Maus fötalen Leberkultursystem zur Ziel Gen-Funktionen in der frühen und späten Stadien der Klemme Erythropoese Dissect

Zusammenfassung

Wir stellen ein in-vitro-Maus fötalen Leber Erythroblasten Kultursystem, das die frühen und späten Stadien der Erythropoese Anschluß seziert. Dieses System erleichtert die funktionelle Analyse von spezifischen Genen in verschiedenen Entwicklungsstadien.

Zusammenfassung

Erythropoese beinhaltet ein dynamischer Prozess, der mit engagierten Erythroid-Burst-bildende Einheiten (BFU-E), gefolgt von sich schnell teilenden erythroiden Kolonien bildenden Einheiten (CFU-E) beginnt. Nach CFU-Es sind Zellen morphologisch erkennbar und in der Regel Terminal Erythroblasten bezeichnet. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung der terminalen Erythropoese ist der Mangel an experimentellen Ansätzen, um Genfunktionen in chronologischer Weise zerlegen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einzigartige Strategie Genfunktionen in der frühen und späten Stadien der Erythropoese Endgerät bestimmen. In diesem System wurden Maus fötalen Leber TER119 (reifen Erythrozyten-Zellmarker) negativ Erythroblasten gereinigt und mit exogenen Expression von cDNAs oder kleine Haarnadel RNAs (shRNAs) für die Gene von Interesse transduziert. Anschließend wurden die Zellen in Medium, das außer Erythropoietin (Epo), ihre Vorläuferstufe für 12 Stunden beibehalten, während man die exogene cDNA oder shRNAs Wachstumsfaktoren kultiviertzum Ausdruck zu bringen. Die Zellen wurden auf Epo Medium nach 12 h geändert wurde, um die Zelldifferenzierung und Proliferation zu induzieren, während die exogene genetische Materialien wurden bereits angegeben. Dieses Protokoll ermöglicht Analyse der Genfunktionen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese. Zu spät Terminal Erythropoese zu untersuchen, wurden Zellen sofort in Epo Medium nach Transduktion kultiviert. Auf diese Weise wurden die Zellen bereits mit dem späten Stadium der terminalen Erythropoese unterschieden, wenn die transduzierten genetischen Materialien wurden exprimiert. Wir empfehlen eine allgemeine Anwendung dieser Strategie, die Ihnen helfen zu verstehen, detaillierte Gen-Funktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Terminal würde.

Einleitung

Erythropoiese ist der Prozess der Differenzierung der multipotenten hämatopoetischen Stammzellen zu reifen Erythrozyten. Dieses schrittweise Verfahren umfasst die Bildung von erythroiden Bursts engagierten bildenden Einheiten (BFU-E), die sich schnell teilende erythroide Kolonien bildenden Einheiten (CFU-E) und morphologisch erkennbaren Erythroblasten ^1,2. Terminal Erythropoese von CFU-E-Vorläuferzellen beinhaltet sequentielle Erythropoietin-abhängigen und unabhängigen Stufen ^2,3. In der frühen Stufe der terminalen Erythropoese, Erythropoietin (Epo) bindet an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche und induziert eine Reihe von stromabwärts gelegenen Signalwege, die Apoptose zu verhindern und eine schnelle Zellteilung und Genexpression ^1,4. In der späten Phase der Klemme Erythropoese, Erythroblasten unterziehen Ausfahrt Terminal Zellzyklus, Chromatin und Kern Kondensation und Extrusion der höher kondensierten Kernen ^5.

Unser Verständnis von TerminalErythropoese hat sich in den letzten Jahrzehnten, die weitgehend auf die erfolgreiche Verwendung von mehreren in vitro und in-vivo-Maus-Modellen ^6-9 verbessert. Unter diesen Modellen in vitro-Kultur von Maus fötale Leber Erythroblasten bietet viele Vorteile, einschließlich der einfachen Zellreinigung, schnelle Proliferation und Differenzierung, und eine engere menschliche Mimik Erythropoese ^10,11. In diesem System kann eine große Anzahl von Erythrozyten-Vorläuferzellen aus der Maus fetalen Leber leicht durch den Schritt Reinigung von TER119 (ein Marker für den reifen Erythrozyten) negativ Erythroblasten isoliert werden. Während des zweitägigen Kultur der Erythroblasten, kann die Differenzierung dieser Zellen durch eine durchflusszytometrische Analyse, basierend auf Oberflächenexpression des Transferrin-Rezeptors (CD71) und dem Antigen TER119 ¹² überwacht werden. Zusätzlich kann Enukleation der terminal Differenzierung von Erythroblasten von einer DNA-Hersteller (Hoechst 33342) ¹ erkannt werden3. Weiterhin können die gereinigten Vorläuferzellen genetisch durch exogene Expression von cDNAs oder small hairpin RNAs (shRNAs) für die Gene von Interesse, die die mechanistische Untersuchungen der Funktionen der Genexpression auf die Erythropoese ^11,13,14 erleichtert modifiziert werden.

Andererseits kann die schnelle Zellwachstumsrate ein zweischneidiges Schwert, da es schwierig ist, Genfunktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Anschluß charakterisieren. In den meisten Fällen ist es schwierig zu bestimmen, ob ein bestimmtes Gen-Funktionen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese, da bis zum Zeitpunkt der cDNAs oder shRNAs ausgedrückt, bereits frühzeitig bestanden die Zellen. Um dieses Problem zu lösen, ein einzigartiges System, um die frühen und späten Stadien der Erythropoese Anschluß sezieren entwickelt. Für die frühe Stufe der terminalen Erythropoese, wurden genetisch modifizierte TER119 negativen Erythroblasten in Epo-freien Medium, jedoch mit Stammzellfaktor (SCF) kultiviert, IL-6 und FLT3Liganden an ihre Vorläufer Zustand zu erhalten und ermöglichen die transduzierten cDNAs oder shRNA Expressions ^13. Die Zellen wurden auf Epo enthaltenden Medium nach 12 h geändert wurde, die Zellproliferation und Differenzierung zu induzieren. Auf diese Weise, wenn die Zellen begannen, zu differenzieren, die transduzierten cDNAs oder shRNAs wurden bereits angegeben. Für die späte Phase der Klemme Erythropoese waren TER119 negativen Erythroblasten in Epo haltigem Medium unmittelbar nach Transduktion kultiviert. Daher kann man die Funktionen der Gene von Interesse in der späten Phase der Klemmen Erythropoese zu analysieren. Zusammenfassend würde eine breite Anwendung dieses Systems sezieren Gen-Funktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Klemme zu helfen.

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Northwestern University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.

1. Herstellung des Kulturmediums

1. Bereiten Fibronektin-Lösung. 1 ml Wasser zu einem Fläschchen mit humanem Fibronektin (1 mg). Verlassen Lösung in der Gewebekultur Haube für 30 min ohne Rühren. Dann wird die gesamte Flüssigkeit in 50 ml PBS auf eine Endkonzentration von 20 ug / ml herzustellen und schonend gut mischen. Stellen Sie vor dem Beschichten der Platte (siehe unten) die Fibronektin-Lösung frisch.
2. Bereiten Sie 50 ml Epo-freiem Medium (SCF Medium). Kombinieren der aufgeführten Bestandteile in Tabelle 1 aufgeführt. Das Medium kann bei 4 ° C für 1 Monat gelagert, wenn sie frisch hergestellt werden.
3. Bereiten Sie 50 ml Epo haltigem Medium. Kombinieren der aufgeführten Bestandteile in Tabelle 2 entspricht. Das Medium kann bei 4 ° C für 1 Monat gelagert, wenn sie frisch hergestellt werden.

2. Fibronektin beschichtete Platte

1. 1 ml Fibronektin-Lösung in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen (oder 0,5 ml in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte). Verlassen Sie die Platte in der Gewebekultur Haube für 1 Stunde.
2. Brunnen mit sterilem Wasser spülen und an der Luft trocknen zweimal die Platte.
3. Wickeln Sie die Platte, und speichern Sie im Kühlraum bei 4 ° C.

3. Reinigung der fötalen Leber Erythroblasten

HINWEIS: Die Verwendung fötalen Lebern von E13 bis E15 zeitlich schwangeren Mäusen (C57BL / 6). E13.5 Lebern werden bevorzugt, um die Ausbeute der CFU-E-Vorläufer zu maximieren. Die Zeit schwangeren Mäusen erhalten, wurden 6 bis 8 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen in einem Käfig (meist ein Mann mit einem oder zwei Weibchen) angeordnet ist. Weibliche vaginalen Pfropfen wurden am nächsten Morgen überprüft, um festzustellen, ob die Paarung erfolgreich war. Der erste Tag der Trächtigkeit war der Tag nach der Stecker gefunden wurde.

