JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم في المختبر الماوس الجنين نظام الثقافة أرومة الحمراء الكبد أن يشرح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. هذا النظام يسهل التحليل الوظيفي للجينات محددة في مراحل النمو المختلفة.

Abstract

ينطوي الكريات الحمر عملية ديناميكية التي تبدأ مع وحدات ملتزمة محمر انفجار تشكيل (الاتحاد البلغاري في Es-)، يليه تقسيم بسرعة محمر مستعمرة (كفو-الخانات). بعد كفو-ES، الخلايا هي معترف بها شكليا ويسمى عموما الأرومة الحمراء الطرفية. واحدة من التحديات لدراسة الكريات الحمر المحطة هو عدم وجود مناهج تجريبية لتشريح وظائف الجينات بطريقة متسلسلة زمنيا. في هذا البروتوكول، ونحن تصف استراتيجية فريدة من نوعها لتحديد وظائف الجينات في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. في هذا النظام، وتنقيته الماوس TER119 كبد الجنين (محمر ناضجة خلية علامة) الأرومة الحمراء السلبية وtransduced مع التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة. ومثقف الخلايا بعد ذلك في عوامل النمو الأخرى من المتوسط ​​تحتوي الإريثروبويتين (EPO) للحفاظ على مرحلة السلف لمدة 12 ساعة بينما يسمح للcDNAs الخارجية أو shRNAsللتعبير. تم تغيير الخلايا لإبو المتوسطة بعد 12 ساعة للحث على تمايز الخلايا وانتشارها في حين أعرب عن المواد الوراثية خارجية بالفعل. هذا البروتوكول يسهل تحليل وظائف الجينات في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة. لدراسة المرحلة المتأخرة محطة الكريات الحمر، تم زرعها في خلايا فورا إبو المتوسطة بعد ترنسدوكأيشن. وبهذه الطريقة، كانت خلايا متباينة بالفعل إلى مرحلة متأخرة من الكريات الحمر عند محطة وأعرب عن المواد الوراثية transduced. نوصي التطبيق العام لهذه الاستراتيجية التي من شأنها أن تساعد على فهم وظائف الجينات مفصلة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.

Introduction

الكريات الحمر هي عملية تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات لتنضج كرات الدم الحمراء. وتشمل هذه العملية تدريجية تشكيل وحدات تشكيل ملتزمة محمر انفجار (الاتحاد البلغاري-ES) وعلى سرعة تقسيم الوحدات محمر تشكيل مستعمرة (كفو-ES) وشكليا والأرومة الحمراء التعرف 1،2. الكريات الحمر محطة من الخلايا الاولية كفو-E-إرثروبويتين ينطوي متتابعة تعتمد ومراحل مستقلة 2،3. في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة، هرمون الإيريثروبويتين تربط لمستقبلات على سطح الخلية ويدفع سلسلة من مسارات إشارات المصب التي تمنع موت الخلايا المبرمج الخلية وتعزيز الانقسامات الخلوية السريعة والتعبير الجيني 1،4. في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر المحطة، الأرومة الحمراء الخضوع دورة الخلية الطرفية الخروج، لونين والتكثيف النواة، وقذف نوى مكثف للغاية 5.

فهمنا للمحطةالكريات الحمر قد تحسنت كثيرا في العقود القليلة الماضية، والتي هي إلى حد كبير بسبب نجاح استخدام عدة في المختبر وفي الجسم الحي نماذج الماوس 6-9. من بين هذه النماذج، في الثقافة المختبر من الماوس الجنين الأرومة الحمراء الكبد يوفر العديد من المزايا بما في ذلك سهولة تنقية الخلايا، والانتشار السريع والتمايز، وأقرب إلى تقليد الكريات الحمر البشري 10،11. في هذا النظام، وأعداد كبيرة من الخلايا محمر السلف من الماوس كبد الجنين يمكن عزلها بسهولة عن طريق تنقية خطوة واحدة من TER119 (علامة للخلايا ناضجة محمر) الأرومة الحمراء السلبية. خلال ثقافة لمدة يومين من الأرومة الحمراء، والتفريق بين هذه الخلايا يمكن رصدها من خلال تحليل تدفق cytometric على أساس التعبير سطح مستقبلات ترانسفيرين (CD71) والمستضد TER119 12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن قلع من الأرومة الحمراء عضال التمايز بواسطة صانع الحمض النووي (هويشت 33342) 13. وعلاوة على ذلك، فإن الأسلاف المنقى يمكن تعديلها وراثيا عن طريق التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة، مما يسهل الدراسات الميكانيكية للمهام التعبير الجيني في الكريات الحمر 11،13،14.

من ناحية أخرى، يمكن أن معدل نمو الخلايا سريع يكون سيفا ذا حدين لأنه من الصعب لتوصيف وظائف الجينات في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة. في معظم الحالات، فإنه من الصعب تحديد ما إذا كان الجين وظائف محددة في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة منذ بحلول الوقت أعرب عن cDNAs أو shRNAs، الخلايا مرت بالفعل في مرحلة مبكرة. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير نظام فريد لتشريح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. للمرحلة الأولى من محطة الكريات الحمر، وكانت معدلة وراثيا TER119 الأرومة الحمراء السلبية مثقف في المتوسط ​​مجانا إبو ولكن تحتوي على الخلايا الجذعية عامل (SCF)، IL-6 و FLT3يجند للحفاظ على حالة السلف وتسمح cDNAs transduced أو shRNA التعبير 13. تم تغيير الخلايا لإبو تحتوي على المتوسط ​​بعد 12 ساعة للحث على تكاثر الخلايا والتمايز. في هذه الطريقة، عندما بدأت خلايا للتمييز، وأعرب بالفعل cDNAs transduced أو shRNAs. لمرحلة متأخرة من الكريات الحمر محطة، كانت TER119 الأرومة الحمراء السلبية المستزرعة في إبو تحتوي على المتوسط ​​مباشرة بعد ترنسدوكأيشن. وبالتالي، يمكن للمرء أن تحليل وظائف الجينات من الاهتمام في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر المحطة. وباختصار، فإن التطبيق الواسع لهذا النظام يساعد على وظائف الجينات تشريح في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.

Protocol

وأجريت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة نورث وسترن المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. إعداد متوسط ​​الثقافة

  1. إعداد الحل فبرونيكتين. إضافة 1 مل من الماء إلى قارورة واحدة من فبرونيكتين الإنسان (1 ملغ). ترك حل في غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 30 دقيقة دون الانفعالات. نقل السائل الإجمالي إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني لجعل تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل وتخلط جيدا بلطف. جعل الحل فبرونيكتين جديدة قبل طلاء لوحة (انظر أدناه).
  2. تحضير 50 ​​مل من إبو المتوسطة مجانا (SCF المتوسطة). الجمع بين العناصر المدرجة في الجدول 1. يمكن تخزين المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر عندما قام الطازجة.
  3. تحضير 50 ​​مل من إبو تحتوي على المتوسط. الجمع بين العناصر المدرجة في الجدول 2. ويمكن تخزين المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر عندما قام الطازجة.

    4. 2. فيبرونكتين] لوحة المغلفة

    1. إضافة 1 مل من محلول فبرونيكتين إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا (أو 0.5 مل لكل بئر من 12 لوحة جيدا). ترك لوحة في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة لمدة 1 ساعة.
    2. شطف الآبار مع الماء المعقم مرتين والهواء الجاف لوحة.
    3. التفاف لوحة وحفظ في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.

    3. تنقية الكبد الجنين الأرومة الحمراء

    ملاحظة: استخدام كبد الجنين من E13 إلى E15 انتهت مهلة الفئران الحوامل (C57BL / 6). ويفضل كبد E13.5 لتعظيم العائد من الأسلاف كفو-E. للحصول على الفئران الحوامل في الوقت المناسب، وضعت 6 إلى 8 أسابيع من العمر من الذكور وإناث الفئران في قفص واحد (عادة الذكور واحد مع واحد أو اثنين من الإناث). تم فحص المقابس المهبل الإناث في صباح اليوم التالي لتحديد ما إذا كان التزاوج الناجح. كان اليوم الأول من الحمل في اليوم التالي تم العثور على المكونات.

    1. إعداد خلايا الكبد إجمالي الجنين
      1. التضحية مذكرة التفاهمSE بنسبة CO 2 الاستنشاق وخلع عنق الرحم. رش البطن مع الايثانول 70٪ لتطهير. فتح البطن مع تشريح المقص لإزالة الرحم. غسل الرحم في برنامج تلفزيوني 1X.
      2. تشريح الأجنة تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء زراعة الأنسجة وأدوات تعقيمها ويغسل في برنامج تلفزيوني 1X.
      3. تشريح كبد الجنين من الأجنة. عقد جسم الجنين مع واحد ملقط، برفق الكبد الجنين (وردي اللون) بعيدا عن الجسم مع ملقط آخر. تنظيف الكبد الجنين مع ملقط لإزالة الأنسجة متليف المرتبطة بها. وضع كل كبد الجنين في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني.
      4. تعطيل كبد الجنين ميكانيكيا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
      5. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر إلى 50 مل أنبوب مخروطي. بيليه الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق.
      6. نضح وطاف resuspend الخلايا في 1 مل PBS مع 10٪ FBS (حوالي 8 E13.5 كبد الجنينلكل مل).
    2. تنقية TER119 الأرومة الحمراء سلبي
      1. منع الخلايا مع مفتش الفئران (0.2 ملغ / مل) على الجليد لمدة 15 دقيقة.
      2. دون غسل أو الطرد المركزي، إضافة المعقدة البيروكسيديز المضادة للTER119 الأجسام المضادة لتعليق خلية (1 ميكروغرام / مل). احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
      3. يغسل في برنامج تلفزيوني 1X مع 10٪ FBS (1:10) وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 10٪ FBS.
      4. إضافة 75 ميكرولتر streptavidin مترافق مع الجزيئات المغناطيسية واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
      5. إضافة الحجم إلى 2.5 مل مع PBS تحتوي على 10٪ FBS. نقل تعليق الخلية إلى 5 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع.
      6. يتم ادخال الانبوب في جهاز الفرز المغناطيسي خلية واحتضان لمدة 10 دقيقة. خلايا إيجابية TER119 سوف نعلق على جانب الأنبوب. ستبقى الأرومة الحمراء السلبية TER119 غير مرتبط في التعليق.
      7. صب تعليق خلية في جديد 5 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع.
      8. كرر الخطوات من 3.2.6 و 3.2.7 لإزالة الخلايا إيجابية TER119 المتبقية.
      9. بيليه الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق. نضح قبالة طاف. resuspend الخلايا في 1 مل PBS تحتوي على 10٪ FBS والعد الخلايا الحية مع التريبان الأزرق.

    4. تنبيغ مع الفيروسات ترميز [كدنا] أو shRNA

    1. لوحة خلايا الكبد الجنين السلبية TER119 تنقيته في 3-5 × 10 5 / بئر في فبرونيكتين المغلفة لوحة 12 جيدا (ضبط عدد الخلايا في حالة استخدام لوحة مختلفة).
    2. إضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل لتسهيل تنبيغ الفيروسية. تدور تصيب الخلايا مع lentiviruses أو الفيروسات القهقرية، [كدنا] ترميز أو shRNA، في 800 x ج لمدة 1-1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.

    5. الثقافة في Transduced TER119 ماوس سلبي الجنين الكبد الأرومة الحمراء

    1. لاختبار وظائف الجينات في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر محطة (الشكل 1 الخطوط المتقطعة).">
      1. ثقافة الخلايا transduced في إبو المتوسطة مجانا (SCF المتوسطة) لمدة 12 ساعة للسماح للتعبير عن الجينات وصيانة الدولة السلف transduced.
      2. الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف. resuspend الخلايا في 1 مل تحتوي على إبو المتوسطة في كل بئر من 12 لوحة جيدا.
      3. بعد ثقافة لمدة 24 أو 48 ساعة، حصاد الخلايا لمزيد من المقايسات.
    2. اختبار وظائف الجينات في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر محطة (الشكل 1 خطوط الصلبة).
      1. ثقافة الخلايا transduced فورا في إبو تحتوي على المتوسط.
      2. بعد ثقافة لمدة 24 أو 48 ساعة، حصاد الخلايا لفحوصات أخرى.

    6. تلون خلايا الكبد مثقف الجنين لتحليل تدفق Cytometric

    1. غسل وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. الحصاد 2 ​​× 10 5 الخلايا المستزرعة لتحليل تدفق cytometric.
    2. احتضانالخلايا مع الأجسام المضادة مترافق fluorophore لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لاختبار التمايز، استخدم APC مترافق مكافحة CD71 وPE مترافق مكافحة TER119. لاختبار استئصال، استخدم هويشت 33342 صمة عار بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأخرى.
    3. غسل الخلايا مع 1X PBS. resuspend الخلايا في 0.5 مل PBS تحتوي على 1٪ FBS ويوديد propidium (PI) (1 ميكروغرام / مل) وصمة عار على الخلايا الميتة واستبعادها من التحليل.
    4. تحليل سلوك تدفق cytrometric. تحليل اللون الملون وغير ملوثين خلايا تحكم واحد أولا لتعديل والتعويض من تدفق عداد الكريات.

النتائج

ويبين الشكل 1 الاستراتيجيات التجريبية. يتكون البروتوكول من شرطين مستقلة لاستهداف وظائف الجزيئات يشير في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. تم تنقيته TER119 السلبية الأرومة الحمراء الكبد الجنين من الماوس E13.5 الجنين. أظهر تحليل تدفق cytometric من خلا...

Discussion

هنا نقدم نظام فريد لتحليل زمنيا الماوس الجنين تكون الكريات الحمر محطة الكبد. من خلال تطبيق الشروط ثقافة مختلفة، ونحن تشريح بنجاح الكريات الحمر محطة في المراحل المبكرة والمتأخرة. هذا مهم بشكل خاص لتحديد آليات الجينات مع وظائف متعددة. على سبيل المثال، GTPases RAC تلعب أدوا?...

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00HL102154، والجمعية الأمريكية لأمراض الدم جائزة الباحث إلى P جي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)Gibco12440-053
Fetal bovine serum (FBS)GEMINI Bio-product700-102P
Penicillin-Streptomycin solutionHycloneSV30010100x
L-GlutamineHycloneSH30034.01200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)BD Biosciences 14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) GEMINI Bio-product300-327P
FibronectinBD Biosciences 354008
Bovine Serum Albumin (BSA)STEMCELL TECH930010% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)PROCRITNOC 59676-303-003,000 U/ml stock
Streptavidin particles PlusBD Pharmingen557812
EasySep MagnetSTEMCELL TECH18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 mlFALCON352063

References

  1. Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
  2. Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
  3. Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
  4. Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
  5. Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
  6. Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
  7. Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
  8. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
  9. Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
  10. Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
  11. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  12. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  13. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
  14. Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
  15. Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
  16. Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
  17. Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved