منهج في Microinjection من<em&gt; Patiria minata</em&gt; بيضات ملقحة

Summary

الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.

Abstract

كانت شوكيات الجلد لفترة طويلة نظام نموذجي المفضل للدراسات الاستنساخ والتنمية، ومؤخرا لدراسة تنظيم الجينات وتطور العمليات التنموية. نجم البحر، Patiria miniata، تكتسب انتشار كنظام نموذج لهذه الأنواع من الدراسات التي أجريت سابقا على وجه الحصر تقريبا في قنافذ البحر، Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus. ميزة هذه الأنظمة النموذج هو سهولة إنتاج أجنة تعديل فيها هو جين معين صعودا أو downregulated، ووضع العلامات مجموعة من الخلايا، أو إدخال الجين المراسل. وهناك طريقة حقن مكروي واحد قادر على خلق مجموعة واسعة من هذه الأجنة تعديل. هنا، فإننا نقدم وسيلة للحصول على الأمشاج من P. miniata، وإنتاج بيضات ملقحة، وإدخال الكواشف مشوشة عبر حقن مكروي. يتم عزل الأجنة morphant صحية في وقت لاحق للدراسات الكمية والنوعية للجنرال الكتريكوظيفة الشرق الأدنى. توافر الجينوم وTranscriptome على البيانات لهذا الكائن الحي ازدادت أنواع الدراسات التي يتم تنفيذها وسهولة تنفيذها.

Introduction

نجم البحر، Patiria miniata، (المعروف باسم نجم الخفافيش) في الظهور كنظام نموذج للاهتمام وتنوعا لمجموعة متنوعة من الخلايا ^{1- 3، 4،5} التنموية، التطورية ^{6- 8،} والدراسات البيئية ^{9- 11.} الكبار P. وتوزع miniata على طول ساحل المحيط الهادئ من سيتكا، ألاسكا إلى باجا كاليفورنيا ¹² ويتم الاحتفاظ بسهولة في الأحواض المائية البحرية. البويضات التي يمكن الحصول عليها على مدار السنة وكل أنثى يمكن إلقاء عشرات الآلاف من البيض. ونضجت بسهولة البويضات المخصبة وخارجيا ^13. الأجنة الناتجة شفافة مما يسمح للمراقبة سهلة؛ أن تتطور بشكل متزامن، وتحتاج إلى مياه البحر الوحيد للتنمية. التجمع الجينوم كله وtranscriptomes متعددة متاحة للP. أيضا miniata ( Echinobase.org ). هذه المزايا تجعل يجعلها مثالية لمجموعة واسعة من البحوثوأغراض التدريس.

في السنوات الأخيرة، P. أصبح miniata نظام نموذجي لشبكة تنظيمية الجينات التنموي يحلل ^{14- 16.} والهدف من هذه الدراسات هو تحديد مجاملة كاملة من الجينات التنظيمية وتحديد شبكة من تفاعلاتها. الكثير من هذا العمل ينطوي على التعبير الجيني من خلال إقلاق إدخال أليغنوكليوتيد] العقاقير أو في المختبر توليفها من mRNAs. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التحليلات التنظيمية رابطة الدول المستقلة لتوصيف وظيفة الحمض النووي التنظيمي ^15. هذه التحليلات تتطلب إدخال الكواشف اضطراب و / أو مراسل الحمض النووي يبني في الأجنة. وعلاوة على ذلك، لوصف آثار المصب من هذه الاضطرابات، لا بد من مقايسة العديد من الأجنة لإجراء تغييرات في التعبير الجيني من الأهداف المحتملة. تقنيات Microinjection من عدة مئات من بيضات ملقحة هي المركزية لهذا العمل.

