Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

Resumo

Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Resumo

Eritropoiese envolve um processo dinâmico que começa com unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES) seguido de divisão rápida erythroid unidades formadoras de colônia (UFC-Es). Depois de CFU-Es, as células são morfologicamente reconhecíveis e geralmente denominado eritroblastos terminais. Um dos desafios para o estudo da eritropoiese terminal é a falta de abordagens experimentais para dissecar as funções dos genes de uma forma cronológica. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia única para determinar as funções dos genes nas fases precoces e tardias da eritropoiese terminal. Neste sistema, rato fetal Ter119 fígado (marcador de células eritróides maduras) eritroblastos negativos foram purificados e transduzidas com expressão exógena de cDNAs ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse. As células foram posteriormente cultivadas em outras que a eritropoietina (Epo) para manter a sua fase progenitoras, durante 12 horas, permitindo que os cDNAs exógenos ou shRNAs um meio contendo factores de crescimentopara expressar. As células foram mudadas para meio de EPO depois de 12 horas para induzir a diferenciação e proliferação celular, enquanto os materiais genéticos exógenos, já foram expressos. Este protocolo facilita a análise de funções de genes na fase inicial da eritropoiese terminal. Para estudar tarde fase terminal eritropoiese, as células foram cultivadas em meio imediatamente após a transdução de Epo. Desta forma, as células já foram diferenciadas para a fase tardia da eritropoiese terminal quando os materiais genéticos transduzidas foram expressos. Recomendamos a aplicação geral desta estratégia que ajudaria a entender as funções dos genes detalhadas em diferentes estágios de eritropoiese terminal.

Introdução

Eritropoiese é o processo de diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes para amadurecer eritrócitos. Este processo gradual inclui a formação de unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES), os que se dividem rapidamente unidades formadoras de colônias eritróides (UFC-ES), e morfologicamente eritroblastos reconhecíveis ^1,2. Eritropoiese Terminal a partir de células progenitoras CFU-E envolve sequencial estágios independentes ^{2,3-dependente} e eritropoietina. Na fase inicial da eritropoiese terminal, eritropoietina (Epo) se liga ao seu receptor na superfície da célula e induz uma série de vias de sinalização a jusante que previnem a apoptose celular e promovem a divisão celular rápida e de ^1,4 a expressão do gene. No final da fase de eritropoiese terminal, eritroblastos submeter saída do terminal ciclo celular, condensação de cromatina e núcleo, e extrusão dos núcleos altamente condensadas ^5.

Nossa compreensão do terminal deeritropoiese tem melhorado muito nas últimas décadas, que é em grande parte devido ao sucesso do uso de vários in vitro e in vivo de mouse ^6-9. Entre estes modelos, a cultura in vitro de rato fetal eritroblastos fígado proporciona muitas vantagens, incluindo a facilidade de purificação de células, proliferação e diferenciação rápida, e um mímico mais perto da eritropoiese humano ^10,11. Neste sistema, um grande número de células progenitoras eritróides a partir de fígados de rato fetais pode ser facilmente isolado por purificação a única etapa de Ter119 (um marcador para as células eritróides maduras) eritroblastos negativos. Durante a cultura de dois dias dos eritroblastos, a diferenciação destas células podem ser monitorizados por uma análise de citometria de fluxo com base na expressão de superfície do receptor de transferrina (CD71) e o antigénio Ter119 ^12. Além disso, a enucleação dos eritroblastos de diferenciação terminal pode ser detectada por uma máquina de ADN (Hoechst 33342) ¹3. Além disso, as células progenitoras purificadas, pode ser geneticamente modificada por expressão de ADNc exógeno ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse, o que facilita os estudos mecanicistas das funções de expressão do gene na eritropoiese ^11,13,14.

