のマイクロインジェクション法<em&gt; Patiria minata</em&gt;接合体

要約

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。

要約

棘皮動物は、長い生殖と発達の研究のための好みのモデルシステムであって、より最近では発生過程の遺伝子調節と進化の研究のためにしている。海の星、Patiria miniataは 、以前にウニ、StrongylocentrotusのpurpuratusとLytechinus variegatusでほぼ独占的に実施された研究は、これらのタイプのためのモデル系としての有病率を集めています。これらのモデル系の利点は、特定の遺伝子がアップまたはダウンレギュレートされている修飾された胚、細胞群を標識する、またはレポーター遺伝子を導入することを生産する容易さである。単一のマイクロインジェクション法は、そのような改変された胚の多種多様を作成することが可能である。ここでは、Pから配偶子を得るための方法を提示miniata、接合体の生産、およびマイクロインジェクションを介して、摂動の試薬 ​​を導入する。健康なモルファント胚はその後、GEの定量的および定性的研究のために隔離されているNEの機能。この生物のためのゲノム及びトランスクリプトームデータの利用が行われた研究し、それらを実行の容易さの種類が増加している。

概要

（一般的にバットのスターとして知られている）、海の星、Patiria miniataは ^、6〜8の進化の^4,5発達セルラー^1-3さまざまな、、、と生態研究の^9〜11のために興味深く、汎用性の高いモデル系として浮上している。大人P. miniataバハカリフォルニア州から¹²のシトカ、アラスカから太平洋岸に沿って分布していると容易に海洋水槽で維持される。卵母細胞を得一年中であり、それぞれの女性は、数万の卵万のを流すことができます。卵母細胞は、容易に成熟し、外部から¹³受精されている。生じた胚は容易な観察を可能にする透明であり;彼らは同期的に開発し、開発のための唯一の海水を必要とします。全ゲノムアセンブリおよび複数のトランスクリプトームはまた、P.ご利用いただけますminiata（ Echinobase.org ）。このような利点は、研究の範囲に最適ですおよび教育目的。

近年では、P。 miniataが発生遺伝子制御ネットワークのモデル系が^14〜16を分析するとなっています。このような研究の目的は、調節遺伝子の全体の賛辞を特定し、それらの相互作用のネットワークを決定することです。この仕事の多くは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によって、またはインビトロ合成されたmRNA の遺伝子発現を乱すことを伴う。さらに、 シス調節因子の分析は、調節DNA ¹⁵の機能を特徴付けるために使用される。これらの分析は、摂動試薬および/またはDNAレポーターは胚に構築の導入を必要とします。さらに、これらの摂動の下流効果を特徴付けるために、一つの潜在的標的の遺伝子発現の変化のために多くの胚を分析しなければならない。受精卵の数百のマイクロインジェクションのための技術は、この作品のための中心である。

P.含む棘皮動物、 miniata の、性的に成熟するために何ヶ月を必要とします。このために、実験のためのこれらの動物のトランスジェニック系統を開発し、維持するために、一般的には実用的ではない。したがって、トランスジェニック大人の繁殖を効率的に修正された胚を作成することはできません。その代わりに、摂動は、マイクロインジェクションを介して新たに発生する必要があります。マイクロインジェクションは細胞透過性ではない試薬で胚を修正する機会を提供しています。以下のプロトコルは、マイクロインジェクションを介して座って1〜3時間で受精卵の数百にDNA、mRNAは、細胞トレーサー、およびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​導入する方法を説明している。これは、in situハイブリダイゼーション 、RNA-配列、およびウェスタンブロットで 、含む下流の実験のさまざまな十分な材料を生成するが、これらに限定されない、定量PCR。

プロトコル

同じくらい実用的であるように、15℃ですべての海水や人工海水（SW）、大人の動物、および文化に保管してください。卵と接合体は、SWに浸漬保持されることを確認してください。

蒸留水または逆浸透水で再構成し、商業的に調製された海の塩は、SWの供給源として十分に機能する。比重計を使用して塩分濃度を確認し、最適なレベルを達成するために、塩や水を調整します。 1.020から1.025の比重レベルを保持します。化学物質による汚染を避けるために、他のすべての実験器具から離れたすべてのガラス製品やプラスチック製品を保管してください。脱イオン水または水で数回すすぎ、続いて希次亜塩素酸ナトリウム中で時折浸漬ですすぐことによって、クリーン胚グレードの実験器具。

1 Patiria miniata大人から配偶子の入手方法および成熟

1. 生殖腺を切除する動物を選択します。 P.ので卵巣や精巣の存在を探すことによって、切除後のセックスを決定miniataはそれ自体ではありませんxually二形。
2. 手術用メスの刃（ 図1A）と海のスターのアームの側面に沿って1センチメートルより大きくない小さな開口部を、カットします。小平滑末端鉗子を使用すると、生殖腺組織にアクセスし、切開を通して生殖腺組織を引き出すために戻っ切開の端を引っ張る。
   注：緩い灰色や茶色組織（ 図1B）は、腸組織を、引き出すことは避けてください。精巣は白やベージュで、破壊された時に海水が外観が乳白色または曇った（ 図1D）になることになりますしながら卵巣を、一般的に、オレンジ、黄色、ライトブラウン（ 図1C）である。
3. 水槽にメスを返します。処理からストレスが産卵を誘発する可能性があるのでSWの容器内に1〜2時間、男性を分離します。動物は、切開部位に沿って癒し、数ヶ月間、配偶子を提供し続ける。
4. できるだけSWを1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに精巣を収集し、使用するまで氷上で保存する。いずれの精巣を格納しないでくれ週間まで4℃で収集の日にエド。
5. SWの数ミリリットルの小さなガラス培養皿において卵巣を収集します。大きな片がなくなるまで卵巣組織から卵母細胞を解放するには、鉗子の二対で組織を離れていじめる。
   注：最適には、卵母細胞の大部分は完全に開発されている。このような卵母細胞は小さく、未開発の卵母細胞のサブセットで、茶色、粒子の粗い、不透明（ 図2B）と比較して、大きな丸い、および卵母細胞における明確な卵核胞（ 図2A）と透明な黄色または淡褐色である。大きな卵母細胞の約25％以上が未発達、さまざまである場合には、卵母細胞を得るために別の女性を選択します。
6. 200ミクロンの孔サイズを有するメッシュフィルターカップを通して卵母細胞および残りの組織を注ぎ、フロースルーを収集します。これは卵母細胞のすべての品種が含まれているが、卵巣組織を削除します。 wを噴霧することにより、フィルタによって捕捉組織から残りの卵母細胞を取り除く噴出ボトルからi番目のSW。フィルターカップを50 mlコニカルチューブ（ 図3A-A '）を用いて行われる。
7. ステップ1.6から100μmのメッシュフィルターカップを通して通る流れを注ぐ。フロースルーの小さな卵母細胞を捨てる。成熟のための準備ができている大規模な完全に発達した卵母細胞をフィルター上に滞在します。清潔な200ミリリットルビーカーに卵母細胞を洗い流す。
8. 卵母細胞の200ミリリットルのガラス製ビーカーにSWの95ミリリットルを追加します。 10μMの最終濃度200μMの1 - メチルアデニンの5ミリリットルを追加します。
9. 15℃での大きな浅い培養皿や場所に卵母細胞を転送します。ボリューム培養皿に高い表面積は、酸素交換を可能にする。卵母細胞は成熟していないか、彼らがこの成熟段階の間に超満員のであれば十分に発達しないことがあります。文化が200未満の卵母細胞/ mlになるまで、SWプラス10μMの1 - methlyadenineのいくつかの皿に分割します。
10. 卵母細胞は、45〜90分間、成熟することを許可しないが、もはやこのようなfをすることができませんでした卵母細胞をレンダリングしますertilized。成熟が完了したかどうかを判断するには、解剖顕微鏡下で卵母細胞を見てください。卵核胞は向かって移動し、成熟の間に細胞膜と融合する。その後、故障しないため、成熟した卵母細胞（ 図2C）に見えなくなる。

成熟した卵母細胞の受精2。

1. 精巣組織、おおよそ豆粒大、およびSWの約1ミリリットルの小さなガラス製培養皿内のミンチの小規模なクラスタを選択しました。
2. 成熟した卵母細胞の周り100mlに得られた乳白色海水の2〜3滴を転送し、混合する培養皿を旋回するパスツールピペットを使用してください。精巣組織片を転送することは避けてください。多精子とその後の現像不良を生じ得る。このように精子のより大量を追加することは避けてください。
3. 数分後解剖顕微鏡下で卵母細胞を観察します。受精卵、または接合体は、セルの電源をオフに上昇する明確な泡で受精エンベロープを持つlの膜（ 図2D）。
   注：貧しい受精率もよく発達しないことが不健康な文化を示すものであるため、卵の90％未満では受精した場合、培養を続行しないでください。
4. 受精が完了した後、100μmのメッシュフィルターを通して注ぐと新鮮なSWを含む培養皿にすすぐことにより接合体で南西に変更します。これは、酸素の欠乏を防止するために、過剰な精子を除去することが重要である。 15〜30分間、15℃で培養皿を置きます。

3デjellying＆ボートレース受精卵

1. 60×15mmのポリスチレンペトリ皿から蓋を取ることによって、注射の料理を準備します。
   1. マイクロインジェクション顕微鏡での視野と一致する領域の周囲に、皿の裏に油性マジックペンラインを描画します。これは、すべての漕い胚は顕微鏡の視野内にあることが保証されます。
   2. サークルに、pを介してラインを獲得するためにガラスパスツールピペットを使用して、参照可能に円形（ 図3B）の一方の側にオフ。注射針（ステップ4.5）を破る後でこの行を使用します。
      注：一般的にウニ胚を接着するために使用する試薬、 例えば硫酸プロタミンまたはポリLリシンは、不要である。 P.デ·ゼリー状miniata接合体は、コーティングされていないプラスチックに非常によく付着する。彼らはガラス皿にうまく付着しないように注意してください。
2. 表面が覆われているように、各皿に周囲の10ミリリットル南西に加えるが、これは行分割胚を乱す可能性がある水が皿に過度に飛散しません。
3. Pを削除する前漕ぎ、酸SWとminiata受精卵ゼリーのコート。このゼリーのコートは、モデルウニ種で観察されるものよりも広範囲である。
   1. pHが4.0から4.2の範囲の酸南西に準備します。 pHは正常な発達を可能にしながら、ゼリーコートの効率的な除去を可能にする非常に重要です。
   2. SWの1Lのストックに1 Nのシングル滴（1 M）SW中のHClを追加します。各ドロップが完全に混合させるよりHClを添加する前にpHを監視します。
      注：適切なpH中のHCl結果の数mlに対する一つが、一度にボリューム全体を追加しないでください。
      注：SWおよび12 ​​N（12M）とヒュームフード中のHClを1NのHClを準備します。
   3. 100ミクロンメッシュフィルターにドラッグ注ぐことにより、接合体にSWを取り外します。 （約10ml）可能なSWの最小量で、200ミリリットルのビーカーにすすいでください。酸SW（pH値4.0）と150ミリリットルのビーカーを上に記入し、受精卵は3分間酸SWに座ってすることができます。
4. 2 200ミリリットルのビーカーの間を行ったり来たり、それらを注ぐことにより、接合体からゼリーコートをはがし、200ミクロンメッシュフィルターを通して接合体​​を渡すたびに。約2分間の時間窓にわたって5〜10倍の周りのフィルタを介して接合体​​を注ぐ。
5. 100ミクロンメッシュフィルター上に接合体を注ぐことにより、酸南西に削除します。 SWと小さなガラス培養皿に接合体を洗い流す。脱ゼリー状接合体をプラスチック皿に付着することがあります。直ちに行胚;彼らはよりjで生成し始める時間をかけてプラスチック皿に接着不良につながるエリーコート。
6. ガラス培養皿から受精卵をピックアップし、注入皿上の直線にそれらを配置するために口のピペット（ 図3C-C '）を使用してください。ガラスが柔らかくなるまで、炎の上にパスツールピペットの細い辺の中央メルト。すぐにガラスの非常に薄いストレッチを生成するために離れてガラスの端を引っ張る。ガラスがクールになると、（口のピペットを準備する方法の詳細については、ヴェッセルらを参照してください。2004 ¹⁷または甘いら 、2004 ^18）パスツールピペットの小端を断つ。
   1. 単一の受精卵を一度にピペットを出入りするように、直径が胚の直径よりもわずかに大きいことを漕ぎ、ピペットなどを確認します。これは、単一の行が形成することを可能にします。小径ピペットは、受精エンベロープを除去し、Pとして接合体を崩壊させる可能性miniata接合体ヒアリン膜aを持っていないNDはかなり柔らかいです。
   2. 接合体は、プラスチックシャーレに付着しない場合は、（さらに数分まで）酸SWで追加の時間のためにそれらを保持します。あるいは小径ピペット接合体をより効果的に固執することを可能にするためにゼリーコートを除去するのを助けることができる。
   3. 受精卵は、わずかにプラスに浮揚され、浮動小数点型またはちょうど皿の底の上に置く傾向がある。彼らはピペット（ 図3D）を終了として接合体を穏やかに皿の表面に押し付けているように、この場合には、ローイングピペットを配置。
      注：これらの皿に多くの行に合わせて許されるP.。 miniata胚性膜は、時間をかけて浸透することがより困難になることはないので、1は、単一の皿の上に接合体の数百を注入することができる。

接合体の4インジェクション

1. 最終濃度で、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MASO）の適切な濃度の注射液を準備したmRNA、またはDNAを200のKClのentration。 400-800μMMASOおよび2.5ngのDNA /μlの毒性を最小限に抑えながらモルファントの表現型を生成する傾向がある。卵中の最終濃度は、出発濃度^14番目 1/125になります。 5分間65℃にMASOs、熱を含有する注射液に使用し、常温で保存する直前。
   1. 注入した胚を選別を容易にするために、0.1％の濃度を得るために、注射液にローダミンデキストラントレーサーを加える。
2. 製造者の指示に従って機器を引っ張っ針でガラスキャピラリーチューブ（1.0ミリメートル外径×0.75 mm内径、長さ100mm）を引いて、注射針を準備します。ウニ内注射に適した針は、海の星のために働くので、同様のパラメータ^19を使用しています。
3. microloaderピペットチップを使用して注射針への注入溶液約2μlのをロードします。
4. Mに針の鈍端を差し込みanipulator。 100ミリ秒パルスと40 PSIの空気圧にpicospritzerを設定してください。
5. 顕微鏡ステージ上に漕いだ胚の皿を置き、視野内の全ての胚を持っている。割線が針に最も近い側になるように、料理を方向付ける。先端がラインの中央付近に、ちょうど水面より上になるように約60°の角度で針を配置します。
6. 得点ラインに焦点を当て、先端が焦点になるまで針を下ろします。もう少しヒントを下げ、ゴールラインの尾根にゆっくりと実行して開いたそれを破る。皿の表面から先端部を持ち上げ、受精卵の最初の行の一番上にそれを置き、接合体に焦点を当てています。
7. それが60度角の周囲から入ってくる受精卵の中心を突き刺すするような先端を下げます。針は簡単にPを貫通するminiata接合体。麟蹄のボーラスを紹介するフットペダル（または注射針から物質を強制的に他の手段）の手順胚へのctionソリューション。
8. 20〜30％の胚の直径であり、または25〜80 plのボーラスを目指す。ボーラスがこれより大きいか小さい場合、picospritzer上の注入の持続時間を調整し、次の胚を注入する。希望ボーラスサイズを得るために継続時間を調整して続行します。 100ミリ秒の期間で開始します。約200ミリ秒より大きく、適切なボーラスを導入するために必要な場合は、針を再分割します。針を破棄し、針のサイズが大きすぎて正常な発達を混乱させる可能性がある未満15〜20ミリ秒、このボーラスサイズを取得するために必要とされる場合は、新しいものを用意します。
9. 注射皿に残った受精卵を注入するに進みます。胚は容易に劈開が開始されるまで第一の切断後の単一割球に注入することができる。定期的に針の上に付着した接合体を除去するために水の表面から針を持ち上げます。必要に応じて、針の先端を再ブレークや閉塞が発生した場合、新しい針をロードします。

5。ダウンストリームの解析のために注入した胚の収集

1. 胚は、SWで15℃で開発することができます。酸素交換を可能にするために培養中で体積に対する高い表面積を維持します。胚が混雑していないことを確認。 200胚/ mlで以下に文化を保持します。胚の所望の段階に応じて、周囲の20〜24時間後に受精時に注入された胚を収集するために計画しています。
   注：これは、多くの場合、ソートし、収集するための理想的な時間であり、通常、発生中の胚を容易に形態的に区別されているので、まだ泳いでいません。
2. 胚は孵化している場合は、ゆっくり水泳を防ぐためにショックを塩。優しく南西に旋回しながら、注射皿にSWの10mlに5M NaClを200μlのを追加します。数分後、胚は皿の底に落ちる。これらを収集し、通常の塩分SWに移動します。
3. injectiで使用トレーサーと互換性の適切な蛍光光源の下で注入した胚を収集ソリューションの。何トレーサーを使用しなかった場合は、正常な形態を選択するために胚を並べ替える。
4. 口のピペットを用いて、SWの最少量の蛍光胚を策定し、SWで満たされた小さな培養皿にそれらを吹き飛ばす。理想的な口のピペットは、それらを損傷することなく、内外に引っ張られる胚のための十分な大きさの開口部を持っていますが、望ましくない胚および外来のSWはまた、プルアップされているほど大きくはない。
5. 一旦全ての目的の胚のは、新たな皿に収集された、蛍光灯の下で胚を観察し、あらゆる非注入胚または未発達の胚を取り除く。
6. 文化インキュベーター内で目的の段階に胚を選別し、イメージングまたは他の所望のプロトコルを進める。

結果

このプロトコルの目的は、胚に試薬を導入することである。私たちは、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を駆動するDNAレポーター構築物を注入することにより、プロトコルの有効性を示す。 DNAは初期の切断中に組み込んだとして注入した胚は、クローン性のパッチ（ 図4A-B）に、GFPを発現する。胚に導入することが望ましいです多くの試薬が大量にかつ胚の次善のバッチに有毒?...

ディスカッション

この技術の初心者ユーザーにとっては難しいですが、成功したモルファント胚を作成するために不可欠であるつの重要なステップがあります。最初は成熟し、適切に受精されます健康的な卵母細胞を選択している。培養中の正常な発達の割合は季節によって異なり、動物の健康、および卵母細胞は、単一の個体から採取された回数。卵母細胞は、10月まで4月から、より良い品質のものになる?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003