JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقدم بروتوكول لنشر خلايا Homalodisca vitripennis وHoCV-1 في المختبر. تمت إزالة المتوسطة من HoCV-1 الثقافات الإيجابية والحمض النووي الريبي المستخرج كل 24 ساعة عن 168 ساعة. وكان كميا البقاء على قيد الحياة الخلية تلطيخ التريبان الأزرق. تم استخراج جزيئات الفيروس كاملة بعد الإصابة. وكان كميا الحمض النووي الريبي المستخرج من QRT-PCR.

Abstract

التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis) هو حشرة vagile للغاية ومتعددة العائل جدت في جميع أنحاء جنوب غرب الولايات المتحدة. هذه الحشرات هي ناقلات الغالبة من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، وهي بكتيريا محدودة الخشب الذي هو العامل المسبب للمرض بيرس (PD) من الكرمة. مرض بيرس غير ضار اقتصاديا؛ وبالتالي، H. أصبحت vitripennis هدفا لاستراتيجيات إدارة الممرض. ارتبط وdicistrovirus يدعى Homalodisca coagulata فيروس-01 (HoCV-01) مع زيادة في الوفيات H. السكان vitripennis. لأنه مطلوب الخلية المضيفة لHoCV-01 التكرار، توفر زراعة الخلايا بيئة موحدة للنسخ المتماثل المستهدفة التي هي لوجستيا واقتصاديا قيمة لإنتاج المبيدات الحيوية. في هذه الدراسة، ونظام للنشر على نطاق واسع من H. وقد تم تطوير خلايا vitripennis عن طريق زراعة الأنسجة، صroviding آلية تكاثر الفيروس. تم استخراج HoCV-01 من الحشرات الجسم كله ويستخدم لتطعيم H. مثقف خلايا vitripennis على مستويات مختلفة. تمت إزالة مستنبت كل 24 ساعة ل168 ساعة، وتحليل الحمض النووي الريبي المستخرج مع QRT-PCR. تم صبغ الخلايا مع الأزرق التريبان وعدها لتحديد البقاء على قيد الحياة الخلية باستخدام المجهر الضوئي. تم استخراج جزيئات الفيروس كلها تصل إلى 96 ساعة بعد الإصابة، التي كانت نقطة زمنية مصممة على أن تكون قبل حدوث الانهيار التام ثقافة الخلية. تعرض الخلايا أيضا إلى تلطيخ الفلورسنت وعرضها باستخدام متحد البؤر المجهري للتحقيق في النشاط الفيروسي على F-أكتين التعلق ونوى النزاهة. الاستنتاج من هذه الدراسة هو أن H. vitripennis خلايا قادرة على المستزرعة وتستخدم لانتاج كميات كبيرة من HoCV-01 على مستوى مناسب للسماح إنتاج المبيدات الحيوية.

Introduction

تم التعرف التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis في Germar 1821) باعتباره المسيطر من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، العامل المسبب للمرض بيرس من الكرمة (PD) في أمريكا الشمالية 1. إدارة السكان الحشرات سرعان ما أصبح محور البحوث لمكافحة هذه المشكلة المدمرة لصناعة زراعة الكروم في ولاية كاليفورنيا وعبر جنوب الولايات المتحدة. A-بالمعنى الإيجابي، واحد الذين تقطعت بهم السبل فيروس RNA عائلة Dicistroviridae، Homalodisca-01 فيروس تم التعرف coagulata (HoCV-01) في H. البرية السكان vitripennis وتبين أن زيادة معدل الوفيات في هؤلاء السكان 2-4، في حين خفض مقاومة الحشرات للمبيدات الحشرية.