شوكيات الجلد، بما في ذلك P. miniata ، يتطلب عدة أشهر لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي. وبسبب هذا، فهو عموما ليس العملي لتطوير وصيانة خطوط المعدلة وراثيا من هذه الحيوانات للتجريب. لذا، تربية البالغين المعدلة وراثيا لا يمكن بكفاءة خلق الأجنة تعديل. بدلا من ذلك، يجب أن يحدث الاضطراب من جديد من خلال حقن مكروي. يقدم حقن مكروي فرصة لتعديل الأجنة مع الكواشف التي ليست خلية منفذة. يصف بروتوكول التالية طريقة لإدخال DNA، مرنا، استشفاف خلية، وأليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير إلى مئات من البويضات المخصبة في واحدة 2-3 ساعة يجلس من خلال حقن مكروي. هذا وتنتج مادة كافية لمجموعة متنوعة من التجارب المصب بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، QPCR، الموقع التهجين، RNA تسلسل، والنشاف الغربي في.

Protocol

إبقاء كل مياه البحر أو مياه البحر الاصطناعي (SW)، والحيوانات الكبار، والثقافات في 15 ° C بقدر ما هو عملي. يتم الاحتفاظ ضمان البيض وبيضات ملقحة مغمورة في SW.

أملاح البحر مستعدة تجاريا تشكيلها مع المقطر أو المياه بالتناضح العكسي يخدم كذلك مصدرا للSW. تحقق الملوحة باستخدام مقياس ثقل السائل النوعي وضبط الأملاح أو المياه لتحقيق المستوى الأمثل. الحفاظ على مستويات الثقل النوعي بين 1،020-1،025. إبقاء جميع الأواني الزجاجية وبلستيكور منفصلة عن كل المختبرات الأخرى لتجنب أي تلوث بالمواد الكيميائية. نظيف الجنين الصف المختبرات من قبل الشطف بالماء منزوع الأيونات أو نقع أحيانا في هيبوكلوريت الصوديوم المخفف تليها الشطف عدة مرات في الماء.

1. الحصول على النضوج والأمشاج من Patiria miniata الكبار

1. اختيار حيوان لاستئصال الغدد التناسلية. تحديد الجنس بعد الختان من خلال البحث عن وجود المبايض أو الخصيتين بسبب P. miniata ليست SEثنائي الشكل xually.
2. قطع فتحة صغيرة، لا أكبر من 1 سم، على طول الجانب من ذراع نجم البحر مع شفرة مشرط (الشكل 1A). باستخدام ملقط حادة صغيرة انتهت بسحب حواف شق للوصول إلى أنسجة الغدد التناسلية وسحب أنسجة الغدد التناسلية من خلال شق.
   ملاحظة: تجنب سحب أنسجة القناة الهضمية، وهو نسيج رمادية أو بنية اللون فضفاضة (الشكل 1B). المبايض هي برتقالية اللون عادة والأصفر، أو البني الفاتح (الشكل 1C)، في حين الخصيتين هي بيضاء أو البيج، وعندما عطلت سيتسبب مياه البحر ليصبح حليبي أو غائما في المظهر (الشكل 1D).
3. العودة الإناث إلى أحواض. عزل الذكور لمدة ساعة أو اثنين في وعاء من SW منذ الإجهاد من التعامل قد حث التبويض. الحيوانات تلتئم على موقع شق وتواصل تقديم الأمشاج لعدة أشهر.
4. جمع الخصيتين إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب SW مع أقل قدر ممكن وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. تخزين أي الخصيتين ليس لناإد يوم جمع في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
5. جمع المبايض في صحن الثقافة زجاجية صغيرة في عدة ملليلتر من SW. الإفراج عن البويضات من أنسجة المبيض، ندف بصرف النظر النسيج مع اثنين من أزواج من الملقط حتى لا تظل القطع الكبيرة.
   ملاحظة: على النحو الأمثل، والغالبية العظمى من البويضات يتم تطويرها بشكل كامل. هذه البويضات كبيرة ومستديرة، واضحة الأصفر أو البني الفاتح مع حويصلة جرثومي متميزة في البويضة (الشكل 2A)، مقارنة فرعية من البويضات غير المطورة التي هي أصغر والبني ومحبب، ومبهمة (الشكل 2B). إذا أكثر من حوالي 25٪ من البويضات هي من متنوعة غير المطورة، حدد أنثى مختلفة للحصول على البويضات.
6. صب البويضات والأنسجة المتبقية من خلال كأس فلتر شبكة مع حجم المسام 200 ميكرون وجمع من خلال تدفق. هذا وسوف تحتوي على جميع أصناف من البويضات ولكن إزالة أنسجة المبيض. طرد البويضات المتبقية من الأنسجة القبض عليهم من قبل مرشح عن طريق الرش ثإيث SW من زجاجة بخ. تتم تصفية أكواب باستخدام 50 مل أنبوب مخروطي الشكل (3A-A ').
7. صب تدفق من خلال من الخطوة 1.6 خلال 100 ميكرون فلتر شبكة الكأس. تجاهل البويضات صغيرة في التدفق من خلال. كبيرة البويضات كاملة النمو التي هي على استعداد لنضج سيبقى على التصفية. شطف البويضات في نظيفة 200 مل دورق.
8. إضافة 95 مل من SW على الزجاج 200 مل كوب من البويضات. إضافة 5 مل من 200 ميكرومتر 1-methyladenine لتركيز النهائي من 10 ميكرومتر.
9. نقل البويضات في طبق كبير والثقافة الضحلة مكان في 15 درجة مئوية. مساحة عالية لحجم الطبق الثقافة تسمح لتبادل الأوكسجين. البويضات لا تنضج أو لا تتطور بشكل جيد إذا كانت مكتظة خلال هذه المرحلة النضج. انقسم الى عدة أطباق من SW بالإضافة إلى 10 ميكرومتر 1-methlyadenine حتى الثقافة هي أقل من 200 البويضات / مل.
10. تسمح البويضات إلى أن تنضج ل45-90 دقيقة، ولكن لم يعد حيث سيؤدي ذلك إلى جعل البويضات غير قادرة على أن تكون وertilized. لتحديد ما إذا اكتمال النضج، والنظر في البويضات تحت نطاق تشريح. التحركات جرثومي الحويصلة نحو والصمامات مع غشاء الخلية أثناء النضج. ثم ينهار وبالتالي لم يعد مرئيا في البويضات الناضجة (الشكل 2C).

2. تسميد البويضات الناضجة

1. اختارت مجموعة صغيرة من أنسجة الخصية، تقريبا بحجم حبة البازلاء، واللحم المفروم في طبق ثقافة كوب صغير مع ما يقرب من 1 مل من SW.
2. استخدام ماصة باستور لنقل 2-3 قطرات من مياه البحر الناتجة حليبي إلى حوالي 100 مل من البويضات الناضجة ودوامة الطبق الثقافة إلى المزيج. تجنب نقل قطعة من نسيج الخصية. تجنب إضافة كميات أكبر من الحيوانات المنوية لأن هذا قد يؤدي إلى تعدد الإمناء والتنمية الفقيرة اللاحقة.
3. بعد عدة دقائق مراقبة البويضات تحت نطاق تشريح. البيض المخصب، أو بيضات ملقحة، لديها المغلف الإخصاب، وهي فقاعة واضحة التي ترتفع قبالة سلل غشاء (الشكل 2D).
   ملاحظة: عدم المضي قدما في الثقافة إذا كانت أقل من حوالي 90٪ من البيض تسميد منذ معدلات التسميد الفقيرة هي مؤشر على ثقافة غير الصحية التي قد أيضا لا تضع أيضا.
4. بعد الإخصاب كاملة، تغيير SW على بيضات ملقحة عن طريق سكب من خلال مرشح شبكة 100 ميكرون والشطف في صحن الثقافة مع SW الطازجة. من المهم لإزالة الحيوانات المنوية الزائد لمنع المجاعة الأكسجين. وضع الطبق الثقافة عند 15 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.

3. دي jellying والتجديف أسمدة البيض

1. إعداد أطباق الحقن عن طريق أخذ غطاء من طبق بتري 60 × 15 مم البوليسترين.
   1. رسم خط قلم دائم على الجزء الخلفي من الطبق، في جميع أنحاء المنطقة التي تتوافق مع مجال الرؤية على المجهر حقن مكروي. وهذا يضمن أن جميع الأجنة التجديف ضمن مجال المجهر نظر.
   2. استخدام الزجاج ماصة باستور ليسجل الخط من خلال الدائرة، صreferably من جانب واحد للدائرة (الشكل 3B). استخدام هذا الخط لاحقا لكسر إبر الحقن (الخطوة 4.5).
      ملاحظة: الكواشف تستخدم عادة التمسك الأجنة قنفذ البحر، على سبيل المثال، سلفات بروتامين أو بولي-L يسين، ليست ضرورية. دي هلامي P. بيضات ملقحة miniata عصا جيدا إلى البلاستيكية غير المصقول. نلاحظ أنها لا تلتصق بشكل جيد لأطباق الزجاج.
2. إضافة حوالي 10 مل SW إلى كل طبق بحيث يتم تغطية السطح، ولكن المياه لا دفقة مفرط في الطبق لأن هذا قد التشويش على الأجنة التجديف.
3. إزالة P. miniata معطف هلام البيضة الملقحة مع SW الحمضية قبل التجديف. هذا معطف هلام هو أكثر شمولا من تلك التي لوحظت بالنسبة للأنواع قنفذ البحر النموذج.
   1. إعداد SW حامض في نطاق درجة الحموضة 4،0-4،2. الرقم الهيدروجيني أمر بالغ الأهمية للسماح إزالة فعالة من معطف هلام مع السماح التطور الطبيعي.
   2. إضافة قطرات واحدة من 1 N (1 M) حمض الهيدروكلوريك في SW للسهم 1 لتر من SW. تسمح كل قطرة لخلط تماماورصد درجة الحموضة قبل أن يضيف المزيد من حمض الهيدروكلوريك.
      ملاحظة: واحد إلى عدة مل من حمض الهيدروكلوريك النتائج في درجة الحموضة المناسبة، ولكن لا تضيف وحدة التخزين بالكامل دفعة واحدة.
      ملاحظة: إعداد 1 N حمض الهيدروكلوريك في غطاء الدخان مع SW و 12 N (12 M) حمض الهيدروكلوريك.
   3. إزالة SW على بيضات ملقحة عن طريق سكب لهم على مرشح شبكة 100 ميكرون. شطف في 200 مل دورق في أقل قدر ممكن من SW (حوالي 10 مل). ملء كوب تصل إلى 150 مل مع SW الحمضية (الرقم الهيدروجيني 4.0) والسماح للبيضات ملقحة للجلوس في SW الحمضية لمدة 3 دقائق.
4. تجريد معطف هلام من بيضات ملقحة عن طريق سكب عليها ذهابا وإيابا بين اثنين 200 مل الأكواب، في كل مرة تمرير بيضات ملقحة من خلال مرشح شبكة 200 ميكرون. صب بيضات ملقحة من خلال تصفية جميع أنحاء 5-10x على نحو نافذة الوقت 2 دقيقة.
5. إزالة حمض SW بواسطة صب بيضات ملقحة على مرشح شبكة 100 ميكرون. شطف بيضات ملقحة في طبق زجاجي صغير مع ثقافة SW. بيضات ملقحة دي هلامي قد التمسك أطباق بلاستيكية. الأجنة التوالي فورا؛ أنها بداية لانتاج المزيد من يمعطف اللي مما يؤدي إلى التصاق الفقراء إلى الأطباق البلاستيكية مع مرور الوقت.
6. استخدام ماصة الفم (الشكل 3C-C ') لالتقاط بيضات ملقحة من الطبق الثقافة الزجاج ووضعها في خطوط مستقيمة على أطباق الحقن. تذوب وسط الجانب رقيقة من ماصة باستور فوق لهب حتى الزجاج لينة. سحب بسرعة ينتهي من الزجاج بعيدا لإنتاج تمتد رقيقة جدا من الزجاج. بمجرد أن الزجاج هو بارد، وقطع صغيرة من نهاية ماصة باستير (للحصول على معلومات إضافية حول إعداد ماصة الفم ترى السفن وآخرون 2004 ¹⁷ أو الحلو وآخرون 2004 ^18).
   1. جعل ماصة مثل التجديف أن القطر هو مجرد أكبر من قطر الأجنة ذلك أنه ليس هناك سوى واحد البيضة الملقحة سوف دخول والخروج من ماصة في كل مرة. هذا سيسمح صف واحد لتشكيل. ماصات قطرها أصغر قد تجرد المغلف الإخصاب وتعطيل بيضات ملقحة كما P. بيضات ملقحة miniata ليس لديها غشاء زجاجي لالثانية هي لينة جدا.
   2. إذا كان بيضات ملقحة لا التمسك طبق من البلاستيك، والاحتفاظ بها لوقت إضافي في SW الحمضية (تصل إلى عدة دقائق إضافية). بدلا من ذلك قطرها أصغر ماصة قد تساعد في إزالة هلام معطف للسماح للبيضات ملقحة التمسك أكثر فعالية.
   3. وبيضات ملقحة هي طافيا قليلا وتميل إلى تعويم أو تحوم فوق قاع الطبق. في هذه الحالة، ضع ماصة التجديف بحيث يتم الضغط على بيضات ملقحة بلطف على سطح الطبق لأنها خروج من ماصة (الشكل 3D).
      ملاحظة: يجوز لتناسب العديد من الصفوف على هذه الأطباق P. الأغشية الجنينية miniata لا تصبح أكثر صعوبة في اختراق مع مرور الوقت، وبالتالي يمكن للمرء أن حقن مئات بيضات ملقحة على طبق واحد.

4. حقن بيضات ملقحة

1. تحضير محاليل الحقن بتركيزات مناسبة من أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير (MASO)، مرنا، أو السلطات الوطنية المعينة في اضرب النهائيentration من 200 ملي بوكل. 400-800 ميكرومتر MASO و 2.5 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي تميل إلى إنتاج الظواهر morphant مع تقليل سمية. فإن التركيز النهائي في البيضة يكون 1/125 ^عشر تركيز انطلاق ^14. عن حلول حقن تحتوي على MASOs والحرارة إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام وعلى الفور ثم تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
   1. لسهولة فرز الأجنة حقن، إضافة رودامين ديكستران التتبع في حل حقن للحصول على تركيز 0.1٪.
2. إعداد إبر الحقن عن طريق سحب أنابيب زجاجية الشعرية (1.0 ملم × 0.75 ملم OD ID، 100 مم طول) في إبرة سحب أداة التالية تعليمات الشركة الصانعة. الإبر المناسبة للحقن في قنافذ البحر أيضا تعمل بشكل جيد لنجوم البحر، وذلك باستخدام معايير مماثلة ^19.
3. تحميل ما يقرب من 2 ميكرولتر من محلول الحقن في إبرة الحقن باستخدام طرف microloader ماصة.
4. إدراج نهاية حادة من الإبرة في مanipulator. تعيين picospritzer إلى 100 ميللي ثانية النبض وضغط الهواء من 40 PSI.
5. وضع طبق من الأجنة التجديف على خشبة المسرح المجهر، وجميع الأجنة في مجال الرؤية. توجيه الطبق بحيث خط وسجل على الجانب الأقرب إلى إبرة. ضع الإبرة في وحوالي 60 درجة زاوية بحيث غيض بالقرب من منتصف خط وفقط فوق سطح الماء.
6. التركيز على خط وسجل وخفض الإبرة حتى يأتي طرف إلى التركيز. خفض الحافة أكثر من ذلك بقليل وكسر مفتوحا عن طريق تشغيل برفق في التلال من خط وسجل. رفع رأس قبالة سطح الطبق ووضعه على رأس الصف الأول من بيضات ملقحة والتركيز على بيضات ملقحة.
7. خفض الحافة بحيث سيكون أسعد مركز البيضة الملقحة القادمة من جميع أنحاء زاوية 60 درجة. الإبرة تخترق بسهولة P. بيضات ملقحة miniata. خطوة على دواسة القدم (أو وسائل أخرى لإجبار المواد من إبرة الحقن) لإدخال البلعة من inje حل ction إلى الجنين.
8. تهدف لالبلعة التي هي 20-30٪ قطر للجنين، أو ما بين 25 و 80 رر. إذا كان البلعة هي أكبر أو أصغر من هذا، وضبط مدة الحقن على picospritzer وحقن الجنين القادم. مواصلة لضبط مدة للحصول على حجم بلعة المطلوب. تبدأ في مدة 100 ميللي ثانية. إعادة كسر الإبرة إذا أكبر من حوالي 200 ميللي ثانية هناك حاجة لإدخال البلعة المناسبة. تجاهل الإبرة وإعداد واحدة جديدة إذا كانت هناك حاجة أقل من 15-20 ميللي ثانية للحصول على هذا الحجم البلعة حيث حجم الإبرة كبير جدا ويمكن أن يعطل التطور الطبيعي.
9. المضي قدما لحقن بيضات ملقحة المتبقية على طبق الحقن. يمكن بسهولة حقن الأجنة حتى يبدأ في الانقسام وعن Blastomeres واحدة بعد الانقسام الأول. رفع دوري إبرة فوق سطح الماء لإزالة بيضات ملقحة التي تلتصق على الإبرة. إذا لزم الأمر إعادة كسر غيض من الإبرة أو تحميل إبرة جديدة في حالة حدوث انسداد.

ق ق = "jove_title"> 5. جمع حقن الأجنة لتحليل المصب

1. السماح للأجنة لتطوير عند 15 درجة مئوية في SW. الحفاظ على مساحة عالية لحجم في الثقافات للسماح لتبادل الأوكسجين. ضمان الأجنة ليست مزدحمة. الحفاظ على الثقافات أو أقل من 200 الأجنة / مل. وهذا يتوقف على المرحلة المطلوبة من الجنين، تخطط لجمع الأجنة المحقونة في حوالي 20-24 ساعة بعد الإخصاب.
   ملاحظة: هذا هو غالبا ما يكون الوقت المثالي لفرز وجمع ولأن الأجنة النامية عادة وتتميز بسهولة شكليا، ولكن لم يتم بعد السباحة.
2. إذا فقس الأجنة والملح بلطف صدمة لمنع السباحة. إضافة 200 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 إلى 10 مل من SW في طبق حقن حين يحوم بلطف SW. بعد بضع دقائق، وسوف الأجنة تسقط إلى قاع الطبق. جمع هذه ونقلها إلى وضعها الطبيعي SW الملوحة.
3. جمع الأجنة المحقونة تحت مصدر ضوء الفلورسنت المناسب متوافق مع التتبع المستخدمة في injectiعلى الحل. إذا تم استخدام أي التتبع، نوع الأجنة لاختيار لمورفولوجيا العادي.
4. باستخدام ماصة الفم، رسم الاستشعاع الأجنة حتى مع الحد الأدنى من SW وضربة بها في صحن الثقافة صغيرة مليئة SW. ماصات الفم مثالية لها فتحة كبيرة بما فيه الكفاية للأجنة ليتم سحبها داخل وخارج دون تعرضها للتلف، ولكن ليس كبيرا بحيث الأجنة غير المرغوب فيها وSW دخيلة يتم سحبها أيضا.
5. مرة واحدة تم جمعها من جميع الأجنة المرغوب في طبق جديد، ومراقبة الأجنة تحت ضوء الفلورسنت، وإزالة أي أجنة من الامم المتحدة وحقن أو الأجنة غير متطورة.
6. ثقافة فرز الأجنة إلى المراحل المطلوبة في حاضنة والمضي قدما مع التصوير أو بروتوكولات أخرى مرغوبة.

النتائج

الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم الكواشف إلى الأجنة. نحن إثبات فعالية البروتوكول عن طريق حقن مراسل بناء الحمض النووي الذي يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). حقن الأجنة تعبر عن GFP في بقع نسيلي (الشكل 4A-B) والحمض النووي خلال الانقسام يتضمن المبكر. العد?...

Discussion

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة التي من الصعب بالنسبة للمستخدمين المبتدئين لهذه التقنية ولكن لا غنى عنها لخلق أجنة morphant بنجاح. الأول هو اختيار البويضات السليمة التي من شأنها أن تنضج وتسميد بشكل صحيح. نسبة التطور الطبيعي في ثقافة تعتمد على الموسم، وصحة الحيوان، وعدد ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003