschen Sie die Deckgläser, zur Schaffung gesunder Kulturen von Mauszellen.
      1. Tauchen Deckgläser (rund, Durchmesser 12 mm) in 70% iger Salpetersäure in einer Glaspetrischale. Vor Licht mit Aluminiumfolie, und legen Sie sie auf einem Rundschüttler O / N.
      2. Spülen Sie die Glas coverslips in der Petrischale mindestens dreimal mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie sie in destilliertem Wasser. Die Schale auf einem Orbitalschüttler O / N.
      3. Trocknen Sie die Deckgläser auf einem Whatman 150 mm Filterpapier in der biologischen Sicherheitsschrank.
      4. Autoklavieren Sie die Deckgläser.
      5. Legen Sie die Deckgläser in 24-Well-Kulturschale.
    2. Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2.
    3. Erhalten die Gehirnzellen der Maus Welpen gemäß Schritt 3.1.
      HINWEIS: Die Verwendung der Großhirnrinde ist typisch für die Vorbereitung der Maus Glia-Feeder-Schicht. Aber auch andere Gehirnregionen, wie Hippocampus und Striatum, wird nach dem Einstellen der Zelldichte aufgrund von unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten.
    4. Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-1 an die Zellsuspension (ca. 1 ml). Zum Vorwärmen Kulturmedien, legen Sie die Lösung in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, umermöglichen, dass die Temperatur und der pH-Wert zu stabilisieren.
    5. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein unbeschichtetes T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank.
    6. An 1 Tag in vitro (DIV), spülen Sie die kultivierten Zellen in der T25-Flasche zweimal mit Plattierungsmedium-1 (4 ° C). Stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator. Führen Spülen durch Ansaugen des Mediums in den Kolben vollständig mit einer Pasteur-Pipette, indem ~ 5 ml frisches Medium und leichtes Kippen der Kolben mehrmals in einer Wirbelbewegung.
    7. Bei 6-9 DIV, (dh einen Tag vor der Trypsinisierung und Plattieren auf Deckgläsern in Schritten 3.2.8-3.2.13), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials mit extrazellulären Matrixproteinen (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Kommentare das Beschichtungsmaterial) auf die Deckgläser in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank.
    8. Bei 7-10 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent (räumlich kontinuierlich), trypsinieren ihnen.
      1. Die Flasche einmal spülen, durch Ansaugen die gesamte Lösung im Kolben und Hinzufügen von ~ 13 ml Hanks-Lösung (4 ° C) vorsichtig den Kolben kippen mehrmals in einer Wirbelbewegung, und saugen Sie die Lösung vollständig.
      2. In 40 ul DNase-Lösung (Endkonzentration 750 Einheiten / ml) bis 4 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die heiße Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter, und fügen Sie das Filtrat direkt zu den Zellen in der Flasche.
      3. Lassen Sie die Trypsinisierung gehen für 13 min bei 37 ° C im Brutschrank.
      4. Neutralisierung der Trypsinlösung durch Zugabe von 2 ml 100% FBS (4 ° C) in den Kolben.
      5. Übertragen Sie die Zellen mit Trypsin in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit einem 5- bis 10-ml-Pipette ~ 4 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C), Zentrifuge bei ~ 185 g und 4 ° C für 13 min , und saugen Sie den Überstand.
    9. Das Pellet in 1 ml vorge warmed Plattierungsmedium-1.
    10. Messung der Dichte der Zellen entsprechend Schritt 3.1.13.
    11. Absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern, und Platten ~ 50 & mgr; l der resuspendierten Gliazellen auf Deckgläsern.
      HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen.
    12. Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator.
    13. 20-60 Minuten später, 1 ml vorgewärmtes Plattierungsmedium-1 in jede Vertiefung, und die Schale wieder in den Inkubator. Anmerkung: Während das Plattenmedium zugegeben wird, wird es hilfreich sein, eine andere Pipette zu verwenden, um nach unten drücken, der den Umfang des Deckplättchens (wo es keine plattierten Zellen), so daß das Deckglas nicht in dem Medium schwimmt.
    14. Bei 1 DIV der Glia-Feeder-Schicht (dh auf dem Deckglas), ersetzen Sie das Medium mit 1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium-1, durch Ansaugen die gesamte Lösung in einem gut und dann mit frischem Medium zu füllen.
    15. Bei 2-3 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die celLS 80-100% konfluent, fügen mitotischen Inhibitor (10 & mgr; l einer Mischung aus 5-Fluor-2'-deoxyuridin + Uridin; Endkonzentrationen von 81,2 und 204,8 & mgr; M) in jede Vertiefung, um die DNA-Replikation und somit zu hemmen drücken Glia-Zellen-Proliferation.
    16. 7-9 DIV, wenn die Zellen 90-100% konfluent (1-2 h vor dem Plattieren Neuronen auf der glial feeder layer) Ersetzen des Kulturmediums mit vorgewärmter Plattierungsmedium-2 (37 ° C).
      HINWEIS: Die Neuronen werden am selben Tag plattiert werden, unter Anwendung von Schritt 3.4.
  3. Rat Gliakulturen
    1. Coat eine T25 Kulturflasche mit dem gleichen Beschichtungsmaterial.
      Hinweis: Dies ist für die spätere Entfernung der nicht-adhärenten Zellen in Schritt 3.3.5 notwendig.
      1. 2,0 ml des Beschichtungsmaterials in den Kolben, und setzen Sie den Kolben in der Kulturbrutschrank.
