Un método para la microinyección de<em&gt; Patiria minata</em&gt; Los cigotos

Resumen

Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.

Resumen

Los equinodermos han sido durante mucho tiempo un sistema modelo preferido para los estudios de reproducción y el desarrollo, y más recientemente para el estudio de la regulación de genes y la evolución de los procesos de desarrollo. La estrella de mar, patiria miniata, está ganando prevalencia como un sistema modelo para este tipo de estudios que antes se realizaban casi exclusivamente en los erizos de mar, Strongylocentrotus purpuratus y Lytechinus variegatus. Una ventaja de estos sistemas de modelo es la facilidad de producir embriones modificados en los que un gen particular es hacia arriba o downregulated, el etiquetado de un grupo de células, o la introducción de un gen informador. Un único método de microinyección es capaz de crear una amplia variedad de tales embriones modificados. A continuación, presentamos un método para la obtención de gametos a partir de P. miniata, producir cigotos, y la introducción de reactivos perturbadores mediante microinyección. Posteriormente morphant embriones sanos son aislados para estudios cuantitativos y cualitativos de la gefunción ne. La disponibilidad de datos sobre el genoma y transcriptoma para este organismo ha aumentado los tipos de estudios que se realizan y la facilidad de ejecución de ellos.

Introducción

La estrella de mar, patiria miniata, (comúnmente conocido como el palo de la estrella) se perfila como una interesante y versátil sistema de modelo para una variedad de celulares ^{del 1 al 3,} de desarrollo ^{de 4,5,} evolutiva ^{6 8,} y estudios ecológicos ^{9- 11.} Adultos P. miniata se distribuyen a lo largo de la costa pacífica de Sitka, Alaska a Baja, California ¹² y se mantienen fácilmente en acuarios marinos. Los ovocitos son durante todo el año se puede obtener y cada hembra puede arrojar decenas de miles de huevos. Los ovocitos son fácilmente madurados y fecundados externamente ^13. Los embriones resultantes son transparentes lo que permite la observación fácil; se desarrollan de forma sincrónica, y requieren sólo agua de mar para el desarrollo. Montaje del genoma entero y varios transcriptomes también están disponibles para P. miniata ( Echinobase.org ). Estas ventajas hacen que sean ideales para una amplia gama de investigacióny con fines didácticos.

En los últimos años, P. miniata se ha convertido en un sistema modelo para la red de regulación de genes del desarrollo analiza ^{14 al 16.} El objetivo de estos estudios es identificar todo el complemento de genes reguladores y determinar la red de sus interacciones. Mucho de este trabajo implica perturbadora expresión génica mediante la introducción de oligonucleótidos antisentido o en mRNAs in vitro sintetizado. Además, los análisis reguladores cis se utilizan para caracterizar la función del ADN reguladora ^15. Estos análisis requieren introducción de reactivos de perturbación y / o reportero de constructos de ADN en embriones. Además, para caracterizar los efectos aguas abajo de estas perturbaciones, se debe ensayar muchos embriones por cambios en la expresión génica de objetivos potenciales. Técnicas para la microinyección de muchos cientos de cigotos son centrales para este trabajo.

Equinodermos, incluyendo P. miniata , requieren muchos meses para alcanzar la madurez sexual. Debido a esto, generalmente no es práctico para desarrollar y mantener las líneas transgénicas de estos animales para la experimentación. Por lo tanto, la cría de los adultos transgénicos no puede de manera eficiente crear embriones modificado. En cambio, la perturbación debe ocurrir de novo a través de microinyección. Microinyección ofrece la oportunidad de modificar los embriones con reactivos que no son de células permeables. El siguiente protocolo describe un método para introducir ADN, ARNm, trazadores de células, y oligonucleótidos antisentido morfolino en cientos de huevos fertilizados en un 2-3 hr sesión a través de microinyección. Esto produce material suficiente para una variedad de experimentos posteriores, incluyendo, pero no limitado a, qPCR, hibridación in situ, ARN-Seq, y el Western Blot.

Protocolo

Mantenga toda el agua de mar o agua de mar artificial (SW), los animales adultos, y culturas a 15 ° C, tanto como sea práctico. Asegurarse de huevos y cigotos se mantienen sumergidos en SW.

Sales marinas comercialmente preparados reconstituidos con agua destilada o de ósmosis sirve también como fuente de SW. Compruebe la salinidad utilizando un hidrómetro y ajustar sales o agua para lograr niveles óptimos. Mantenga los niveles de gravedad específica entre 1,020-1,025. Guarde todos los objetos de vidrio y plástico separada de todas las demás material de laboratorio para evitar cualquier contaminación con productos químicos. Clean embrión grado material de laboratorio de un enjuague con agua desionizada o de remojo ocasional en hipoclorito de sodio diluido seguido de aclarado varias veces en agua.

1. Obtención y maduración de los gametos patiria miniata Adultos

1. Seleccione un animal para extirpar las gónadas. Determinar el sexo después de la escisión mediante la búsqueda de la presencia de ovarios o los testículos porque P. miniata no son en síxually dimórfico.
2. Corte una abertura pequeña, de no más de 1 cm, a lo largo del lado de un brazo de la estrella de mar con una hoja de bisturí (Figura 1A). El uso de pequeñas pinzas de punta roma pull back bordes de la incisión para acceder al tejido gonadal y tire del tejido gonadal a cabo a través de la incisión.
   NOTA: Evite sacar tejido intestinal, que es un tejido de color gris o marrón suelto (Figura 1B). Los ovarios son generalmente de color naranja, amarillo o marrón claro (Figura 1C), mientras que los testículos son de color blanco o amarillento y cuando interrumpen hará que el agua de mar para convertirse lechosa o turbia en apariencia (Figura 1D).
3. Hembras regresan a los acuarios. Aislar hombres por una o dos horas en un recipiente de SW ya que el estrés de la manipulación puede inducir el desove. Animales curan a lo largo de la zona de la incisión y continúan proporcionando gametos durante varios meses.
4. Recoger los testículos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con tan poco como sea posible y SW almacenar en hielo hasta su uso. Almacenar cualquier testículos no nosed en el día de la recolección a 4 ° C durante un máximo de una semana.
5. Recoge los ovarios en una pequeña placa de cultivo de vidrio en un varios mililitros de SW. Para liberar los ovocitos a partir del tejido de ovario, desmenuzar el tejido con dos pares de pinzas hasta que no quedan trozos grandes.
   NOTA: En condiciones óptimas, la mayoría de los oocitos están completamente desarrollados. Tales ovocitos son grandes, redondo, y clara amarilla o marrón claro con una vesícula germinal distinta en el ovocito (Figura 2A), en comparación con el subconjunto de ovocitos no desarrollados que son más pequeños, marrón, granulada, y opaco (Figura 2B). Si es mayor que alrededor de 25% de los ovocitos son de la variedad sin desarrollar, seleccionar una hembra diferente para obtener los ovocitos.
6. Vierta los ovocitos y el tejido restante a través de una taza filtro de malla con un tamaño de poro de 200 micras y recoger el flujo a través. Este contendrá todas las variedades de ovocitos, pero eliminar el tejido ovárico. Desalojar restantes ovocitos a partir del tejido capturado por el filtro rociando wITH SW de una botella con atomizador. Filtrar los vasos se hacen usando un tubo cónico de 50 ml (Figura 3A-A ').
7. Vierta el flujo a través del paso 1.6 a través de un 100 micras taza del filtro de malla. Deseche pequeños ovocitos en el flujo a través. Grandes ovocitos completamente desarrollados que están listos para la maduración se quedará en el filtro. Enjuague los ovocitos en un limpio vaso de 200 ml.
8. Añadir 95 ml de SW al vaso de precipitados de vidrio de 200 ml de ovocitos. Añadir 5 ml de 200 mM 1-metiladenina para una concentración final de 10 mM.
9. La transferencia de los ovocitos a una gran placa de cultivo superficial y lugar a los 15 ° C. Un área de superficie alta a volumen placa de cultivo permite el intercambio de oxígeno. Los ovocitos no maduran o no se desarrollan bien si son de hacinamiento durante esta fase de maduración. Dividir en varios platos de SW más 10 M 1-methlyadenine hasta que la cultura es menos de 200 ovocitos / ml.
10. Permita que los ovocitos que maduran por 45-90 min, pero ya no como este hará que los ovocitos no pueden ser fertilized. Para determinar si la maduración se ha completado, mirar los ovocitos bajo un microscopio de disección. Las vesículas germinales se mueve hacia y se fusiona con la membrana celular durante la maduración. A continuación, se rompe y por lo tanto ya no es visible en ovocitos maduros (Figura 2 C).

2. fecundación de ovocitos maduros

1. Eligió un pequeño grupo de tejido testicular, más o menos del tamaño de un guisante, y carne picada en una pequeña placa de cultivo de vidrio con aproximadamente 1 ml de SW.
2. Utilice una pipeta Pasteur transferir 2-3 gotas de agua de mar lechosa resultante de alrededor de 100 ml de los ovocitos maduros y haga girar la placa de cultivo para mezclar. Evitar la transferencia de piezas de tejido testicular. Evite agregar mayores cantidades de esperma, ya que esto puede resultar en poliespermia y pobre desarrollo posterior.
3. Después de varios minutos observar los oocitos bajo un microscopio de disección. Los huevos fertilizados o cigotos, tienen un sobre fertilización, que es una esfera transparente que se alza frente a la cell membrana (Figura 2D).
   NOTA: No proceda con la cultura si es menor de alrededor del 90% de los huevos fertilizar ya que las tasas de fertilización pobres son un indicio de una cultura poco saludable que también no puede desarrollarse bien.
4. Después de la fecundación es completa, cambiar el SO en los cigotos vertiendo a través de un filtro de malla de 100 micras y aclarado en una placa de cultivo con SW fresco. Es importante para eliminar el exceso de esperma para evitar la falta de oxígeno. Coloque la placa de cultivo a 15 ° C durante 15-30 min.

3.-De gelificante y Remo huevos fertilizados

1. Preparar platos de inyección mediante la adopción de la tapa de un 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri.
   1. Dibuja una línea rotulador permanente en la parte posterior del plato, alrededor de la zona que coincide con el campo de visión en el microscopio microinyección. Esto asegura que todos los embriones rowed están dentro del campo microscópico de vista.
   2. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para anotar una línea a través del círculo, preferably a un lado del círculo (Figura 3B). Use esta línea después de romper agujas de inyección (Paso 4.5).
      NOTA: Los reactivos comúnmente utilizados para adherir embriones de erizo de mar, por ejemplo, sulfato de protamina o poli-L-lisina, son innecesarias. De-gelatina P. cigotos miniata se adhieren muy bien al plástico sin recubrir. Tenga en cuenta que no se adhieren bien a los platos de cristal.
2. Añadir alrededor de 10 ml SW a cada placa de modo que la superficie está cubierta, pero el agua no salpicará excesivamente en el plato como esto puede perturbar embriones hileras más.
3. Retire el P. abrigo miniata jalea cigoto con SW ácido antes de remo. Esta capa de jalea es más extensa que la observada para las especies de erizos de mar modelo.
   1. Preparar SW ácido en el intervalo de pH 4,0-4,2. El pH es crítico para permitir la eliminación eficaz de la capa de la jalea al tiempo que permite el desarrollo normal.
   2. Añadir gotas individuales de 1 N (1 M) HCl en SW a un 1 L de stock de SW. Permita que cada gota se mezcle completamentey controlar el pH antes de la adición de más HCl.
      NOTA: una a varias ml de HCl resultados en el pH apropiado, pero no añadir todo el volumen a la vez.
      NOTA: Prepare HCl 1 N en la campana de humos con SW y (M 12) HCl 12 N.
   3. Retire SW en cigotos vertiéndolos sobre un filtro de malla de 100 micras. Enjuague en un vaso de 200 ml en la menor cantidad de SW posible (aproximadamente 10 ml). Llene el vaso de precipitados hasta 150 ml con SW ácido (pH 4.0) y permitir que los cigotos para sentarse en el SW ácido durante 3 min.
4. Pelar capa de jalea de los cigotos mediante el vertido de un lado a otro entre dos vasos de precipitados de 200 ml, cada vez que pasa los cigotos a través de un filtro de malla de 200 micras. Vierta los cigotos a través del filtro alrededor 5-10x durante aproximadamente una ventana de tiempo de 2 min.
5. Retire SW ácido vertiendo los cigotos a un filtro de malla de 100 micras. Enjuague los cigotos en una pequeña placa de cultivo de vidrio con SW. Cigotos en gelatina-De pueden pegarse a los platos de plástico. Embriones fila inmediatamente; comienzan a producir más jelly capa que conduce a una mala adherencia a placas de plástico con el tiempo.
6. Utilice una pipeta de boca (Figura 3 C-C ') para recoger a los cigotos de la placa de cultivo de vidrio y colocarlos en líneas rectas en los platos de inyección. Fundir el centro de la parte delgada de una pipeta Pasteur sobre una llama hasta que el vidrio es suave. Tirar rápidamente los extremos del vidrio aparte para producir un tramo muy delgada de vidrio. Una vez que el vaso esté frío, rompa el pequeño extremo de la pipeta Pasteur (para obtener información adicional sobre la preparación de una pipeta de boca ver Wessel et al. 2004 ¹⁷ o Sweet et al. 2004 ^18).
   1. Hacer una pipeta de remo tal que el diámetro es sólo mayor que el diámetro de los embriones de modo que sólo un único cigoto entrar y salir de la pipeta a la vez. Esto permitirá una sola fila a la forma. Pipetas de menor diámetro pueden despojar el sobre fertilización y perturbar los cigotos como P. cigotos miniata no tienen una membrana hialina unand son bastante suaves.
   2. Si los cigotos no se adhieren a la placa de plástico, mantenerlos por el tiempo adicional en SW ácido (hasta varios minutos). Alternativamente una pipeta de diámetro más pequeño puede ayudar en la eliminación de la capa de la jalea para permitir que los cigotos se peguen más eficaz.
   3. Los cigotos son un poco flotabilidad positiva y tienden a flotar o flotar justo por encima de la parte inferior del plato. En este caso, la posición de la pipeta de remo de modo que los cigotos se presionan suavemente sobre la superficie de la placa cuando se aproximan a la pipeta (Figura 3D).
      NOTA:. Está permitido encajar muchas filas en estos platos P. membranas embrionarias miniata no se vuelven más difíciles de penetrar en el tiempo y, por tanto, uno puede inyectar cientos de cigotos en un solo plato.

4. inyección de cigotos

1. Preparar soluciones de inyección con concentraciones apropiadas de oligonucleótidos antisentido morfolino (MASO), ARNm, o ADN en una concentración finalentration de 200 mM KCl. 400-800 M MASO y 2,5 ng / l de ADN tienden a producir fenotipos morphant mientras que se minimiza la toxicidad. La concentración final en el huevo será 1/125 ^ª de la concentración de partida ^14. Para soluciones inyectables que contienen masos, calentar a 65 ° C durante 5 minutos inmediatamente antes de su uso y luego almacenar a temperatura ambiente.
   1. Para facilitar la clasificación de los embriones inyectados, añadir rodamina dextrano trazador a la solución de inyección para obtener una concentración de 0,1%.
2. Preparar agujas de inyección tirando de tubo capilar de vidrio (1,0 mm OD x 0,75 mm ID, 100 mm de longitud) en una aguja de tracción instrumento siguiendo las instrucciones del fabricante. Las agujas adecuadas para la inyección en los erizos de mar también funcionan bien para las estrellas de mar, por lo que utilizan parámetros similares ^19.
3. Cargue aproximadamente 2 l de solución de inyección en una aguja de inyección usando una punta de pipeta microloader.
4. Insertar el extremo romo de la aguja en el manipulator. Establecer Picospritzer a 100 pulsos ms y una presión de aire de 40 PSI.
5. Coloque un plato de embriones remado en la platina del microscopio y tienen todos los embriones en el campo de visión. Orientar el plato de tal manera que la línea de marcado está en el lado más cercano a la aguja. Coloque la aguja en un ángulo de aproximadamente 60 ° para que la punta se encuentra cerca del centro de la línea y justo por encima de la superficie del agua.
6. Se centran en la línea marcada y bajar la aguja hasta que la punta quede enfocada. Baje la punta un poco más y lo rompiera abierto ejecutando suavemente en las crestas de la línea marcada. Con la punta de la superficie del plato y colocarlo en la parte superior de la primera fila de cigotos y centrarse en los cigotos.
7. Bajar la punta tal que atravesar el centro de cigoto que viene de alrededor de un ángulo de 60 °. La aguja penetra fácilmente P. cigotos miniata. Pisar el pedal de pie (u otros medios de forzar el material de la aguja de inyección) para introducir un bolo de injesolución cción en el embrión.
8. Objetivo de un bolo que es de 20-30% del diámetro del embrión, o entre 25 y 80 pl. Si el bolo es mayor o menor que esto, ajustar la duración de la inyección en el Picospritzer e inyectar la próxima embrión. Siga ajustando la duración para obtener el tamaño del bolo deseado. Comience en 100 ms de duración. Re-rompa la aguja si es mayor de alrededor de 200 ms se necesita introducir el bolo apropiado. Deseche la aguja y preparar una nueva si se necesita menos de 15 a 20 ms para obtener este tamaño bolo como el tamaño de la aguja es demasiado grande y puede interrumpir el desarrollo normal.
9. Proceda para inyectar los cigotos restantes en el plato de inyección. Los embriones fácilmente se puede inyectar hasta que comience la escisión y en blastómeros independientes, después de la primera escisión. Periódicamente levantar la aguja por encima de la superficie del agua para eliminar los cigotos que se pegan sobre la aguja. Si es necesario volver a romper la punta de la aguja o cargar una nueva aguja si se produce un bloqueo.

5. , Colección de sellos inyectado embriones para análisis de aguas abajo

1. Permita que los embriones que se desarrollan a 15 ° C en el suroeste. Mantener el área de superficie de alto volumen en las culturas para permitir el intercambio de oxígeno. Asegúrese de embriones no están llenas de gente; mantener las culturas en o por debajo de los 200 embriones / ml. Dependiendo de la etapa deseada del embrión, el plan para recoger embriones inyectados en alrededor de 20 a 24 horas después de la fertilización.
   NOTA: Esto es a menudo un momento ideal para ordenar y recoger y debido a los embriones en desarrollo normalmente se distinguen fácilmente morfológicamente, pero que aún no están nadando.
2. Si los embriones han eclosionado, sal con cuidado de choque para evitar la natación. Añadir 200 l de NaCl 5 M a 10 ml de SW en el plato de inyección mientras se agita suavemente el SW. Después de unos minutos, los embriones caerán a la parte inferior del plato. Reunir estos y moverlos a la normalidad SW salinidad.
3. Recoger los embriones inyectados bajo una fuente de luz fluorescente apropiada compatible con el trazador utilizado en el injectien solución. Si no se utilizó ningún marcador, clasificar los embriones para seleccionar para la morfología normal.
4. Con una pipeta de boca, dibujar fluorescente embriones con una cantidad mínima de SW y soplar hacia fuera en una pequeña placa de cultivo lleno de SW. Pipetas de boca ideales tienen una gran abertura suficiente para que los embriones que se sacaron y salir sin dañarlos, pero no tan grande que los embriones no deseados y SW ajeno también se detuvieron.
5. Una vez que todos los embriones deseados se han recogido en el nuevo plato, observar los embriones bajo luz fluorescente y eliminar cualquier embrión un-inyectado embriones o poco desarrollados.
6. Cultura ordenadas embriones a etapas deseadas en una incubadora y proceder con imágenes u otros protocolos deseados.

Resultados

El objetivo de este protocolo es introducir los reactivos en los embriones. Se demuestra la eficacia del protocolo mediante la inyección de un constructo reportero de ADN que conduce la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). Inyectado embriones expresan GFP en parches clonales (Figura 4A-B) como incorpora el ADN durante la escisión temprana. Muchos reactivos que son deseables para introducir en los embriones son tóxicos en cantidades elevadas y para lotes subóptimas de embriones. Manif...

Discusión

Hay dos pasos críticos que son difíciles para los usuarios novatos de esta técnica, pero son esenciales para la creación de embriones con éxito morphant. La primera es la selección de los ovocitos sanos que madurarán y fertilizar adecuadamente. El porcentaje de desarrollo normal en una cultura depende de la temporada, la salud del animal, y el número de veces que los ovocitos han sido recolectadas de un solo individuo. Los ovocitos suelen ser de mejor calidad a partir de abril a octubre. Es importante examinar c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003