تطوير أساليب فعالة إلى الخلف المصابة H. كانت vitripennis إلى مرحلة البلوغ في إعداد مختبر صعبا بسبب H. vitripennis لديها مختلف الاحتياجات الغذائية مراحل محددة تتطلب مجموعة متنوعة من النباتات المضيفة 5-8. ويلزم مرافق محددة لH. الحي الخلفي vitripennis في الولايات المتحدة؛ وبالتالي، ثقافة الخلية هي أكثر اقتصادا وبديلة قابلة للحياة، فضلا عن الحيوية على نحو متزايد لHoCV-01 كشف والتكرار 2،9. حين طرق أساسية لإنشاء مزارع الخلايا من H. يتم وصف vitripennis، ولم تستخدم هذه الأساليب للإنتاج التجاري من عوامل المكافحة البيولوجية، مثل الفيروسات 2.

الهدف العام المتمثل في الإجراءات التالية هو إنتاج نسبة عالية من HoCV-01 مناسبة للاستخدام كعامل المكافحة البيولوجية. يتطلب تكاثر الفيروس الخلية الحية، وهذا هو السبب زراعة بنجاح وتحسين H. الثقافات vitripennis أمر حيوي لتقدم مستويات إنتاج مربحة من الفيروس.

Protocol

الثقافة 1. خلية

ملاحظة: تم استخدام خطوط الخلايا Homalodisca vitripennis أنشئت من قبل المختبر الدكتور واين هنتر في خدمة البحوث الزراعية وزارة الزراعة الأمريكية (فورت بيرس، فلوريدا الولايات المتحدة الأمريكية.) لبدء الأسهم المختبر يتألف من مراحل الخلية المختلطة بما في ذلك الخلايا الليفية الأولية والطبقات الوحيدة.

  1. تنفيذ الإجراءات التالية في بيئة مختبر معقمة الحفاظ على درجة حرارة تتراوح من 20-24 درجة مئوية مع 25 سم 2 قوارير الثقافة.
  2. زراعة والحفاظ على الثقافات في 25 سم 2 قوارير زراعة الأنسجة باستخدام H2G + Leafhopper المتوسطة، وتعديل WH2 سائل الإعلام النحل 10 (الجدول 1).
  3. احتضان قوارير الثقافة في 24 درجة مئوية مع رطوبة 53٪ ~.
  4. استخدام مجهر مقلوب في التكبير الإجمالي (TM) من 100X لمراقبة نمو ثقافة، على سبيل المثال، تحقق من وجود أي نمو الخلايا غير طبيعية، ومراقبة أي الملوثات المحتملة، وتحقق التقدم النمو عبر طريق مسدودسطح تلح.
  5. إجراء تغيير المتوسطة كاملة (~ 4 مل مستنبت في القارورة) كل 7 - 10 أيام من دون إزعاج سطح الثقافة.
  6. تمرير الثقافات عند السطح ثقافة ما يقرب من 80٪ من نمو الخلايا (متموجة) باستخدام 0.25٪ التربسين التي تحتوي على حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) لفصل خلايا مغطاة. إضافة ~ 2 - 3 مل من التربسين إلى كل قارورة الثقافة وفضح ثقافة (ق) إلى إنزيم لفترات قصيرة من الوقت (من 5 - 10 دقيقة) لتحقيق كامل تفكك خلية.
  7. إضافة مبلغ مساو من متوسطة جديدة لالقارورة ثقافة (ق) (~ 2 - 3 مل) لوقف نشاط انزيم ونقل الحل كله إلى أنبوب مخروطي الطرد المركزي.
  8. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 6 دقائق في 350 ز س.
  9. إزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية وإضافة ~ 8 مل من المتوسط ​​الطازجة إلى كل أنبوب. التجانس بلطف الخلايا باستخدام ماصة.
  10. الثقافات انقسام في 1: 2 نسبة 25 سم 2 قوارير (~ 4 مل من خلية solutiعلى كل قارورة) وترك الثقافات مرت حديثا دون عائق لمدة 48 ساعة للسماح للخلايا في تعليق إرفاق آمن على سطح القارورة.
    ملاحظة: زراعة خلايا في 48 معقمة جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع سطح النمو من 1 سم 2 من الممكن أيضا، ويمكن الاحتفاظ بها في نفس الطريقة كما قوارير الثقافة مع انخفاض في حجم مستنبت إلى ~ 250 ميكرولتر.

