Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert.

Zusammenfassung

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis) ist ein hoch vagile und polyphagen Insekten gesamten Südwesten der Vereinigten Staaten gefunden. Diese Insekten sind die vorherrschenden Vektoren Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), eine Xylem-Bakterium, das begrenzt die Erreger der Pierce-Krankheit (PD) der Weinrebe ist. Pierce-Krankheit ist wirtschaftlich schädlich; damit, H. vitripennis haben ein Ziel für Erreger-Management-Strategien geworden. Ein dicistrovirus als Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) identifiziert, mit einer erhöhten Mortalität in Verbindung gebracht H. vitripennis Populationen. Da eine Wirtszelle für HoCV-01-Replikation benötigt, stellt der Zellkultur eine gleichförmige Umgebung für die gezielte Replikation logistisch und Biopestizid Produktion wirtschaftlich wertvoll ist. In dieser Studie wurde ein System für großflächige Ausbreitung von H. vitripennis Zellen durch Gewebekultur entwickelt, providing einen viralen Replikationsmechanismus. HoCV-01 wurde aus den ganzen Körper Insekten extrahiert und verwendet, um kultivierte H. inokulieren vitripennis Zellen auf verschiedenen Ebenen. Das Kulturmedium wurde alle 24 h für 168 h, RNA extrahiert und mit qRT-PCR analysiert entfernt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und gezählt, um die Überlebensfähigkeit Zelle quantifizieren mittels Lichtmikroskopie. Ganzvirus-Partikel wurden bis zu 96 Stunden nach der Infektion, die das bestimmt zu sein, bevor die Gesamtzellkultur Zusammenbruch aufgetreten Zeitpunkt war extrahiert. Die Zellen wurden auch Fluoreszenzfärbung unterzogen und unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um virale Aktivität auf F-Actin-Bindung und Kerne Integrität zu untersuchen. Das Fazit dieser Studie ist, dass H. vitripennis Zellen, die kultiviert und zur Massenproduktion von HoCV-01 auf einen geeigneten Pegel zur Herstellung eines Biopestizids ermöglichen.

Einleitung

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis Germar 1821) hat als vorherrschende Vektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) in Nordamerika ¹ identifiziert worden, die Erreger der Pierce-Krankheit der Weinrebe (PD). Insektenpopulation Management hat sich schnell zum Mittelpunkt der Forschung werden in Kalifornien und über den Süden der Vereinigten Staaten gegen diese verheerende Problem für den Weinbau Industrie. Ein positiv Sinn, Einzelstrang-RNA-Virus aus der Familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) bei Wild H. identifiziert vitripennis Bevölkerung und gezeigt, dass die Sterblichkeit in diesen Bevölkerungsgruppen ^2-4 zu erhöhen, bei gleichzeitiger Senkung des Insekts Widerstand gegen Insektizide.

Entwicklung von Methoden, um effektiv hinten infiziert H. vitripennis in einer Laborumgebung Erwachsenenalter schwierig gewesen, weil H. vitripennis unterschiedliche Phase-spezifische Ernährungsbedürfnisse, die eine Vielzahl von Wirtspflanzen ^5-8 erfordern. Spezifische Ausstattung und hinten Live H. erforderlich vitripennis in den Vereinigten Staaten; Daher ist die Zellkultur kostengünstiger und eine praktikable Alternative sowie zunehmend wichtig für HoCV-01-Erkennung und Replikation ^2,9. Während die grundlegenden Methoden zur Festlegung von Zellkulturen von H. vitripennis beschrieben sind diese Verfahren noch nicht für eine kommerzielle Produktion von biologischen Bekämpfungsmittel verwendet worden, wie beispielsweise Viren ^2.

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, eine hohe Konzentration von HoCV-01 eignet sich für den Einsatz als biologische Bekämpfungsmittel zu produzieren. Virale Replikation erfordert eine lebende Zelle, weshalb erfolgreich zu kultivieren und zu optimieren H. vitripennis Kulturen ist von entscheidender Bedeutung für den Fortschritt der Herstellung eine gewinnbringende Virus.

Protokoll

1. Zellkultur

HINWEIS: Homalodisca vitripennis von der Dr. Wayne Hunter Labor an der USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) etablierten Zelllinien wurden verwendet, um einem Labor stock gemischten Zellstadien einschließlich Anfangs Fibroblasten und Monoschichten zu initiieren.