Por outro lado, a rápida taxa de crescimento celular podem ser uma espada de dois gumes, uma vez que é difícil de caracterizar as funções de genes em diferentes fases da eritropoiese terminal. Na maioria dos casos, é difícil determinar se a funções de genes específicos na fase precoce da eritropoiese terminal de desde pelo tempo que o ADNc ou shRNAs expressa, as células já passou da fase precoce. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema único para dissecar os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Para a fase inicial da eritropoiese terminal, geneticamente modificados Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio livre de Epo, mas que contém o factor de células estaminais (SCF), IL-6 e FLT3ligante para manter seu status progenitor e permitir que os cDNAs transduzidas ou shRNA a expressão ^13. As células foram mudadas para meio contendo EPO depois de 12 horas para induzir a proliferação e diferenciação celular. Desta forma, quando as células se diferenciaram, os cDNAs foram transduzidas ou shRNAs já expressa. Para o estágio tardio da eritropoiese terminal, Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução. Portanto, pode-se analisar as funções dos genes de interesse na fase tardia da eritropoiese terminal. Em resumo, uma ampla aplicação deste sistema ajudaria funções dos genes dissecar em diferentes estágios de eritropoiese terminal.

Protocolo

Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Northwestern Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

1 Preparação de Meio de Cultura

1. Preparar a solução de fibronectina. Adicionar 1 ml de água para um frasco de fibronectina humana (1 mg). Deixar solução em cultura da capa de tecido, durante 30 minutos, sem agitação. Transferir o líquido total a 50 ml de PBS para fazer uma concentração final de 20 ug / ml e suavemente misturar bem. Adicione a solução de fibronectina fresco antes do revestimento da chapa (ver abaixo).
2. Prepare 50 ml de Epo meio livre (médio SCF). Combinar os ingredientes listados na Tabela 1. O meio pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês, quando feita.
3. Preparar 50 ml de Epo contendo meio. Combinar os ingredientes listados na Tabela 2. O meio pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês, quando feita.

2. Fibronectina placa revestida

1. Adicionar 1 ml de solução de fibronectina a cada poço de uma placa de 6 poços (ou 0,5 ml a cada poço de uma placa de 12 poços). Deixar a placa de cobertura na cultura de tecidos durante 1 h.
2. Lavar os poços duas vezes com água estéril e secar a placa.
3. Enrole a placa e guardar na câmara fria a 4 ° C.

3 Purificação de fígado fetal Erythroblasts

NOTA: Use fígados fetais de E13 para E15 cronometrado camundongos grávidas (C57BL / 6). E13.5 fígados são preferidas para maximizar o rendimento de progenitores de CFU-E. Para obter as ratas grávidas cronometrados, 6-8 semanas de idade camundongos machos e fêmeas foram colocados em uma gaiola (geralmente um macho com uma ou duas mulheres). Tampões vaginais fêmeas foram verificadas na manhã seguinte para determinar se o acasalamento com sucesso. O primeiro dia de gestação foi no dia seguinte a ficha foi encontrada.

1. Preparação das células totais de fígado fetal
   1. Sacrifique o mouse por inalação de CO ₂ e deslocamento cervical. Pulverizar o abdômen com álcool 70% para desinfecção. Abra o abdômen com dissecando tesoura para remover o útero. Lavar o útero em PBS 1x.
   2. Dissecar os fetos em condições estéreis, utilizando uma capa de cultura de tecidos e ferramentas autoclavados e lave em 1x PBS.
   3. Dissecar os fígados fetais dos fetos. Segure o corpo do feto com um fórceps, retire com cuidado o fígado fetal (na cor rosa) de distância do corpo com outro fórceps. Limpe o fígado fetal com a pinça para remover os tecidos fibróticos associados. Coloque todos os fígados fetais frescos em 1x PBS contendo 10% de soro fetal bovino.
   4. Mecanicamente perturbar fígados fetais pipetando para cima e para baixo.
   5. Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células 40 pm em um tubo de 50 ml. Agregar as células a 800 xg durante 5 min.
   6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS com FBS a 10% (cerca de 8 E13.5 fígados fetaispor ml).
2. Purificação de Ter119 Erythroblasts negativos
   1. Bloquear as células com IgG de rato (0,2 mg / ml) em gelo durante 15 min.
   2. Sem lavagem ou centrifugação, adicionar anticorpo anti-Ter119 biotinilado para a suspensão de células (1 ug / ml). Incubar durante 15 min em gelo.
   3. Lavar com PBS 1x com 10% de FBS (1:10) e centrifugar a 800 xg durante 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de PBS com 10% de FBS.
   4. Adicionar 75 ul de estreptavidina conjugada com partículas magnéticas e incuba-se durante 10 minutos em gelo.
   5. Adicionar o volume para 2,5 ml com PBS contendo 10% de FBS. Transferência da suspensão de células em 5 ml de um tubo de polipropileno de fundo redondo.
   6. Inserir o tubo de um aparelho de triagem celular magnética e incubar durante 10 min. Células positivas Ter119 vai anexar ao lado do tubo. Os eritroblastos negativos Ter119 solta permanece na suspensão.
   7. Despeje a suspensão de células em 5 ml de um novo tubo de polipropileno redondo inferior.
   8. Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7 para remover as células positivas para Ter119 residual.
   9. Agregar as células a 800 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de PBS contendo 10% de FBS e contagem de células viáveis ​​com azul de tripano.

4. Transdução com vírus Encoding cDNA ou shRNA

1. Placa as células fetais de fígado negativos Ter119 purificada a 3-5 x 10 ⁵ / po de uma fibronectina revestido de 12 poços (ajustar o número de células se utilizando uma placa diferente).
2. Adicionar polibreno a uma concentração final de 10 ug / ml para facilitar a transdução virai. Rotação infectar as células com lentivírus ou retrovírus, o ADNc que codifica ou shRNA, a 800 xg durante 1-1,5 h a 37 ° C.

5. Cultura das transduzidas Ter119 Negative mouse fígado fetal Erythroblasts

1. Para testar as funções dos genes na fase precoce da eritropoiese do terminal (Figura 1 as linhas a tracejado).">
   1. Cultura das células transduzidas em meio isento de Epo (SCF) médio durante 12 horas para permitir a expressão dos genes e manutenção do estado de progenitor transduzidas.
   2. Centrifuga-se as células a 800 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de Epo contendo o meio em cada poço de uma placa de 12 poços.
   3. Depois da cultura durante 24 ou 48 horas, a colheita das células para outros ensaios.
2. Teste as funções dos genes na fase final da eritropoiese de terminal (Figura 1 linhas sólidas).
   1. Cultura das células transduzidas imediatamente Epo contendo meio.
   2. Depois da cultura durante 24 ou 48 horas, a colheita das células para os outros ensaios.

6 A coloração das células cultivadas de fígado fetal para Análise Citometria de Fluxo

1. Lave e ressuspender as células em 1x PBS. Colheita de 2 x 10 ⁵ células em cultura para análise por citometria de fluxo.
2. Incubaras células com anticorpos fluoróforos, durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para testar a diferenciação, utilizar APC anti-CD71 conjugado e conjugado com PE anti-Ter119. Para testar a enucleação, utilizar Hoechst 33342 mancha para além dos outros anticorpos.
3. Lavar as células com PBS 1x. Ressuspender as células em 0,5 ml de PBS contendo 1% de FBS e o iodeto de propídio (PI) (1 ug / ml) para corar as células mortas e as excluir análise.
4. Fluxo de Conduta análise cytrometric. Analise as células de controle de cores coradas e não coradas primeiro single para o ajuste e compensação do citômetro de fluxo.

Resultados

A Figura 1 descreve as estratégias experimentais. O protocolo consiste em duas condições independentes para alvejar as funções das moléculas sinalizadoras nas fases precoce e tardia da eritropoiese terminal. Ter119 eritroblastos de fígado fetal negativos foram purificados a partir do rato E13.5 feto. A análise por citometria de fluxo de células eritróides fetais de fígado antes e após purificação demonstrado que a purificação foi eficiente (Figuras 2A e 2B).

Discussão

Aqui apresentamos um sistema único para analisar cronologicamente rato fetal eritropoiese terminal de fígado. Através da aplicação de diferentes condições de cultivo, dissecamos sucesso eritropoiese terminais em fases precoces e tardias. Isto é particularmente importante para determinar os mecanismos de genes com funções múltiplas. Por exemplo, GTPases Rac desempenham papéis importantes em diferentes estágios de eritropoiese terminal. Inibição de Rac GTPases na fase inicial de diferenciação e prolifera?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063