1. Vorbereitung der Gesamt fötalen Leberzellen
   1. Opfer der mouse von CO ₂ Einatmen und Genickbruch. Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol zur Desinfektion. Öffnen Sie den Bauch mit Dissektionsscheren, um die Gebärmutter zu entfernen. Die Gebärmutter in 1x PBS waschen.
   2. Sezieren die Föten unter sterilen Bedingungen mit einer Gewebekultur Kapuze und autoklaviert Werkzeuge und waschen in 1x PBS.
   3. Sezieren die fötale Leber von Föten. Halten Sie den Körper des Fötus mit einer Pinzette vorsichtig ziehen die fötale Leber (rosa Farbe) vom Körper mit einer anderen Pinzette. Reinigen Sie die fötale Leber mit der Pinzette, um die zugehörigen fibrotische Gewebe zu entfernen. Legen Sie alle fötalen Lebern in frischem 1x PBS, das 10% fetales Rinderserum.
   4. Mechanisch stören fetalen Leber durch Pipettieren von oben und unten.
   5. Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um Sieb Zelle in einem 50 ml konischen Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen bei 800 × g für 5 min.
   6. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren der Zellen in 1 ml PBS mit 10% FBS (ca. 8 E13.5 fetalen Leberpro ml).
2. Reinigung von TER119 Negative Erythroblasten
   1. Blockieren der Zellen mit Ratten-IgG (0,2 mg / ml) auf Eis für 15 min.
   2. Ohne Waschen oder Zentrifugieren, fügen biotinylierten Anti TER119-Antikörper zu der Zellsuspension (1 ug / ml). Die Proben für 15 Minuten auf Eis.
   3. Waschen in 1x PBS mit 10% FBS (1:10) und zentrifugiert bei 800 g für 5 min. Resuspendieren der Zellen in 1 ml PBS mit 10% FBS.
   4. Fügen Sie 75 ul Streptavidin mit Magnetpartikel gekoppelt und Inkubation für 10 Minuten auf Eis.
   5. Hinzufügen des Volumens auf 2,5 ml mit PBS, enthaltend 10% FBS. Übertragen der Zellsuspension in 5 ml-Polypropylen-Röhre mit rundem Boden.
   6. Legen Sie den Schlauch in einem magnetischen Zellsortiervorrichtung und Inkubation für 10 min. TER119 positiven Zellen wird zu der Seite des Rohrs zu befestigen. Das freie TER119 negativen Erythroblasten in der Suspension verbleiben.
   7. Gießen Sie die Zellsuspension in eine neue 5 ml Polypropylen-Rundbodenrohr.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 und 3.2.7, um die restlichen TER119 positive Zellen zu entfernen.
   9. Pelletieren Sie die Zellen bei 800 × g für 5 min. Absaugen des Überstandes. Resuspendieren der Zellen in 1 ml PBS, enthaltend 10% FBS und zählen lebende Zellen mit Trypan-Blau.

4. Transduktion mit Viren Encoding cDNA oder shRNA

1. Platte der gereinigten TER119 negativen fötalen Leberzellen bei 3-5 x 10 ⁵ / gut in einer Fibronektin beschichteten 12-Well-Platte (Einstellung der Zellzahl, wenn mit einer anderen Platte).
2. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml der viralen Transduktion zu erleichtern. Spin infizieren die Zellen mit Lentiviren oder Retroviren kodierenden cDNA oder shRNA, bei 800 × g für 1-1,5 Stunden bei 37 ° C aufweist.

5. Kultur der transduzierten TER119 Negative Maus fötale Leber Erythroblasten

1. Gen-Funktionen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese Test (1 gestrichelt).">
   1. Kultur die transduzierten Zellen in Epo-freiem Medium (SCF-Medium) für 12 Stunden, um die Expression der transduzierten Gene und Wartung der Stammvater Staat zu ermöglichen.
   2. Zentrifugieren der Zellen bei 800 × g für 5 min. Saugen Sie den Überstand. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Epo enthaltenden Medium in jedem Well einer 12-Well-Platte.
   3. Nach einer Kultivierung für 24 oder 48 h geerntet, die Zellen für weitere Untersuchungen.
2. Test Gen-Funktionen in der späten Phase der Klemme Erythropoese (Abbildung 1 durchgezogene Linien).
   1. Kultur die transduzierten Zellen sofort in Epo haltigem Medium.
   2. Nach einer Kultivierung für 24 oder 48 h geerntet, die Zellen für die weiteren Tests.

6. Die Färbung der kultivierten fetalen Leberzellen für die Durchflusszytometrie

1. Waschen und resuspendieren der Zellen in 1x PBS. Ernte 2 x 10 ⁵ Zellen kultiviert für die Durchflusszytometrie.
2. Bebrütendie Zellen mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Um die Differenzierung zu testen, verwenden APC konjugierten anti-CD71 und PE-konjugierten anti-TER119. Um Enukleation zu testen, verwenden Hoechst 33342-Färbung zusätzlich zu den anderen Antikörpern.
3. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml PBS, das 1% FBS und Propidiumiodid (PI) (1 ug / ml), um die toten Zellen zu färben und von der Analyse auszuschließen.
4. Verhaltensfluss cytrometric Analyse. Analysieren Sie einzelne Farbe gefärbten und ungefärbten Kontrollzellen zunächst für Anpassung und Kompensation der Durchflusszytometer.

Ergebnisse

Abbildung 1 skizziert die experimentellen Strategien. Das Protokoll besteht aus zwei unabhängige Bedingungen für die Ausrichtung der Funktionen der Signalmoleküle in den frühen und späten Stadien der Erythropoese Terminal. TER119 negativen fötale Leber Erythroblasten wurden aus E13.5 Maus Fötus gereinigt. Durchflusszytometrische Analyse der fötalen Leber erythroiden Zellen vor und nach der Reinigung zeigte, daß die Reinigung effizient war (2A und 2B). Für die ...

Diskussion

Hier präsentieren wir ein einzigartiges System chronologisch analysieren Maus fötalen Leber Terminal Erythropoese. Durch die Anwendung der verschiedenen Kulturbedingungen haben wir erfolgreich seziert Terminal Erythropoese in frühen und späten Stadien. Dies ist besonders wichtig, die Mechanismen von Genen mit mehreren Funktionen zu bestimmen. Zum Beispiel spielen Rac GTPasen wichtige Rollen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Terminal. Hemmung der Rac GTPasen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese Ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063