2. كامل إستخراج الفيروسات

  1. التجانس الهيئات كاملة من فيروس H. إيجابي vitripennis في العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة ~ 7.2، مع هيدرات 0.02٪ diethyldithiocarbamate الصوديوم (DETCA) قبل vortexing لفترات ~ 10 ثانية حتى لم تعد هناك أية كتل كبيرة من الأنسجة أكثر الحالية. استخراج الفيروس عن طريق الطرد المركزي في اسرع 124500 x ج لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 22،000 x ج لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. إذا كانت أشكال راسب في الأعلى، إزالته مع مسحة القطن المعقمة 11.
  2. تجاهل طاف.
  3. جمع بيليه وحل مع 5 مل من 10 ملي العازلة الفوسفات (لا DETCA)، ودرجة الحموضة ~ 7.2، يحتوي على 0.4٪ حمض نا deoxycholic و 4٪ البولي ايثيلين جلايكول الأثير hexadecyl (بريج 52).
    1. خلط بيليه جيدا، وإزالة بيليه من الجانب من الأنبوب وسحق حتى في حل إذا لزم الأمر.
    2. إضافة المزيد من العازلة الفوسفات 10 ملي في ~ 5 مل الزيادات لمساعدة بيليه يذهب إلى حل إذا لزم الأمر والجمع بين 2 إلى 11 أنابيب.
  4. الحل الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 15 دقيقة 11.
  5. إزالة طاف وتمرير حل من خلال مرشح 0.45 ميكرون، وجمع الراشح في مجموعة كبيرة أنبوب 11.
  6. نقل قطع الترشيح لغشاء غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قبالة (MWCO) من 3.5 دينار، وذلك باستخدام كميات صغيرة من 10 ملي العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7) لا تحتوي على DETCA إذا لزم الأمر 11.
  7. وضع غشاء غسيل الكلى في كوب كبير مملوء DDH 2 O في 4 درجات مئوية. تغيير DDH 2 O و كل ساعةأو 5-6 ساعة، حتى يتشكل راسب بيضاء في الغشاء 11.
  8. جمع الفيروس تنقيته من داخل الغشاء وإخضاع الحل الفيروسات 100٪ لسلسلة التخفيف 10 أضعاف خلال إضافة 10 ميكرولتر من الحل ل90 ميكرولتر من DDH 2 O. بعد ذلك إضافة 10 ميكرولتر من تمييع إلى 90 ميكرولتر آخر من DDH 2 O حتى التوصل إلى التخفيف من 1: 100،000.
  9. حل فيروس تخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تكاثر الفيروس

  1. خلايا البذور في لوحات ثقافة 48 جيدا وتنمو كافة الصفوف حتى نمو الخلايا هو 80٪ متموجة (حوالي 72 ساعة بعد تمريرة إذا الخلايا تنمو بمعدل متوسط).
  2. تطعيم كل صف من الخلايا مع فيروس المخفف المسلسل عندما يصل نمو الخلايا confluency، أي صف واحد من 1:10 التخفيف، صف واحد من التخفيف 1: 100، الخ، ما عدا الصف العلوي. استخدام الصف العلوي كعنصر تحكم وإضافة 10 ميكرولتر من DDH 2 O إلى كل جانب التحكم في مستوى الصوت.
    1. من أجل تأسيس تركيز خلية الأساسي بدءا للمقارنة مع تعداد خلايا التجريبية، فصل والاعتماد البئر الأول من كل صف قبل التلقيح الأولي من أي الآبار في الثقافات مع الفيروس.
  3. مراقبة لوحات ثقافة كل 24 ساعة بعد التطعيم الفيروسي عن أي تغيير اللون في المتوسط ​​مما يدل على تغيير درجة الحموضة وعن أي تغييرات في التشكل الخلية.
  4. صورة عمود واحد من لوحة الاختبار في كل نقطة زمنية، وذلك باستخدام مجهر مقلوب في 100X TM.
  5. إزالة جميع متوسطة من العمود الذي تم تصويره في كل نقطة زمنية 24 ساعة وتخزينها على المدى القصير عند -20 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي والكمي الفيروسي أو الطويل في -80 درجة مئوية.
  6. فصل الخلايا من الآبار بعد إزالة المتوسطة كما هو موضح سابقا في خطوات 1،6-1،9، وذلك باستخدام فقط ~ 250 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين EDTA ومتوسطة جديدة لوقف نشاط انزيم و~ 250 ميكرولتر من متوسطة جديدة لاعادة تعليق على بيليه خليةر.
  7. إضافة 10 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الزرقاء وصمة عار على كل أنبوب يحتوي على خلايا لأداء عدد الخلايا بعد تفكك خلية لكل فترة 24 ساعة على مدى أسبوع واحد. سماح وصمة عار على الجلوس لمدة 10 دقيقة قبل تنفيذ عدد الخلايا.
    1. أداء عدد الخلايا في حدود 1 ساعة من التعرض للوصمة عار أو خلايا قابلة للحياة سوف تبدأ في امتصاص وصمة عار وكذلك الخلايا غير قابلة للحياة.
  8. إضافة ببطء 10 ميكرولتر من الحل خلية الملون على كل جانب من عدادة الكريات القياسية باستخدام micropipette. يسمح الحل ليتم تناولها عن طريق عمل شعري لتجنب فقاعات الهواء.
  9. حساب عدد خلايا قابلة للحياة (غير الملون) على كلا الجانبين من عدادة الكريات (ما يعادل 4 تهم من 16 المربعات في عدادة الكريات). أداء عدد الخلايا لكل بئر من العمود الذي تمت إزالته.
  10. متوسط ​​التهم خلية من كل عمود واستخدام الصيغة التالية للحصول على إجمالي عدد خلايا: (متوسط ​​عدد الخلايا / 4) س عامل التخفيف = عدد الخلايا × 10 4 مل. هذا هو كثافة الخلية أو عدد خلايا قابلة للحياة في الثقافة.

4. استخراج الفيروسات من خلية ثقافة

  1. إزالة تعامل H. خلايا vitripennis من قوارير الثقافة كما هو موضح سابقا في خطوات 1،6-1،8، وذلك باستخدام فقط ~ 250 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين EDTA ومتوسطة جديدة لوقف نشاط انزيم.
  2. تجاهل طاف.
  3. استخراج الفيروس من خلايا الثقافة بعد بروتوكول الموصوفة سابقا في خطوات 2،3-2،8.

5. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من عينات المتوسطة التي تم جمعها خلال كل محاكمة فيروس أسبوع واحد باستخدام guanidinium ثيوسيانات-الفينول كلوروفورم مصممة لاستخراج العينات السائلة في بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. متجر استخراج العينات في -80 درجة مئوية.

6. RT-PCR

  1. وضع معايير الفيروسية لRT-PCR عن طريق تشغيل PCR التقليدي باستخدامزوج التمهيدي HoCV RT-PCR التمهيدي 1 (إلى الأمام 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 '، عكس 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') مع عزل الفيروس من الجسم كله H. vitripennis.
  2. منتج PCR تخضع لهلام الكهربائي لمدة 60 دقيقة في 120 V في 2٪ agarose هلام يحتوي على إيثيديوم بروميد 0.1٪.
  3. استئصال العصابات من هلام وتنقية باستخدام مجموعة استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. تجمع كل رفعه وهلام تنقية المنتج وزيادة تنقية عن طريق الترسيب الايثانول الأساسي. أزل هطول المنتج في حوالي 30 ميكرولتر من تريس EDTA (TE) لزيادة تركيز العينة الكلي.
  5. تحديد مستوى [كدنا] في العينات المجمعة عن طريق القياس الطيفي باستخدام إعدادات 260/230 الطول الموجي للكشف عن الحمض النووي.
  6. تنفيذ سلسلة التخفيف مسلسل عشرة أضعاف من العينة المنقى تتراوح بين 57 نانوغرام / ميكروليتر إلى 57 جي / ميكرولتر (10 -18). أداء تخفيف تسلسلي مماثلة لتلك التي وصفها طن 2.8 مع التعديلات التي أدخلت الفارق في المتطلبات التركيز.
  7. تحديد حدود الكشف عن سلسلة التخفيف عن طريق أداء QRT-PCR باستخدام طقم QRT-PCR الكمي موثوق مع النصوص منخفضة وفرة.
    ملاحظة: أقل تركيزات الفيروسية من 5 × 10 -3 نسخ ليست قابلة للكشف.
  8. استخراج الحمض النووي الريبي من عينات تجريبية كما هو موضح سابقا في الخطوة 5.1 وقياس باستخدام القياس الطيفي.
  9. تطبيع جميع العينات المستخرجة إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام المياه مجانا نوكلياز.
  10. أداء QRT-PCR في جميع العينات، والتكرارات، و25 ميكرولتر ردود الفعل باستخدام خطوة واحدة QRT-PCR عدة مع القدرة على الإحساس أعداد نسخة منخفضة كما يلي: 50 ° C عقد لمدة 10 دقيقة. 95 ° C عقد لمدة 5 دقائق. 30 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ تذوب 50-99 درجة مئوية لمدة 5 ثوان على كل خطوة.
    1. جعل مزيج الرئيسي بحيث يكون لكل خليط التفاعل يحتوي على 12.5 ميكرولتر من 1X masteمزيج ص، 1.0 ميكرولتر (0.3 ميكرومتر) من التمهيدي إلى الأمام، 1.0 ميكرولتر (0.3 ميكرومتر) من التمهيدي العكسي، 0.25 ميكرولتر من الناسخ العكسي وكميات متفاوتة من القالب على أساس القيم التوحيد.
    2. جلب حجم رد الفعل الكلي إلى 25 ميكرولتر مع ريبونوكلياز المياه مجانا.
    3. وتشمل خمس تركيزات القياسية في كل PCR تشغيل مع الأرقام النسخ التالية: 5 × 10 -10، 5 × 10 -8، 5 × 10 -6، 5 × 10 -4، و 5 × 10 -2 نسخة. تعيين عتبة كل تشغيل لأسفل ومضان من 10X -2.5 للحد من الضوضاء خلال الاستحواذ في وقت مبكر في بداية كل شوط.

7. متحد البؤر المجهر

  1. زراعة خلايا Homalodisca vitripennis في اثنتي عشرة لوحة تحتوي على البئر coverslips الزجاج قياس 18 ملم في القطر في كل بئر.
  2. تطعيم عمود واحد على لوحة كل 24 ساعة لمدة أربعة أيام، وبمجرد التوصل إلى أحادي الطبقة. تأكد من أن كل جolumn يحتوي على عنصر تحكم جيدا، والتخفيف منخفضة الفيروسي (1:10) جيدا والتخفيف الفيروسي عالية (1: 100،000) أيضا. استخدام حلول فيروس الحصول عليها من الخطوة 2.8.
  3. إزالة جميع وسائل الإعلام في اليوم الخامس وغسل خلايا مرتين مع 1X PBS (درجة الحموضة 7.4).
  4. إصلاح الخلايا مع البرد بارافورمالدهيد 4٪ في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى الخلايا وغسلها لمدة 10 دقيقة في RT على الكرسي الهزاز على سرعة منخفضة. غسل الخلايا ثلاث مرات.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 إلى الخلايا لpermeabilize لهم. اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة في RT.
  7. غسل الخلايا مرة أخرى كما سبق وصفه في الخطوة 7.5.
  8. إضافة 500 ميكرولتر من 5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) حل لمنع الخلايا في RT. اسمحوا الجلوس لمدة 2 ساعة ثم إزالته.
  9. تمييع الأسهم رودامين phalloidin الأحمر مترافق (الحزب الشيوعي الثوري) 1: 250 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 5٪ BSA وإضافة 250 ميكرولتر من التخفيف إلى كل بئر إلى وصمة عار لF-الأكتين.
  10. لوحة الغلاف في و الألومنيومالنفط لمنع الصبغة من التبييض واحتضان خلايا في 4 درجات CO / N.
  11. إزالة الحزب الشيوعي الثوري بعد 12 ساعة من الحضانة واستبدالها مع 250 ميكرولتر من 4 '، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) (250 ميكروغرام / مل) المخفف في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 5٪ BSA، وصمة عار على نوى الخلايا .
  12. احتضان الخلايا التي تحتوي على دابي في RT لمدة 1 ساعة.
  13. غسل خلايا ثلاث مرات مع 1X PBS كما هو موضح سابقا في الخطوة 7.5.
  14. بلطف إزالة لل coverslips من الآبار وجبل لشرائح المجهر باستخدام وسائل الإعلام مع تصاعد كاشف مكافحة تتلاشى.
  15. تسمح الشرائح لتجف في lightproof المربعات حتى ينظر تحت المجهر متحد البؤر. عرض أعد الشرائح في أقرب وقت ممكن الأصباغ يمكن أن تتلاشى بسرعة.
  16. صورة ملطخة الخلايا باستخدام نظام متحد البؤر المجهر مجهزة تحتوي على عدسة 63X (النفط) خطة apochromate.
    1. تعيين موجات الليزر إلى 543 ± 10 نانومتر الإثارة و 575 ± 10 نانومتر الانبعاثات لRhoadmine phalloidin الأحمر conjucated، و 369 ± 10 نانومتر الإثارة و 450 ± 30 الانبعاثات نانومتر لدابي.
    2. استخدام كسب متطابقة والمقاصة إعدادات كاشف للحصول على جميع الصور.
    3. صور عملية باستخدام البرمجيات المناسبة لمعالجة الصور والفرز واستيراد المرجوة الصور في صورة برامج إدارة.

النتائج

كان ينظر مرفق الخلية والنمو خلال 48 ساعة من مرور في كل من قوارير ثقافة الصغيرة والكبيرة، من ثقافات الابتدائية والممرات استمرار. وقد لوحظ نمو الخلايا الليفية والتنمية أيضا ضمن هذا الإطار الزمني. عندما تم بالانزعاج قوارير المصنفة حديثا قبل 48 ساعة، كان هناك انخفاض واضح ?...

Discussion

وقد يؤدي تزايد المخاوف بشأن تدفق الأنواع الغازية الزراعية إلى زيادة الطلب على منهجيات جديدة للدفاع ضد الآفات ومسببات الأمراض الناشئة. وتركز الوقاية من الأمراض وإدارة ينطوي إدارة ناقلات الممرض وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة. الاقتصاد تلعب دورا حيويا في قرار ل?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Corning cell culture flasksSigma AldrichCLS430168Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusInverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solutionSigma AldrichT40490.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture platesSigma AldrichM893748 wells (TC treated with lid)
DETCASigma Aldrich228680Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter systemSigma AldrichCLS431206Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solutionSigma AldrichP5244Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304For electrophoresis
Ethidium bromideSigma AldrichE7637BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR kitQiagen204243
4% paraformaldehydeSigma AldrichP6148Reagent grade, crystalline
PBSSigma AldrichP5368Phosphate buffered saline
Triton X-100Sigma AldrichX100
Bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA2153
Rhodamine red-conjugated phalloidinLife TechnologiesR415Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36934
LSM510 Meta Confocal SystemCarl Zeiss
LSM Zen 2007 SoftwareCarl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrateSigma AldrichH8125H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solutionSigma AldrichM8266H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ glutamine)Sigma AldrichG6784H2G+ leafhopper medium component
NystatinSigma AldrichN6261H2G+ leafhopper medium component
GentamycinSigma Aldrich46305H2G+ leafhopper medium component
DextroseSigma AldrichD9434H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442H2G+ leafhopper medium component

References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91 Homalodisca vitripennis Homalodisca coagulata 01 Xylella fastidiosa Dicistroviridae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved