Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek

Özet

Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.

Özet

Eritropoez hızla birimleri oluşturan eritroid koloni (CFU-Es) bölünmesiyle ardından taahhüt eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es) ile başlayan dinamik bir süreç gerektirir. CFU-Es sonra hücreler morfolojik olarak algılanabilen ve genelde bağlantı eritroblastlarda olarak adlandırılır. Terminal eritropoezin çalışma için zorluklardan biri kronolojik bir şekilde gen fonksiyonlarını incelemek için deneysel yaklaşımların olmaması. Bu protokol, biz terminali eritropoezin erken ve geç evrelerinde gen fonksiyonlarını belirlemek için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Bu sistemde, bir fare fetal karaciğer Ter119 (olgun eritroid hücre işaretleme maddesi) negatif Eritroblastlar saflaştırılmış ve cDNA veya ilgi duyulan genler için küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile transduse. Hücreler, bundan sonra, eksojen cDNA veya shRNAs izin verirken 12 saat boyunca da projenitör sahne korumak Eritropoietin (EPO) dışındaki ortam ihtiva eden büyüme faktörleri kültürlendiifade etmek. Hücreler, egzojenez genetik malzeme, daha ifade edildi, hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ortamına değiştirildi. Bu protokol, terminal eritropoezin erken evre gen fonksiyonlarının analizini kolaylaştırır. Geç aşama terminali eritrosit oluşumunu çalışmak için, hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. Transduse genetik malzeme olarak ifade edilmiştir, bu durumda, hücreler daha önce, terminal eritropoezi geç dönem için farklılaştırılmıştır. Biz terminali eritropoezin farklı aşamalarında detaylı gen fonksiyonlarını anlamak yardımcı olacak bu stratejinin genel bir uygulama önerilir.

Giriş

Eritrosit oluşumu, eritrositler olgunlaşması için multipotent hematopoetik kök hücrelerin farklılaşması işlemidir. Bu kademeli işlem, ilgili eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es), hızla bölünen eritroid koloni oluşturan birimler (CFU-Es) ve morfolojik olarak algılanabilen birçok eritroblast ^1,2 oluşumunu kapsamaktadır. CFU-E projenitör hücrelerin Terminal eritropoezis sıralı eritropoietin bağımlı ve bağımsız aşamaları ^2,3 içerir. Terminal eritropoezi erken aşamasında, eritropoetin (EPO), hücre yüzeyi üzerinde kendi reseptörüne bağlanan ve hücre apoptozu önlemez ve hızlı hücre bölünmesi ve gen ekspresyonunu teşvik ^1,4 aşağı doğru sinyal yollarının bir dizi yol açar. Terminal eritropoezin geç evrede, Eritroblastlar derece yoğun çekirdeklerin ⁵ terminali hücre döngüsü çıkmak, kromatin ve çekirdek yoğunlaşmayı ve ekstrüzyon tabi.

Terminalin anlayışımızeritropoezis sayesinde büyük ölçüde in vitro birkaç başarılı kullanımı ve in vivo fare modellerinde ^6-9 büyük ölçüde son birkaç on yıl içinde artmıştır. Bu modeller arasında, fare, fetal karaciğer eritroblast vitro kültür içinde hücre arıtma için hızlı çoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere birçok avantaj kolaylığı sağlar ve insan erythropoiesis ^10,11 yakından taklit eder. Bu sistemde, fare fetal dokulardan eritroid progenitör hücrelerin çok sayıda kolay Ter119 tek aşamada arıtıldıktan (olgun eritroid hücreler için bir işaret) negatif eritroblast izole edilebilir. Eritroblast iki günlük kültür boyunca, bu, hücrelerin farklılaşması Transferin reseptörüne (CD71) ve Ter119 antijenin ¹² yüzey ifadesine dayalı akış sitometrik analizi ile izlenebilir. Buna ek olarak, terminal farklılaşma eritroblast enükleasyonu ¹ bir DNA makinesi (Hoechst 33342) tarafından tespit edilebilir3. Bundan başka, arıtılmış ataları genetik olarak cDNA veya erythropoiesis ^11,13,14 gen ekspresyonunun fonksiyonlarının mekanistik çalışmalar kolaylaştırır ve ilgilenilen genler için, küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile modifiye edilebilir.

Bu terminali eritropoezin farklı aşamalarında gen işlevleri tanımlamak zor olduğundan, diğer taraftan, hızlı hücre büyüme oranı iki ucu keskin kılıç olabilir. Çoğu durumda, bu cDNA'lar veya shRNAs ifade zaman terminalinde eritropoezi erken aşamasında belirli bir gen fonksiyonları, hücreler daha önce ilk aşamayı belirlemek zordur. Bu sorunu çözmek için, biz terminali eritropoezin erken ve geç evreleri incelemek için eşsiz bir sistem geliştirdi. Terminal eritropoezi erken bir aşaması için, genetik olarak tadil edilmiş Ter119 negatif Eritroblastlar EPO içermeyen ortam içeren ama kök hücre faktörü (SCF), IL-6 ve FLT3 kültürlendiligand kendi progenitör statüsünü korumak ve ifade ¹³ transdüse cDNA'lan veya shRNA izin vermek. Hücreler, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ihtiva eden ortam ile değiştirildi. Hücrelerin ayırt başladı Bu şekilde, transduse ya da cDNA'lar shRNAs daha önce ifade edildi. Terminal eritropoezi geç aşaması için, negatif Ter119 Eritroblastlar EPO transdüksiyon sonra hemen sıvı ihtiva eden kültürlenmiştir. Bu nedenle, bir terminal eritropoezi geç evrede, ilgi konusu genlerin fonksiyonlarının analiz edebilir. Özetle, bu sistemin geniş bir uygulama terminali eritropoezin farklı aşamalarında teşrih gen fonksiyonlarını yardımcı olacaktır.

Protokol

Bu protokol açıklanan deneyler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

Kültür ortamına hazırlanması 1.

1. Fibronektin çözeltisi hazırlayın. , Insan fibronestini (1 mg) ile bir şişe su 1 ml ilave edilir. Çalkalama olmaksızın 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu çözeltisi bırakın. 20 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona yapmak için PBS, 50 ml toplam sıvı transferi ve yavaşça karıştırın. Plakası (aşağıya bakınız) kaplamadan önce fibronektin çözelti taze olun.
2. Epo serbest ortamda (SCF orta) 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 1'de listelenen katkı maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
3. EPO ihtiva eden bir ortamda 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 2'de sıralanan terkip maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

2. Fibronektin Kaplı Plaka

1. 6 çukurlu bir levha (ya da 12 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 0.5 ml) her bir oyuğuna, 1 mi fibronektin solüsyonu ekleyin. 1 saat boyunca doku kültürü kaputu plaka bırakın.
2. Iki kez steril su ile kuyu durulayın ve hava plaka kurulayın.
3. Plaka sarın ve 4 ° C'de soğuk odada kaydedin.

Fetal karaciğer eritroblast 3. saflaştırılması

NOT: E15 E13 dan Kullanım fetal ciğeri hamile fareler (C57BL / 6) zaman aşımına. E 13.5 karaciğerler CFU-E progenitörlerin verimini en üst düzeye çıkarmak için tercih edilmektedir. Gebe fareler zamanlı elde edilmesi için, 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler bir kafes (bir ya da iki kadın genellikle bir erkek) yerleştirilmiştir. Kadın vajinal fişler çiftleşme başarılı olup olmadığını belirlemek için ertesi sabah kontrol edildi. Fiş bulunduktan sonra gebeliğin ilk günü gündü.

1. Toplam Fetal karaciğer hücrelerinin hazırlanması
   1. Mou KurbanCO ₂ inhalasyon ve servikal dislokasyon ile se. Dezenfeksiyonu için% 70 etanol ile karın püskürtün. Rahim kaldırmak için diseksiyon makas ile karın açın. 1x PBS rahim yıkayın.
   2. Bir doku kültürü kaputu ve otoklavlanmıştır araçlarını kullanarak steril koşullar altında fetusa incelemek ve 1x PBS içinde yıkayın.
   3. Fetusundan fetal karaciğerleri teşrih. Yavaşça başka bir forseps ile vücuttan uzak fetal karaciğer (renkli pembe) çekin, bir forseps ile fetusun gövdesini tutun. Ilişkili fibrotik dokuların kaldırmak için forseps ile fetal karaciğer temizleyin. % 10 fetal sığır serumu içeren taze 1x PBS içine tüm cenin karaciğerleri yerleştirin.
   4. Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme fetal karaciğerleri bozabilir.
   5. 50 ml konik tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. 5 dakika boyunca 800 x g'de Pelet hücreleri.
   6. FBS, süpernatan aspire edin ve% 10 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri (yaklaşık 8 E 13.5 cenin karaciğeri) ml başına.
2. Negatif Ter119 eritroblast saflaştırılması
   1. 15 dakika boyunca buz üzerinde sıçan IgG'si ile hücreleri (0.2 mg / ml) bloke eder.
   2. , Yıkama ya da santrifüj olmadan hücre süspansiyonu (1 ug / ml) biyotinile anti-Ter119 antikor ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin.
   3. 5 dakika boyunca 800 x g'de 10% FBS (1:10) ve santrifüj ile 1x PBS içinde yıkayın. % 10 FCS içeren 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
   4. 75 ul ekle manyetik parçacıklar ile konjüge edilmiş ve buz üzerinde 10 dakika inkübe streptavidin.
   5. PBS% 10 FBS içeren 2.5 ml hacim ekleyin. Alt tüp yuvarlak 5 ml'lik polipropilen içine hücre süspansiyonu aktarın.
   6. Manyetik hücre sınıflandırma düzeneğinin içine takın ve tüp, 10 dakika için inkübe edilir. Ter119 pozitif hücreler, tüp yan ekleme. Serbest Ter119 negatif Eritroblastlar süspansiyon halinde kalır.
   7. Alt tüp yuvarlak yeni bir 5 ml'lik polipropilen içine hücre süspansiyonu dökün.
   8. Tekrar kalan Ter119 pozitif hücrelerini kaldırmak için 3.2.6 ve 3.2.7 adımları.
   9. 5 dakika boyunca 800 x g'de Pelet hücreleri. Süpernatant aspire. % 10 FBS içeren 1 ml PBS içerisinde yeniden süspanse edin ve hücreleri, tripan mavi ile canlı hücreleri sayın.

Virüsler kodlayan cDNA ya da shRNA 4. İletimi

1. 3-5 de saflaştırılmış Ter119 negatif cenin karaciğer hücreleri levhası X 10 ^5/12-gözlü plaka kaplanmış bir fibronektin (farklı plaka kullanılması durumunda, hücre sayısını ayarlamak) olarak.
2. Viral iletimini kolaylaştırmak için 10 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Sıkma 37 ° C 1-1.5 saat boyunca 800 x g hızında, lentivirüsleri ya da retrovirüsler, kodlayan cDNA ya da shRNA ile hücreleri enfekte etmektedir.

Kalıt aktarımlı Ter119 Negatif Fare fetal karaciğer eritroblast 5. Kültür

1. (Şekil 1 kesik çizgiler) terminali eritropoezin erken evrede gen fonksiyonlarını test etmek için.">
   1. Kültür 12 saat boyunca EPO barındırmayan ortam (SCF ortam) olarak transduse edilmiş hücrelerin transduse genler ve progenitör bir durumun muhafazası ekspresyonunu sağlamak için.
   2. 5 dakika boyunca 800 xg'de hücreleri santrifüj. Süpernatant aspire. 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna ortam içeren 1 ml Epo süspansiyon hücreleri.
   3. 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir.
2. Terminal eritropoezde (Şekil 1 katı çizgiler) geç evrede Test gen fonksiyonları.
   1. Kültür EPO ihtiva eden bir ortam içinde hemen transduse hücreleri.
   2. 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir.

Akış Sitometrik Analizi Kültür Fetal Karaciğer Hücreleri 6. Boyama

1. Yıkayın ve 1x PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon. Hasat akım sitometri analizi için 2 x 10 ⁵ kültür hücreleri.
2. Inkübekaranlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca florofor konjuge antikor ile hücreler. Farklılaşmasını test etmek için APC konjuge anti-CD71 ve PE konjüge anti-Ter119 kullanın. Enükleasyonu test etmek için, diğer antikorlar yanı sıra, Hoechst 33342 boyası kullanın.
3. 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreler ölü hücreleri boyamak ve analiz dışında tutmak için% 1 FBS ve propidyum iyodür (PI) (1 ug / ml) ihtiva eden 0.5 ml PBS içerisinde süspansiyon hücreleri.
4. Davranış akış cytrometric analizi. Sitometresinin akışının ayarlanması ve tazminat için ilk tek renk lekeli ve lekesiz kontrolü hücreleri analiz.

Sonuçlar

Şekil 1, deneysel stratejileri açıklamaktadır. Bu protokol, terminal eritropoezi erken ve geç aşamalarında sinyal molekülleri Hedef alma fonksiyonları için iki bağımsız koşulları oluşur. Ter119 negatif Fetal karaciğer Eritroblastlar E 13.5 fare fetüs saflaştırılmıştır. Fetal karaciğer eritrosit önce ve saflaştırma işleminden sonra, akış sitometrik analizi ile arıtma (Şekil 2A ve 2B) etkili olduğunu gösterdi. Terminal erythropoiesis

Tartışmalar

Burada kronolojik fare fetal karaciğer terminali eritropoezi analiz etmek için eşsiz bir sistem sunuyoruz. Farklı kültür koşulları uygulama sayesinde, başarıyla erken ve geç evrelerinde terminal eritropoezi disseke. Bu çok işlevli genlerin mekanizmaların belirlenmesi özellikle önemlidir. Örneğin, Rac GTPazlar terminali eritropoezin farklı aşamalarında önemli rol oynar. Terminal eritropoezis etkiler, hücre farklılaşması ve çoğalması erken evrede Rac GTPases engellenmesi. Diğer yandan, hücre...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063