      2. Nach 2-3 Stunden, saugen Sie den Beschichtungsmaterial vollständig, so dass der Boden der Flasche trocken wird.
    2. Besorgen Sie sich die Zellenaus den jungen Ratten, gemäß dem Schritt 3.1.
      HINWEIS: Die Region CA3-CA1 des Hippocampus wird zur Herstellung der Ratten glial Nährschicht verwendet. Aber auch andere Gehirnregionen, wie dem cerebralen Cortex und Striatum wird bereinigt um Unterschiede in der Zelldichte aufgrund der unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten.
    3. Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-3 zu der Zellsuspension (ca. 1 ml).
    4. Übertragen Sie die Zellsuspension in die beschichteten T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. Bei 2-3 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent waren, entfernen nicht adhärenten oder schwach haftenden Zellen, durch Schließen des Deckels dicht unter Schütteln heftig ~ 10 mal, Absaugen der Lösung und Zugabe von 4-5 ml des Überzuges Medium-3 (bei 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Untersuchen Sie die kultivierten Zellen über die gesamte Kolbenboden (zBVerwendung von Phasenkontrastmikroskop) zu bestätigen, dass die, die neuronale (dh solche, bei denen der äußere Rand des Zellenkörpers wird phasen hell dargestellt) vollständig entfernt werden. Wiederholen den Vorgang so oft wie nötig, um diese Zellen zu entfernen, und anschließend wurde der Kolben zurück in den Inkubator.
      HINWEIS: Die Festigkeit und die Gesamtzahl der "Shakes" erforderlich ist, kann zwischen den einzelnen Experimentatoren abweichen. Das Wichtigste ist, nicht auf die Gesamtzahl der Shakes auf eine festgelegte Anzahl zu halten, aber um zu bestätigen, dass die Neuronen-ähnliche Zellen eliminiert werden.
    6. Bei 6-8 DIV, wenn Zellen sind 90-100% konfluent, Durchgang die Gliazellen durch Trypsinierung sie wie in Schritt 3.2.8.
    7. Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), 10 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), übertragen die trypsiniert Zellen einem unbeschichteten T75-Kolben und Kultur sie Inkubator.
      HINWEIS: Ratte Gliazellen zweimal passagiert werden; im Gegensatz die Maus Gliazellen are agiert nur einmal, weil sie ungesund nach mehreren Durchgängen werden. Ratten-Gliazellen in T75-Flaschen, die nicht mit irgendeinem Überzugsmaterial überzogen werden passagiert werden. Die Beschichtung ermöglicht Ratte Gliazellen, zu schnell zu wachsen und liefern viele Geißelzellen (vermeintlichen Ependymzellen), die später die neuronale Kulturbedingungen verschlechtern wird.
    8. Bei 17 bis 19 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 11 Tage nach der Passage und einen Tag vor Trypsinierung und Ausplattieren auf Deckgläser durch Schritte 3.3.9-3.3.14), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials auf ungewaschenen Deckgläser ( rund, Durchmesser 12 mm) in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank.
      HINWEIS: Bei Ratten Gliakulturen eine Differenz nicht in den Kulturergebnisse mit oder ohne Waschen der Deck bemerkt.
    9. Bei 18-20 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 12 Tage nach Passagieren), bereiten Sie die Glia-Feeder-Schicht durch Trypsinisierung der kultivierten Zellen, nach step 3.2.8.
    10. Während der Zentrifugation absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern.
    11. Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), und Messen der Zelldichte, gemäß Schritt 3.1.13.
    12. Stellen Sie den glial Dichte bis 10 4 lebenden Zellen / ml, und die Platte 100 ul des glialen Zellsuspension auf die beschichteten Glasplättchen.
      HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen.
    13. Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator für 20-60 min.
    14. 1 ml der Plattierungsmedium-3 (4 ° C) in jede Vertiefung und die Schale wieder in den Inkubator.
    15. Bei 3-4 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die Zellen auf dem Deckglas sind 40-80% konfluent, 1 ml der vorgewärmten Nährmedium (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung), die Cytosin-β-D-arabinofuranosid enthält ( AraC Endkonzentration von 4 & mgr; M) bis glial-Zellproliferation anzuhalten. Platte Neurons 7-9 DIV der glial-Feeder-Schicht, wenn die Zellen 60-80% konfluent waren, unter Anwendung von Schritt 3.4.
  4. Maus Neuronale Kulturen
    1. Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2.
    2. Verwenden Sie die Maus Welpen für Schritt 3.1.
    3. Einstellung der Intensität des Lebendzellsuspension auf ~ 2,0 × 10 5 Zellen / ml mit vorgewärmten Plattierungsmedium-2 für die Beschichtung auf der Maus Gliazellen oder Verwendung Plattierungsmedium-3 für die Plattierung auf Ratten-Gliazellen.
    4. Platte die Zellen auf der Glia-Feeder-Schicht, indem Sie vorsichtig Zugabe der Zellsuspension in das Kulturmedium von jedem gut. Hinweis: Das Volumen der Zellsuspension zugegeben werden durch die Zielzahl der Zellen in einer Kulturvertiefung bestimmt werden. Zum Beispiel Platte ~ 60 ul Zellsuspension zu 12.000 Zellen / Vertiefung zu erzielen.
    5. Beachten Sie, dass keine Lösung Änderungen sind erforderlich, nachdem die Neuronen überzogen. Seien Sie vorsichtig, um die Verdampfung der Lösung aus den Vertiefungen vermeiden, im Laufe der Kultur, durch Befeuchten des Inneren of der Kulturbrutschrank.

Ergebnisse

Als ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls, sind repräsentative Ergebnisse für die Markierung von Mäusen durch Tätowierungen, zuverlässig Genotypisierung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und mit primären neuronalen Kulturen glial-Feeder-Schichten gezeigt.

Tätowierung

Neugeborene Welpen wurden auf den Fußballen mit einem Tätowierung-System ("Newborn" in Abbildung 1) gekennzeichnet. Die ...

Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll enthält Verfahren für die Tätowierung zur Kennzeichnung / Identifizierung Mäusen, zur Genotypisierung Mäuse aus Schwanzspitzen und zur Kultivierung von Maus Gehirnneuronen bei geringer Dichte. In einer Runde von Experimenten mit 6-8 Welpen, diese Verfahren benötigen in der Regel ~ 0,5 Stunden, ca. 4 h und ca. 2 h zugeführt, an insgesamt 6-7 Stunden. Dies macht es praktisch für eine einzige Versuchsleiter, alle aus der Zeit der Jungtiere "die Geburtsstunde der Beschichtung von...

Offenlegungen

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Danksagungen

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

Referenzen

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. , 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M., Banker, G., Goslin, K. . Ch. 18. Culturing Nerve Cells. , 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

NeuroscienceAusgabe 95AP2GenotypisierungGlia Feeder SchichtMaus Schwanzneuronale KulturNukleins ure ExtraktionPCRT towierungTorsina

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten