שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Summary

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

Abstract

Echinoderms כבר זמן רב מערכת מודל מועדף למחקרים של רבייה והתפתחות, ולאחרונה לחקר ויסות הגנים והאבולוציה של תהליכים התפתחותיים. כוכב הים, Patiria miniata, הוא צובר שכיחות כמערכת מודל למחקרים מסוג שבוצעו באופן כמעט בלעדי בעבר בקיפודי הים, purpuratus Strongylocentrotus וvariegatus Lytechinus. יתרון של מערכות מודל אלה הוא הקלות של יצירת עוברים שונה שבגן מסוים הוא למעלה או downregulated, תיוג קבוצה של תאים, או החדרת גן כתב. שיטת microinjection בודדת מסוגלת לייצר מגוון רחב של עוברים שונה כגון. כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תאי רבייה מפ miniata, הפקת zygotes, והחדרת חומרים כימיים מדאיגים באמצעות microinjection. עוברי morphant בריאים מבודדים לאחר מכן למחקרים כמותיים ואיכותיים של geפונקצית ne. הזמינות של נתוני הגנום וtranscriptome לאורגניזם זה הגדילה את סוגי מחקרים שמבוצעים ואת הקלות של ביצועם.

Introduction

כוכב הים, Patiria miniata, (הידוע בכינויו כוכב העטלף) מסתמן כמערכת מודל מעניינת ותכליתית עבור מגוון רחב של ¹ סלולארי ^3, התפתחותיות ^4,5, אבולוציוני ^{6 8,} ומחקרים אקולוגיים ^{9- 11.} פ למבוגרים miniata מופצים לאורך חוף האוקיינוס ​​השקט מסיטקה, אלסקה לאחה, ¹² קליפורניה ונשמר בקלות באקווריום ימי. ביציות הן ימות השנה ברת השגה וכל נקבה יכולה לשפוך עשרות אלפי ביצים. ביציות הבשילו בקלות ומופרה חיצוני ^13. העוברים וכתוצאה מכך הם שקופים ומאפשרים להתבוננות קלה; הם מפתחים באופן סינכרוני, ודורשים מים ים רק לפיתוח. הרכבה הגנום כולו וtranscriptomes מרובה זמינות גם עבור P. miniata (Echinobase.org). יתרונות כגון להפוך אותם אידיאליים עבור מגוון רחב של מחקרומטרות הוראה.

בשנים האחרונות, פ ' miniata הפך מערכת מודל לרשת רגולציה גן התפתחותי מנתחת ^{14- 16.} מטרת מחקרים מסוג זה היא לזהות את כל המחמאה של גני רגולטורים ולקבוע את הרשת של יחסי הגומלין שלהם. חלק ניכר מהעבודה כרוכה בביטוי גנים מדאיג דרך כניסתה של oligonucleotides antisense או בmRNAs מבחנה מסונתזת. בנוסף, ניתוחי רגולציה cis משמשים כדי לאפיין את הפונקציה של DNA הרגולציה ^15. ניתוחים אלה דורשים הקדמה של חומרים כימיים ההפרעות ו / או כתב הבונה DNA לעוברי. יתר על כן, כדי לאפיין את ההשפעות במורד הזרם של הפרעות אלה, יש assay עוברים רבים לשינויים בביטוי הגנים של מטרות פוטנציאליות. טכניקות לmicroinjection של מאות רבות של zygotes הן מרכזיות לעבודה זו.

Echinoderms, כולל P. miniata , דורש חודשים רבים כדי להגיע לבגרות מינית. בגלל זה, זה בדרך כלל לא מעשי לפתח ולשמר קווים מהונדסים של בעלי חיים אלה לניסויים. לכן, גידול של מבוגרים מהונדסים לא יכול ביעילות ליצור הותאם עוברים. במקום זאת, צריכה להתרחש ההפרעות דה נובו באמצעות microinjection. Microinjection מציע הזדמנות לשנות עוברים עם ריאגנטים שאינם תא חדיר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה להציג את DNA, mRNA, קליעים נותבים תא, וoligonucleotides antisense morpholino למאות ביצים מופרות בשעה אחת 2-3 יושבת דרך microinjection. זה מייצר חומר מספיק עבור מגוון רחב של ניסויים במורד הזרם כולל, אך לא מוגבל ל, qPCR, הכלאה באתר, RNA-Seq, ומערבי סופג.

Protocol

שמור את כל מי הים או מי ים מלאכותי (SW), גורים ובוגרים, ותרבויות ב15 ° C עד כמה שהוא מעשי. ביצים וzygotes להבטיח שמתקיימים שקועים בSW.

מלחי ים מסחרי מוכנים מחדש עם מים אוסמוזה מזוקקים או הפוכים משמש גם כמקור של SW. בדוק מליחות באמצעות הידרומטר ולהתאים מלחים או מים כדי להשיג רמות אופטימליות. לשמור על רמות משקל סגולי בין 1.020-1.025. שמור את כל כלי הזכוכית וplasticware להיפרד מכל מעבדתי האחרים, כדי למנוע כל זיהום בכימיקלים. מעבדתי נקי עובר כיתה על ידי שטיפה במים ללא יונים או שריה מזדמנת בהיפוכלוריט נתרן לדלל ואחריו שטיפה מספר פעמים במים.

1 קבלת והתבגרות תאי רבייה ממבוגרי miniata Patiria

1. בחר בעלי חיים שיחתכו בלוטות מין. לקבוע מין לאחר כריתה על ידי מחפש את נוכחותו של השחלות או אשכים בגלל פ miniata אינו sexually דימורפית.
2. לחתוך פתח קטן, לא גדול יותר מ 1 סנטימטר, בצד של זרוע כוכב ים עם להב אזמל (איור 1 א). בעזרת מלקחיים הסתיימו בוטים קטנים למשוך בחזרה קצוות של החתך כדי לגשת לרקמת בלוטת המין ולמשוך רקמת אשך החוצה דרך החתך.
   הערה: יש להימנע מתלישת רקמת מעי, שהוא רקמה אפורה או חום רופף (איור 1). השחלות הן בדרך כלל כתומות, צהובות, או בצבע חום בהיר (איור 1 ג), ואילו אשכים הם לבנים או בז'ים וכאשר שיבשו יגרמו מים ים על מנת להפוך לחלבי או מעונן בהופעה (1D איור).
3. חזור נקבות לאקווריום. לבודד זכרים לשעה או שעות במכל של SW מאז הלחץ מטיפול עשוי לגרום להשרצה. בעלי חיים לרפא לאורך אתר החתך ולהמשיך לספק תאי מין במשך כמה חודשים.
4. לאסוף אשכים לתוך צינור 1.5 Eppendorf מ"ל עם SW הקטן ככל האפשר, ולאחסן על קרח עד לשימוש. לאחסן כל אשכים לאעורך ביום האיסוף בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
5. לאסוף השחלות בצלחת תרבות זכוכית קטנה בכמה מיליליטרים של SW. כדי לשחרר את הביציות מרקמת השחלה, להפריד את הרקמה עם שני זוגות מלקחיים עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
   הערה: באופן אופטימלי, רוב הביציות מפותחות באופן מלא. ביציות כאלה הן גדולות, עגולים, וברורים צהוב או חום בהיר עם שלפוחית ​​נבטיה מובהקת בביצית (איור 2 א), בהשוואה לקבוצת המשנה של ביציות לא מפותחות, כי הם קטנים, בצבע חום, מגורענים, ואטומים (איור 2). אם גדול יותר סביב 25 מאשר% מהביציות הם של המגוון בלתי מפותח, בחר נשי שונה כדי להשיג ביציות.
6. יוצקים את הביציות ורקמה שנותרה באמצעות כוס מסנן רשת עם גודל נקבובית 200 מיקרומטר ולאסוף לזרום. זה יכלול את כל הסוגים של ביציות אבל להסיר את רקמת השחלה. לסלק ביציות שנותרו מהרקמה נתפסה על ידי המסנן על ידי ריסוס wSW ith מבקבוק להשפריץ. כוסות מסנן מבוצעות באמצעות צינור חרוטי 50 מ"ל (איור 3A-').
7. יוצקים את הזרימה דרך מהצעד 1.6 באמצעות כוס מסנן רשת 100 מיקרומטר. בטל ביציות קטנות בזרימה דרך. ביציות גדולות שפותחו באופן מלא כי הם מוכנים להתבגרות יישאר על המסנן. יש לשטוף את הביציות לתוך מבחנה 200 מ"ל נקייה.
8. הוספת 95 מ"ל של SW לכוס זכוכית 200 מ"ל של ביציות. הוסף 5 מ"ל של 200 1 מיקרומטר-methyladenine לריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
9. מעבירים את הביציות לצלחת גדולה רדודה תרבות ומקום ב15 ° C. שטח פנים גבוה למנת תרבות נפח מאפשר לחילופי חמצן. הביציות לא בשלות או לא עשוי לפתח גם אם הם צפופים בשלב התבגרות זה. התפצל לכמה מנות של SW תוספת 10 1 מיקרומטר-methlyadenine עד התרבות היא פחות מ -200 מ"ל / ביציות.
10. לאפשר הביציות להבשיל ל45-90 דקות, אבל כבר לא כמו זה יהפוך את הביציות מסוגלות להיות fertilized. כדי לקבוע אם ההתבגרות היא מלאה, מסתכל על הביציות תחת היקף לנתח. המהלכים הנבטיים שלפוחית ​​לכיוון ונתיכים עם קרום התא במהלך התבגרות. לאחר מכן הוא מתפרק ולכן הוא כבר לא נראה לעין בביציות בוגרות (איור 2 ג).

.2 הפריה של ביציות בוגר

1. בחר מקבץ קטן של רקמת אשך, בערך בגודל אפונה, ובשר טחון בצלחת תרבות זכוכית קטנה עם כ 1 מ"ל של SW.
2. השתמש בפיפטה פסטר להעביר 2-3 טיפות של מי ים החלבי וכתוצאה מכך לכ 100 מ"ל של הביציות הבשלות ולערבל את המנה התרבות לערבב. הימנע מהעברת חתיכות של רקמת אשך. הימנע מהוספת כמויות גדולות יותר של זרע כפי שזה עלול לגרום לpolyspermy ופיתוח עני שלאחר מכן.
3. לאחר כמה דקות לצפות בביציות תחת היקף לנתח. ביצים מופרות, או zygotes, יש מעטפת הפריה, שבו היא בועה ברורה שעולה מcelקרום l (איור 2 ד).
   הערה: אל להמשיך עם התרבות אם פחות סביב 90 מאשר% מביצים להפרות שכן שיעורי הפריה ירודים הם אינדיקציה של תרבות לא בריאה שגם לא יכול להתפתח היטב.
4. לאחר ההפריה היא מלאה, לשנות את SW על zygotes על ידי שפיכה דרך מסנן רשת 100 מיקרומטר ושטיפה לתוך צלחת תרבות עם SW הטרי. חשוב להסיר את הזרע העודף כדי למנוע רעב חמצן. מניחים את צלחת התרבות ב15 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות.

.3 De-רוטט וחתירת ביצים מופרות

1. הכן מנות הזרקה על ידי לקיחה את המכסה מצלחת פטרי 60 x 15 קלקר מ"מ.
   1. למתוח קו בטוש קבוע בחלק האחורי של הצלחת, באזור שמתאים לשדה הראייה במיקרוסקופ microinjection. הדבר מבטיח כי כל העוברים חתרו הם גם בתחום מיקרוסקופ מבט.
   2. השתמש בפיפטה פסטר זכוכית להבקיע קו דרך המעגל, עמ 'referably בצד אחד של המעגל (איור 3 ב). להשתמש בקו זה בהמשך לשבור מחטי הזרקה (שלב 4.5).
      הערה: ריאגנטים נפוצים לדבוק עוברי קיפודי ים, למשל, סולפט protamine או פולי-L ליזין, הם מיותרים. De-קרוש פ zygotes miniata להיצמד היטב לפלסטיק ללא ציפוי. שים לב שהם לא מקל גם על כלים מזכוכית.
2. להוסיף סביב 10 מ"ל SW לכל מנה, כך שהמשטח מכוסה, אבל המים לא להתיז יתר על המידה בצלחת מכיוון שהדבר עלול להפריע עוברים חתרו.
3. הסר את פ מעיל miniata הזיגוטה ג'לי עם SW חומצה לפני החתירה. מעיל ג'לי זה יותר נרחב מזה שנצפה עבור מיני קיפודי ים מודל.
   1. הכן SW חומצה בטווח של pH 4.0-4.2. PH הוא קריטי כדי לאפשר ההסרה יעילה של מעיל ג'לי תוך התרת התפתחות תקינה.
   2. מוסיף טיפה אחת של 1 N (1 M) HCl בSW למניית 1 ליטר של SW. לאפשר לכל טיפה לערבב לחלוטיןולפקח pH לפני הוספה יותר HCl.
      הערה: אחת לכמה מ"ל של תוצאות HCl בpH המתאים, אבל לא להוסיף את כל הנפח בבת אחת.
      הערה: הכן 1 N HCl במנדף עם SW ו12 N (12 M) HCl.
   3. הסר SW על zygotes במזיגה על מסנן רשת 100 מיקרומטר. יש לשטוף לתוך מבחנה מ"ל 200 בכמות הקטנה ביותר של SW האפשרי (כ 10 מ"ל). מלא את הכוס עד 150 מ"ל עם SW החומצה (pH 4.0) ולאפשר zygotes לשבת בSW החומצה במשך 3 דקות.
4. להפשיט מעיל ג'לי מzygotes על ידי שפיכתם הלוך ושוב בין שתי 200 מ"ל כוסות, בכל פעם שעברה את zygotes דרך מסנן רשת 200 מיקרומטר. יוצקים את zygotes דרך המסנן סביב 5-10x על על חלון זמן 2 דק '.
5. הסר SW חומצה על ידי שפיכת zygotes על מסנן רשת 100 מיקרומטר. יש לשטוף את zygotes לתוך צלחת תרבות זכוכית קטנה עם SW. zygotes קורש-De עשוי להיצמד לצלחות פלסטיק. עוברי שורה באופן מיידי; הם מתחילים לייצר יותר jמעיל Elly שמוביל להידבקות עניה לצלחות פלסטיק לאורך זמן.
6. השתמש בפה פיפטה (איור 3 ג-C ') לאסוף את zygotes ממנת תרבות הזכוכית ולמקם אותם לתוך קווים ישרים על מנות ההזרקה. ממסים את המרכז בצד הדק של פיפטה פסטר על אש עד שהזכוכית היא רכה. במהירות למשוך את הקצוות של הזכוכית זו מזו כדי לייצר מתיחה מאוד דקה של זכוכית. ברגע שהזכוכית היא מגניב, לשבור את הקצה הקטן של פיפטה פסטר (למידע נוסף על הכנת פיפטה פה לראות וסל et al. 2,004 ¹⁷ או מתוק et al. 2004 ^18).
   1. הפוך פיפטה חתירה כך שהקוטר הוא רק גדול יותר מאשר הקוטר של העוברים, כך שרק הזיגוטה יחידה תהיה להיכנס ולצאת פיפטה בכל פעם. זה יאפשר שורה אחת כדי ליצור. טפטפות קוטר קטנה יותר יכולה להפשיט את מעטפת ההפריה ולשבש את zygotes כפ אין לי zygotes miniata קרום hyalinend הם די רך.
   2. אם zygotes לא מקל על צלחת הפלסטיק, לשמור אותם לזמן נוסף בSW החומצה (עד יותר כמה דקות). לחלופין פיפטה בקוטר קטנה יותר עשויה לסייע בהסרת מעיל ג'לי לאפשר zygotes לדבוק בצורה יעילה יותר.
   3. Zygotes הם מעט חיובי קלילים ונוטה לצוף או לרחף ממש מעל לתחתית הצלחת. במקרה זה, למקם את פיפטה החתירה כך שzygotes נלחץ בעדינות על פני השטח של הצלחת כפי שהם יציאת פיפטה (איור 3D).
      הערה:. מותר להתאים שורות רבות במנות אלה פ קרומים עובריים miniata אינם הופכים קשים יותר לחדור לאורך זמן ולכן ניתן להזריק מאות zygotes על צלחת אחת.

.4 הזרקה של Zygotes

1. הכן את פתרונות הזרקה עם ריכוזים מתאימים של oligonucleotides antisense morpholino (Maso), mRNA, או DNAs בקונצרט כלשהו סופיentration של 200 מ"מ KCl. 400-800 מיקרומטר Maso ו2.5 ng / μl של DNA נוטים לייצר פנוטיפים morphant תוך מזעור רעילות. הריכוז הסופי בביצה יהיה 1/125 ^ה ריכוז ההתחלה ^14. לפתרונות הזרקה המכילים משוש, חום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מייד לפני שימוש ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורת חדר.
   1. על מנת להקל על מיון עוברים מוזרקים, להוסיף נותב dextran rhodamine לפתרון ההזרקה להשיג ריכוז של .0.1%.
2. הכן מחטי הזרקה על ידי משיכת צינור זכוכית נימים (ID OD x 0.75 מ"מ 1.0 מ"מ, אורך מ"מ 100) במחט מושכת מכשיר הבא הוראות יצרן. מחטים מתאימות להזרקה בקיפודי ים גם לעבוד גם עבור כוכבי ים, כל כך להשתמש בפרמטרים דומים ^19.
3. לטעון כ 2 μl של פתרון זריקה לתוך מחט זריקה באמצעות קצה פיפטה microloader.
4. הכנס את הקצה הקהה של המחט לתוך מ 'anipulator. Picospritzer מוגדר 100 דופק אלפיות שני ולחץ אוויר של 40 PSI.
5. מניחים צלחת של עוברים חתרו לבמה מיקרוסקופ וכל העוברים בשדה הראייה. להתמצא הצלחת כך ששורת הבקיע היא בצד הקרוב למחט. מקם את המחט בזווית של כ -60 ° כך הטיפ הוא קרוב לאמצע של הקו ורק מעל פני השטח של המים.
6. דגש על קו השער ולהוריד את המחט עד הקצה מתחדד. מנמיכים את הקצה קטן יותר ולשבור אותו פתוח על ידי הפעלתו בעדינות לתוך הרכסים של הקו קלע. הרם את הקצה את פני השטח של הצלחת ולמקם אותה בחלק העליון של השורה הראשונה של zygotes ולהתמקד בzygotes.
7. מנמיכים את הקצה כך שהוא ישפד מרכז הזיגוטה מגיע מרחבי זווית 60 °. המחט בקלות חודרת פ zygotes miniata. לדרוך על דוושת הרגל (או באמצעים אחרים של כפיית חומר ממחט הזריקה) להציג את בולוס של inje פתרון ction לעובר.
8. לשאוף לבולוס שהיא 20-30% בקוטר של העובר, או בין 25 ו80 pl. אם בולוס הוא גדול יותר או קטן יותר מזה, להתאים את משך הזמן של הזרקה בPicospritzer ולהזריק את העובר הבא. המשך להתאים את משך הזמן עד לקבל את גודל בולוס הרצוי. התחל מ100 משך אלפיות שני. -לשבור מחדש את המחט אם יש צורך גדול יותר מסביב 200 אלפיות השני להציג את בולוס המתאים. מחק את המחט ולהכין אחד חדש, אם יש צורך בפחות מ 15-20 אלפית שני כדי להשיג גודל בולוס זה כגודל המחט גדול מדי ועלולה לשבש התפתחות תקינה.
9. המשך להזריק zygotes שנותר על צלחת ההזרקה. בקלות ניתן להזריק עוברים עד התחלות מחשוף וללסטומרים בודד לאחר המחשוף ראשון. מעת לעת להרים את המחט מעל פני השטח של המים כדי להסיר zygotes שידביק אותם על המחט. במידת צורך מחדש לשבור את קצה המחט או לטעון מחט חדשה, אם חסימה מתרחשת.

ss = "jove_title"> 5. איסוף יצוקה עוברים לניתוח במורד זרם

1. לאפשר את העוברים להתפתח ב15 מעלות צלזיוס בSW. לשמור על שטח פנים גבוה לנפח בתרבויות כדי לאפשר חילופי חמצן. ודא עוברים אינם צפופים; לשמור על תרבויות בבית או מתחת 200 מ"ל / עוברים. בהתאם לשלב הרצוי של עובר, מתכנן לאסוף עוברים הוחדרו בסביבות 20-24 שעה לאחר הפריה.
   הערה: לעתים קרובות זהו זמן אידיאלי כדי למיין ולאסוף וכי עוברים בדרך כלל מתפתחים בקלות להבחין מורפולוגית, אך עדיין לא שוחים.
2. אם עוברים בקעו, בעדינות מלח זעזועים למניעה שחייה. הוסף 200 μl של 5 M NaCl ל10 מ"ל של SW בצלחת ההזרקה תוך מתערבל SW בעדינות. אחרי כמה דקות, העוברים ייפלו לתחתית הצלחת. לאסוף אלה ולהעביר אותם לSW מליחות הנורמלי.
3. איסוף עובר מוזרק תחת מקור אור ניאון מתאים בקנה אחד עם נותב בשימוש בinjectiעל פתרון. אם לא נותב שימש, סוג עוברים כדי לבחור למורפולוגיה נורמלית.
4. בעזרת פיפטה פה, לצייר fluorescing את עוברים עם כמות מינימאלית של SW ולפוצץ אותם לתוך צלחת תרבות קטנה מלאות SW. יש לי טפטפות פה האידיאלית מספיק פתיחה גדולה לעוברים להיות משך פנימה והחוצה מבלי לפגוע בהם, אבל לא כל כך גדולה, שעוברים לא רצויים וSW הזר גם עצרו.
5. ברגע שכל העוברים הרצויים כבר נאספו לתוך הצלחת החדשה, להתבונן בעוברים תחת אור הניאון ולהסיר כל עוברים מוזרקים בלתי או עוברים מפותחים.
6. תרבות מסודרים עוברים לשלבים רצויים בחממה ולהמשיך בהדמיה או בפרוטוקולים רצויים אחרים.

תוצאות

המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את חומרים כימיים לעוברי. אנו מדגימים את היעילות של הפרוטוקול על ידי הזרקה לבנות כתב DNA שמניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עובר מוזרק להביע GFP בתיקונים משובטים (איור 4A-B) כDNA משלב במהלך המחשוף מוקדם. ריאגנטים רבים הנמצאי...

Discussion

ישנם שני שלבים קריטיים שקשה עבור משתמשים מתחילים בטכניקה זו, אך הם חיוניים ליצירת הצלחת עוברי morphant. הוא הבחירה הראשונה ביציות בריאים שתבשלנה ולדשן כראוי. אחוז של התפתחות נורמלית בתרבות תלויה בעונה, על בריאותם של בעלי החיים, ואת מספר פעמים שביציות כבר נקצרו מאדם אחד. ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003