1. Führen Sie die folgenden Verfahren in einer sterilen Laborumgebung in einem Temperaturbereich von 20-24 ° C mit 25 cm ² Kulturflaschen gehalten.
2. Kultivieren und Kulturen mit H2G + Leafhopper Medium, eine modifizierte WH2 Honigbiene Medien ¹⁰ (Tabelle 1) zu halten in 25 cm ² Zellkulturflaschen.
3. Kulturkolben inkubieren bei 24 ° C mit ~ 53% Luftfeuchtigkeit.
4. Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei einer Gesamtvergrößerung (TM) von 100X zu Kultur Wachstum zu überwachen, zB auf eventuelle abnorme Zellwachstum überwachen für eventuelle Verunreinigungen und prüfen Wachstum Fortschritte in der Sackgassetur Oberfläche.
5. Führen Sie eine vollständige Mediumwechsel (~ 4 ml Kulturmedium pro Kolben) alle 7 - 10 Tagen, ohne die Kulturfläche zu stören.
6. Kulturen passieren, wenn das Kulturfläche von etwa 80% des Zellwachstums (konfluent) unter Verwendung von 0,25% Trypsin enthält, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellen zu dissoziieren bedeckt. Fügen ~ 2 - 3 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und setzen Kultur (en) für das Enzym für kurze Zeit (5 - 10 min), um eine vollständige Zell-Dissoziation zu erzielen.
7. Füge eine gleiche Menge an frischem Medium zu dem Kulturgefäß (en) (~ 2 - 3 ml) auf die Enzymaktivität zu stoppen und übertragen die gesamte Lösung in ein konisches Rohr zum Zentrifugieren.
8. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C für 6 min bei 350 x g beträgt.
9. Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und fügen ~ 8 ml frisches Medium zu jedem Röhrchen. Sanft homogenisieren Zellen mit einer Pipette.
10. Split Kulturen bei einem 1: 2-Verhältnis von 25 cm ^2-Kolben (ca. 4 ml Zell solutiauf pro Kolben) und lassen frisch geleitet Kulturen ungestört für 48 Stunden, sodass die Zellen in Suspension zu fest an der Oberfläche des Kolbens verbinden.
    HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen in 48-Well-Gewebekulturplatten mit sterilen mit einer Wachstumsfläche von 1 cm ² ist ebenfalls möglich, und sie können in der gleichen Weise wie Kulturflaschen mit einer Verringerung des Volumens des Kulturmediums auf ~ 250 ul gehalten werden.

2. Ganzvirus-Extraktion

1. Homogenisieren ganzen Körper des Virus positive H. vitripennis in Phosphatpuffer, pH ~ 7,2, mit 0,02% Natrium-Trihydrat (DETCA) durch Vortexen für ~ 10 Sekunden-Intervallen, bis es keine weitere große Klumpen von Gewebe vorliegen. Extrahieren Virus durch Super Zentrifugation bei 124.500 xg für 4 h bei 4 ° C oder 22.000 × g für 16 h bei 4 ° C ist. Wenn ein Niederschlag bildet an der Spitze, entfernen Sie sie mit einem sterilen Wattestäbchen ^11.
2. Überstand verwerfen.
3. Sammeln Sie die Pellet-undAuflösen mit 5 ml 10 mM Phosphatpuffer (kein DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-Desoxycholsäure und 4% Polyethylenglykol Hexadecylether (Brij 52).
   1. Um das Pellet gut mischen, entfernen Sie das Pellet von der Seite der Röhre und zerquetschen, bis in der Lösung, wenn nötig.
   2. Noch 10 mM Phosphat-Puffer in ~ 5 ml-Schritten zu helfen, das Pellet in Lösung gehen, wenn nötig und kombinieren in 2 Röhren ^11.
4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 g für 15 min ^11.
5. Entfernen Sie den Überstand und die heiße Lösung durch einen 0,45-um-Filter, und das Filtrat in großen Sammelrohr ^11.
6. Übertragungs Filtrat einer Dialysemembran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze (MWCO) von 3,5 kD, mit kleinen Mengen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) nicht enthält, wenn nötig DETCA ^11.
7. Platzieren der Dialysemembran in ein großes Becherglas mit ddH ₂ O bei 4 ° C gefüllt. Ändern Sie die _ddH2O jede Stunde foder 5 - 6 Stunden, bis sich ein weißer Niederschlag bildet in der Membran ^11.
8. Sammeln des gereinigten Virus in der Membran und unterziehen die 100% Virus-Lösung zu einer 10-fachen Verdünnungsreihe durch Zugabe von 10 ul der Lösung zu 90 ul ddH ₂ O. Anschließend weitere 90 ul _ddH2O hinzufügen 10 ul der Verdünnung bis zu einer Verdünnung von 1: 100.000.
9. Shop-Virus-Lösung bei -80 ° C.

3. Virusreplikation

1. Samenzellen in 48-Well-Kulturplatten wachsen, bis alle Zeilen Zellwachstum beträgt 80% konfluent (etwa 72 Stunden nach der Pass, wenn Zellen mit einer durchschnittlichen Rate wächst).
2. Impfen jede Zeile von Zellen mit der Serien verdünnten Virus einmal das Zellwachstum erreicht Konfluenz, dh eine Zeile einer Verdünnung von 1:10, eine Zeile einer 1: 100 Verdünnung, usw., mit Ausnahme der oberen Reihe. Verwenden Sie die obere Reihe als Kontrolle und fügen Sie 10 ul ddH ₂ O in jede Vertiefung als Lautstärkeregler.
   1. Um eine Ausgangsbasis erhoben Zellkonzentration für den Vergleich mit experimentellen Zellzahl vor der ersten Impfung aller Brunnen in den Kulturen mit dem Virus zu schaffen, distanzieren und zählen Sie die erste gut jeder Zeile.
3. Überwachen Kulturplatten alle 24 h nach der Virusimpfung für eine Farbänderung in dem Medium, das eine pH-Veränderung und Änderung in der Zellmorphologie.
4. Bild einer Spalte der Testplatte zu jedem Zeitpunkt, mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher TM.
5. Entfernen Sie alle Medium aus der Spalte, die bei jedem 24-Stunden-Zeitpunkt abgebildet wurde und speichern sie kurzfristig bei -20 ° C für die RNA-Extraktion und Quantifizierung viraler oder langfristig bei -80 ° C.
6. Distanzieren Zellen aus den Vertiefungen nach der Entfernung des Mediums, wie zuvor beschrieben, in den Schritten 1.6 - 1.9 mit nur ~ 250 ul 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität und ~ 250 ul frisches Medium zu stoppen zum Resuspendieren der Zell Pellet.
7. Fügen Sie 10 ul von 0,4% Trypanblau-Färbung zu jedem Röhrchen mit Zellen zu Zellzahlen nach der Zell Dissoziation für jeden Zeitraum von 24 h über eine Woche durchzuführen. Ermöglichen Fleck für 10 min, bevor Zellzahlen zu sitzen.
   1. Führen Zellzahlen innerhalb 1 h der Exposition gegenüber Flecken oder lebensfähige Zellen zu färben beginnt und nicht lebensfähigen Zellen Aufnahme.
8. Langsam 10 ul der gefärbten Zelllösung zu jeder Seite eines Standard-Hämozytometer unter Verwendung einer Mikropipette. Lassen Sie die Lösung durch Kapillarwirkung aufgenommen werden, um Luftblasen zu vermeiden.
9. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen (nicht fleckig) Zellen auf beiden Seiten der Zählkammer (das Äquivalent von 4 zählt der 16 Plätze in der Zählkammer). Führen Zellzahlen für jede Vertiefung der Spalte, die entfernt wurde.
10. Der Mittelwert der Zellzahlen aus jeder Spalte und verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzellzahl-Nummer zu erhalten: (Anzahl der Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor = Anzahl der Zellen x 10 ^{4 ml. Dies ist die Zelldichte oder die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Kultur.}

4. Virus Extraktion aus Zellkultur

1. Entfernen behandelt H. vitripennis Zellen aus Kulturflaschen wie zuvor in den Schritten 1.6 beschrieben - 1.8, mit nur ~ 250 ul von 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität zu stoppen.
2. Überstand verwerfen.
3. Auszug Virus von Kulturzellen nach dem Protokoll zuvor in Schritten 2.3 - 2.8.

5. RNA-Extraktion

1. Extrahieren von RNA aus Proben, die während jedes Medium eine Woche Virus Versuch unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion für flüssige Proben nach Herstellerprotokoll, gesammelt.
2. Speicher extrahierten Proben bei -80 ° C.

6. RT-PCR

1. Virus etablieren Standards für RT-PCR, indem Sie traditionelle PCR unter Verwendung derPrimerpaar HoCV RT-PCR-Primer 1 (vorwärts 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-Reverse ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3'), mit einem Virus zu isolieren, aus ganzen Körper H. vitripennis.
2. Gegenstand PCR-Produkts einer Elektrophorese für 60 min in einer 2% igen Agarose-Gel, enthaltend 0,1% Ethidiumbromid-Gel bei 120 V.
3. Auszuschneiden die Bands aus dem Gel und reinigt mit einem Gel-Extraktions-Kits nach dem Protokoll des Herstellers.
4. Pool alle ausgeschnitten und aufgereinigt Produkt weiter zu reinigen und durch Grundethanolfällung. Zugeben und das Fällungsprodukt in etwa 30 ul Tris EDTA (TE), um die Gesamtprobenkonzentration zu erhöhen.
5. Quantifizierung der Ebene der cDNA in gepoolten Proben über Spektrophotometrie mit 260/230 Wellenlänge Einstellungen für Nukleinsäure-Nachweis.
6. Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe des gereinigten Probe von 57 ng / ul bis 57 ag / ul (10 ^-18). Führen die Verdünnungs ähnlich der beschriebenen in 2,8 Anpassungen für den Unterschied in der Konzentration Anforderungen gestellt.
7. Bestimmen Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihe, indem qRT-PCR unter Verwendung eines qRT-PCR-Kit mit zuverlässige Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte.
   HINWEIS: Viral-Konzentrationen von weniger als 5 x 10 ^-3 Kopien sind nicht nachweisbar.
8. Extrahieren von RNA aus Versuchsproben, wie zuvor in Schritt 5.1 beschrieben und quantifiziert unter Verwendung von Spektrophotometrie analysiert.
9. Normalisieren alle extrahierten Proben bis 5 ng / ul mit Nuklease freiem Wasser.
10. Führen qRT-PCR bei allen Proben, in Dubletten, 25 ul Reaktionen mit Hilfe eines Ein-Schritt-qRT-PCR-Kit mit der Fähigkeit zu einer geringen Kopienzahl spüren wie folgt: 50 ° C zu halten für 10 min; 95 ° C halten für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec; schmelzen 50-99 ° C für 5 s auf jedem Schritt.
    1. Machen Sie den Master-Mix, so dass jeder Reaktionsgemisch enthält 12,5 ul 1x Master-Mix, 1,0 ul (0,3 uM) von Vorwärts-Primer, 1,0 ul (0,3 uM) der Reverse-Primer, 0,25 ul der reversen Transkriptase und variable Mengen an Template auf Basis von Standardisierung Werte.
    2. Bringen die Gesamtreaktionsvolumen auf 25 ul mit RNase freiem Wasser.
    3. Gehören fünf Standard-Konzentrationen in jedem PCR-Lauf mit den folgenden Kopienzahl: 5 x 10 ^-10, 5 x 10 ^-8, 5 x 10 ^-6, 5 x 10 ^-4 und 5 x 10 ^-2 Exemplaren. Die Schwelle für jeden Durchgang, um nur unter einem Fluoreszenz von ^-2,5 bis 10x Rauschen während frühen Erwerb zu Beginn jedes Durchlaufs zu verringern.

7. konfokale Mikroskopie

1. Wachsen Homalodisca vitripennis Zellen in einem zwölf Well-Platte mit Deckgläschen Mess 18 mm Durchmesser in jede Vertiefung.
2. Beimpfen von einer Spalte auf der Platte alle 24 Stunden für einen Zeitraum von vier Tagen, wenn eine Monoschicht erreicht wird. Sicherzustellen, dass jedes cPALTE auch eine Steuer, eine niedrige Virusverdünnung (1:10) gut und eine hohe Virusverdünnung (1: 100.000) gut. Verwenden von Schritt 2.8 erhalten Virus-Lösungen.
3. Entfernen Sie alle Medien auf dem fünften Tag und waschen die Zellen zweimal mit 1x PBS (pH 7,4).
4. Fixierung der Zellen mit kaltem 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 30 min.
5. Gib 500 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu den Zellen und waschen sie für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Dreimal Waschen Sie die Zellen.
6. Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 zu den Zellen, um sie zu permeabilisieren. Lassen Sie sich für 10 min bei RT.
7. Wasche die Zellen erneut, wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben.
8. Gib 500 ul einer 5% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung zu den Zellen bei RT blockieren. Lassen Sie sitzen für 2 Stunden und dann zu entfernen.
9. Verdünnen Lager Rhodamin rot-Phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS mit 5% BSA und 250 ul der Verdünnung auf jeweils gut Färbung für F-Aktin.
10. Abdeckplatte aus Aluminium fÖl, um den Farbstoff aus Bleich verhindern und Inkubation Zellen bei 4 ° CO / N.
11. Entfernen Sie die RCP nach 12 h Inkubation und ersetzen Sie es mit 250 ul 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (250 ug / ml) in 1x PBS mit 5% BSA, um die Kerne der Zellen zu färben .
12. Inkubieren der Zellen mit DAPI bei RT für 1 Stunde.
13. Waschen Zellen dreimal mit 1x PBS wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben.
14. Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen und montieren auf Objektträger mit einer Montage Medien mit einer Anti-Fade Reagenz.
15. Die Objektträger trocknen in lichtdichten Kästen, bis unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet. Ansicht Präparate so bald wie möglich als Farbstoffe schnell verblassen.
16. Bild gefärbten Zellen mit einem konfokalen System mit einem Mikroskop, das eine 63X (Öl) Plan-apochromate Objektiv ausgestattet.
    1. Stellen Sie die Laserwellenlängen um 543 ± 10 nm Anregung und 575 ± 10 nm Emissions für Rhoadmine rot-conjucated Phalloidin, Und 369 ± 10 nm Anregung und 450 ± 30 nm Emissions für DAPI.
    2. Identische Verstärkung und Offset-Einstellungen für den Detektor, um alle Bilder zu erhalten.
    3. Prozessbilder mit Hilfe geeigneter Software für die Bildverarbeitung und Sortierung und Import gewünschten Bilder in eine Bildverwaltungssoftware.

Ergebnisse

Zellwachstums wurde innerhalb von 48 h Durchgang in kleinen und großen Kulturflaschen aus Primärkulturen und setzte Passagen gesehen. Fibroblasten-Wachstum und die Entwicklung wurde auch innerhalb dieses Zeitrahmens beobachtet. Wenn neu ausgesät Kolben wurden vor 48 Stunden gestört, gab es eine sichtbare Rückgang der Zellhaftung, was zu langsameren wachsenden Kulturen und manchmal keine Bindung oder das Wachstum überhaupt. Zellen wurden etwa 80% konfluente innerhalb einer Woche nach der Übergabe und eine Monoschi...

Diskussion

Steigende Besorgnis über den Zustrom von invasiven landwirtschaftlichen Arten haben zu einer erhöhten Nachfrage nach neuen Methoden, um gegen neue Schädlinge und Krankheitserreger zur Wehr zu führen. Ein Schwerpunkt der Krankheitsprävention und-Management umfasst die Verwaltung von Vektoren und Krankheitserreger war das primäre Ziel dieser Studie. Wirtschaft spielen eine wichtige Rolle bei der Entscheidung, diese Art von Erreger zu Biopestizid Vektoren in der Landwirtschaft verwalten, weil die praktische Anwendung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution	Sigma Aldrich	T4049	0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48 wells (TC treated with lid)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water
TRIzol LS	Life Technologies	10296-028
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	For electrophoresis
Ethidium bromide	Sigma Aldrich	E7637	BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick	Qiagen	28704
QuantiTect qRT-PCR kit	Qiagen	204243
4% paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	Reagent grade, crystalline
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphate buffered saline
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin	Life Technologies	R415	Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
ProLong Gold Antifade Reagent	Life Technologies	P36934
LSM510 Meta Confocal System	Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software	Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ glutamine)	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ leafhopper medium component
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	H2G+ leafhopper medium component
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ leafhopper medium component