Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

Riepilogo

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Abstract

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis) è un insetto estremamente polifago vagili e presente in tutto il sud-ovest degli Stati Uniti. Questi insetti sono i vettori predominanti di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), un batterio xilema limitata che è l'agente causale della malattia di Pierce (PD) della vite. Malattia di Pierce è economicamente dannoso; così, H. vitripennis sono diventati un bersaglio per le strategie di gestione del patogeno. Un dicistrovirus identificato come virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) è stata associata a un aumento della mortalità in H. popolazioni vitripennis. Perché una cellula ospite è necessaria per la replica HoCV-01, coltura cellulare fornisce un ambiente uniforme per la replica mirato che è logisticamente ed economicamente importante per la produzione di bio-pesticida. In questo studio, un sistema per la propagazione su larga scala da H. vitripennis cellule tramite coltura tissutale è stato sviluppato, providing un meccanismo di replicazione virale. HoCV-01 è stato estratto da insetti di tutto il corpo e utilizzato per inoculare H. colta vitripennis cellule a diversi livelli. Il terreno di coltura è stato rimosso ogni 24 ore per 168 ore, RNA estratto e analizzato con qRT-PCR. Le cellule sono state colorate con blu trypan e contati per quantificare la capacità di sopravvivenza delle cellule mediante microscopia ottica. Particelle virali intere sono stati estratti fino a 96 ore dopo l'infezione, che è stato il punto di tempo determinato per essere prima totale coltura cellulare crollo si è verificato. Le cellule sono state inoltre sottoposte a colorazione fluorescente e visualizzati mediante microscopia confocale per indagare l'attività virale su attaccamento e nuclei integrità F-actina. La conclusione di questo studio è che H. vitripennis cellule sono in grado di essere colta e utilizzata per la produzione di massa di HoCV-01 a un livello adeguato a consentire la produzione di un biopesticida.

Introduzione

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis Germar 1821) è stata identificata come il vettore predominante di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agente causale della malattia di Pierce della vite (PD) in Nord America ^1. Insetto gestione della popolazione è rapidamente diventato il centro della ricerca per combattere questo problema devastante per il settore della viticoltura in California e in tutto il sud degli Stati Uniti. Un positivo-senso, virus a RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) è stata identificata in H. selvatici popolazioni vitripennis e dimostrato di aumentare la mortalità in quelle popolazioni ^2-4, riducendo al contempo la resistenza degli insetti agli insetticidi.

Sviluppo di metodi per efficacemente posteriore infetto H. vitripennis all'età adulta in un ambiente di laboratorio sono stati difficili perché H. vitripennis hanno diverse esigenze nutrizionali specifiche fasi che richiedono una grande varietà di piante ospiti ^5-8. Strutture specifiche sono richieste per posteriore H. vivo vitripennis negli Stati Uniti; Pertanto, coltura cellulare è più economico e una possibile alternativa, così come sempre più vitale per HoCV-01 rilevazione e replicazione ^2,9. Mentre i metodi di base per stabilire colture cellulari di H. vitripennis sono descritti, questi metodi non sono ancora stati utilizzati per la produzione commerciale di agenti di controllo biologico, come ad esempio i virus ^2.

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di produrre una elevata concentrazione di HoCV-01 adatto per l'utilizzo come agente di controllo biologico. Replicazione virale richiede una cellula vivente, che è il motivo per cui coltiva con successo e l'ottimizzazione H. vitripennis culture è fondamentale per il progresso di produrre livelli redditizi di virus.

Protocollo

Cultura 1. cellulare

NOTA: linee cellulari Homalodisca vitripennis stabiliti dal laboratorio Dr. Wayne Hunter presso l'USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) sono stati utilizzati per avviare un magazzino laboratorio composto da fasi cellulari misti inclusi i fibroblasti ei monostrati iniziali.

1. Eseguire le seguenti procedure in un ambiente di laboratorio sterile mantenuta ad una temperatura compresa tra 20-24 ° C con 25 cm ² fiasche di coltura.
2. Coltivare e mantenere le culture in 25 cm ² fiasche di coltura tissutale utilizzando H2G + Leafhopper medio, una versione modificata del supporto api WH2 ¹⁰ (Tabella 1).
3. Incubare fiasche di coltura a 24 ° C con il ~ 53% di umidità.
4. Utilizzare un microscopio invertito a un ingrandimento totale (TM) di 100X per monitorare la crescita della cultura, ad esempio, controllare l'eventuale crescita cellulare anormale, monitorare eventuali contaminanti potenziali, e verificare i progressi di crescita in tutto il culsuperficie tura.
5. Eseguire un cambiamento di terreno completo (~ 4 ml di terreno di coltura per bombola) ogni 7 - 10 giorni senza disturbare la superficie cultura.
6. Passare culture quando la superficie cultura è circa l'80% coperto da crescita cellulare (confluente) con 0,25% di tripsina contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per dissociare le cellule. Aggiungere ~ 2 - 3 ml di tripsina per ciascun pallone di coltura e di esporre la cultura (s) per l'enzima per brevi periodi di tempo (5-10 minuti) per raggiungere dissociazione cellulare completo.
7. Aggiungere una quantità uguale di mezzo fresco al pallone di coltura (s) (~ 2 - 3 ml) per arrestare l'attività enzimatica e trasferire l'intera soluzione in una provetta per centrifuga.
8. Cellule pellet per centrifugazione a 4 ° C per 6 min a 350 x g.
9. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di cellule e aggiungere ~ 8 ml di terreno fresco ad ogni provetta. Omogeneizzare delicatamente cellule utilizzando una pipetta.
10. Culture Split in un rapporto 1: 2 per 25 centimetri ² palloni (~ 4 ml di soluti cellularesu ogni pallone) e lasciare culture appena passati indisturbati per 48 ore per permettere le cellule in sospensione per fissare saldamente alla superficie del pallone.
    NOTA: La coltivazione di cellule in 48 pozzetti piastre di coltura tissutale sterili con una superficie di crescita di 1 cm ² è anche possibile e che può essere mantenuta allo stesso modo come fiasche di coltura con una riduzione del volume di terreno di coltura per ~ 250 microlitri.

2 Estrazione Virus intero

1. Omogeneizzare corpi interi di virus H. positivo vitripennis in tampone fosfato, pH ~ 7.2, con 0,02% di sodio triidrato dietilditiocarbamato (DETCA) di vortex per ~ intervalli di 10 sec fino a quando non ci sono più grandi ciuffi di tessuto presente. Estrarre virus via SuperSpeed ​​centrifugazione a 124.500 xg per 4 ore a 4 ° C o 22.000 xg per 16 ore a 4 ° C. Se si forma un precipitato nella parte superiore, rimuoverlo con un tampone di cotone sterile ^11.
2. Eliminare il surnatante.
3. Raccogliere il pellet esciogliere con 5 ml di 10 mM tampone fosfato (senza DETCA), pH ~ 7,2, contenente lo 0,4% di acido Na-deoxycholic e 4% etere di glicole polietilenico esadecile (Brij 52).
   1. Mescolare bene il pellet, rimuovere il pellet dal lato del tubo e schiacciare fino in soluzione, se necessario.
   2. Aggiungere più 10 mM tampone fosfato in ~ incrementi di 5 ml per aiutare il pellet va in soluzione, se necessario, e si combinano in 2 tubi ^11.
4. Centrifugare la soluzione a 300 xg per 15 min ^11.
5. Rimuovere il surnatante e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micron, e raccogliere il filtrato in provetta grande collezione ^11.
6. Trasferimento filtrato ad una membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato (MWCO) di 3,5 kD, utilizzando piccole quantità di tampone fosfato 10 mM (pH 7) non contenente DETCA se necessario ^11.
7. Posizionare la membrana di dialisi in un grande bicchiere pieno di DDH ₂ O a 4 ° C. Modificare il DDH ₂ O ogni ora fo 5-6 ore, fino a quando un bianco precipitato nella membrana ^11.
8. Raccogliere il virus purificato dal di dentro la membrana e sottoporre la soluzione virus al 100% per una serie di diluizioni di 10 volte con l'aggiunta di 10 ml di soluzione a 90 ml di DDH ₂ O. Successivamente, aggiungere 10 ml della diluizione per altri 90 ml di DDH ₂ O fino a raggiungere una diluizione di 1: 100.000.
9. Soluzione virus Conservare a -80 ° C.

3 replicazione virale

1. Cellule seme in piastre di coltura 48 pozzetti e crescono tutte le righe fino a quando la crescita cellulare è di 80% confluenti (circa il post-passa 72 ore se le cellule stanno crescendo a un tasso medio).
2. Inoculare ciascuna riga di celle con il virus diluito seriale volta la crescita cellulare raggiunge la confluenza, cioè, una riga di una diluizione 1:10, una riga di una diluizione 1: 100, ecc, ad eccezione della fila superiore. Utilizzare la riga superiore come controllo e aggiungere 10 ml di DDH ₂ O a ciascun pozzetto come controlli del volume.
   1. Al fine di stabilire una concentrazione di partenza del cellulare di base per il confronto con conta di cellule sperimentali, dissociare e contare il primo pozzo di ogni riga prima della inoculazione iniziale di eventuali pozzi nelle culture con il virus.
3. Monitorare piastre di coltura ogni 24 ore dopo l'inoculazione virale per qualsiasi cambiamento di colore nel terreno che indica un cambiamento di pH e di eventuali modifiche di morfologia cellulare.
4. Immagine una colonna della piastra di prova in ogni punto di tempo, utilizzando un microscopio invertito a 100X TM.
5. Rimuovere tutti i media dalla colonna che è stato ripreso in ogni punto di tempo di 24 ore e conservarla a breve termine a -20 ° C per l'estrazione dell'RNA e la quantificazione virale o lungo termine a -80 ° C.
6. Dissociare le cellule dai pozzetti dopo la rimozione del mezzo come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,9, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco di fermare l'attività enzimatica e ~ 250 ml di mezzo fresco di ri-sospendere la pelle cellat.
7. Aggiungere 10 ml di 0,4% trypan blu macchia in ogni provetta contenente le cellule per eseguire la conta delle cellule dopo la dissociazione delle cellule per ogni periodo di 24 ore più di una settimana. Lasciare macchia riposare per 10 minuti prima di eseguire la conta delle cellule.
   1. Eseguire la conta delle cellule entro 1 ora di esposizione a macchiare o cellule vitali inizierà ad assorbimento macchia così come le cellule non vitali.
8. Aggiungere lentamente 10 ml di soluzione di cellule macchiata a ogni lato di un emocitometro standard utilizzando una micropipetta. Lasciare la soluzione da adottare da un'azione capillare per evitare bolle d'aria.
9. Contare il numero di (non tinto), le cellule vitali su entrambi i lati del emocitometro (l'equivalente di 4 conteggi delle 16 piazze del emocitometro). Eseguire la conta delle cellule per ciascun pozzetto della colonna che è stato rimosso.
10. Calcolare la media dei conteggi di cella da ogni colonna e utilizzare la seguente formula per ottenere il numero totale conta delle cellule: (numero medio di cellule / 4) x fattore di diluizione = numero di cellule x 10 ^{4 ml. Questa è la densità cellulare o il numero di cellule vitali in coltura.}

4. Virus Estrazione da coltura cellulare

1. Rimuovere trattati H. vitripennis cellule da fiasche di coltura come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,8, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco per fermare l'attività enzimatica.
2. Eliminare il surnatante.
3. Estratto virus dalle cellule di coltura seguendo il protocollo precedentemente descritto nei passaggi 2,3-2,8.

5. RNA Estrazione

1. Estrarre l'RNA da campioni medie raccolti durante ogni prova di virus di una settimana con un estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio guanidina progettato per campioni liquidi per il protocollo del produttore.
2. Conservare estratto campioni a -80 ° C.

6 RT-PCR

1. Stabilire norme virali per RT-PCR eseguendo PCR tradizionale con ilcoppia di primer HoCV RT-PCR Primer 1 (forward 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-inversione ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') con il virus isolato da tutto il corpo H. vitripennis.
2. Oggetto del prodotto PCR per gel elettroforesi per 60 min a 120 V in un gel di agarosio al 2% contenente 0,1% di bromuro di etidio.
3. Accise le bande dal gel e purificare utilizzando un kit di estrazione di gel secondo il protocollo del produttore.
4. Pool tutti asportato e gel purificato prodotto e purificare ulteriormente per precipitazione di base di etanolo. Eluire il prodotto precipitazioni in circa 30 ml di Tris EDTA (TE) per aumentare la concentrazione complessiva del campione.
5. Quantificare il livello di cDNA in campioni aggregati mediante spettrofotometria con 260/230 impostazioni di lunghezza d'onda per il rilevamento degli acidi nucleici.
6. Eseguire una serie di diluizioni seriali di dieci volte del campione purificato che vanno da 57 ng / ml a 57 ag / ml (10 ^-18). Eseguire la diluizione seriale simile a quella descritta in 2.8 con rettifiche apportate per la differenza nei requisiti di concentramento.
7. Determinare i limiti di rilevazione delle serie di diluizioni eseguendo qRT-PCR utilizzando un kit qRT-PCR con quantificazione affidabile di trascritti bassa abbondanza.
   NOTA: le concentrazioni virali inferiori a 5 x 10 ^-3 copie non sono rilevabili.
8. Estrarre l'RNA da campioni sperimentali come descritto in precedenza al punto 5.1 e quantificare con spettrofotometria.
9. Normalizza tutti i campioni estratti a 5 ng / ml con acqua priva di nucleasi.
10. Eseguire qRT-PCR su tutti i campioni, in duplicati, come le reazioni di 25 microlitri utilizzando un one-step kit qRT-PCR con la capacità di percepire basso numero di copie come segue: 50 ° C premuto per 10 min; 95 ° C in attesa per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec; fondere 50-99 ° C per 5 sec su ogni passo.
    1. Rendere il master mix in modo che ogni miscela di reazione contiene 12,5 ml di maste 1xmix R, 1,0 ml (0,3 micron) di primer in avanti, 1,0 ml (0,3 micron) di primer reverse, 0,25 ml di trascrittasi inversa e di quantità variabili di modello in base ai valori di normalizzazione.
    2. Portare il volume totale di reazione a 25 ml con acqua priva di RNasi.
    3. Includi cinque concentrazioni standard in ogni PCR eseguiti con i seguenti numeri di copie: 5 x 10 ^-10, 5 x 10 ^-8, 5 x 10 ^-6, 5 x 10 ^-4, e 5 x 10 ^-2 copie. Impostare la soglia per ogni corsa appena sotto una fluorescenza di 10x ^-2.5 per ridurre il rumore durante l'acquisizione anticipata all'inizio di ogni esecuzione.

7 Microscopia confocale

1. Crescere cellule Homalodisca vitripennis in dodici piatto contenente anche vetrini di misura 18 mm di diametro in ciascun pozzetto.
2. Seminare una colonna sul piatto ogni 24 ore per un periodo di quattro giorni, una volta un monostrato è raggiunto. Assicurarsi che ogni column contiene un controllo bene, una diluizione virale bassa (1,10) bene e una diluizione virale elevata (1: 100.000) bene. Utilizzare soluzioni antivirus ottenute dal punto 2.8.
3. Rimuovere tutti i supporti il ​​quinto giorno e lavare le cellule due volte con PBS 1x (pH 7,4).
4. Fissare le cellule con freddo 4% paraformaldeide a 4 ° C per 30 min.
5. Aggiungere 500 ml di 1x tampone fosfato (PBS) per le cellule e lavare per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità. Lavare le cellule tre volte.
6. Aggiungere 500 ml di 0,1% Triton X-100 per le celle a permeabilize loro. Lasciate riposare per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Lavare le cellule di nuovo come precedentemente descritto al punto 7.5.
8. Aggiungere 500 ml di una soluzione al 5% albumina sierica bovina (BSA) per bloccare le cellule a temperatura ambiente. Lasciare riposare per 2 ore e poi rimuovere.
9. Diluire magazzino Rhodamine falloidina rosso-coniugato (RCP) 1: 250 in 1x PBS contenente 5% di BSA e aggiungere 250 ml di diluizione per ciascun bene a macchia di F-actina.
10. Piastra di copertura in alluminio folio per evitare che il colorante da sbianca e incubare le cellule a 4 ° CO / N.
11. Rimuovere la RCP dopo 12 ore di incubazione e sostituirlo con 250 ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (250 mg / ml) diluito in 1x PBS contenente 5% di BSA, a macchiare i nuclei delle cellule .
12. Incubare le cellule contenenti DAPI a temperatura ambiente per 1 ora.
13. Lavare le cellule tre volte con PBS 1x come precedentemente descritto al punto 7.5.
14. Rimuovere delicatamente i coprioggetti dai pozzetti e montare per vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio con un reagente anti-sbiadimento.
15. Lasciare i vetrini si asciughino in scatole a tenuta di luce fino visti al microscopio confocale. Vedi Vetrini Preparati al più presto come coloranti possono svanire rapidamente.
16. Immagine macchiato cellule utilizzando un sistema confocale equipaggiato con un microscopio contenente una lente 63X (olio) piano-apochromate.
    1. Impostare le lunghezze d'onda laser a 543 ± 10 nm di eccitazione e 575 ± 10 nm di emissione per Rhoadmine falloidina rosso-conjucated, E 369 ± 10 nm di eccitazione e 450 ± 30 nm di emissione per DAPI.
    2. Utilizzare guadagno identici e impostazioni partì-per il rilevatore di ottenere tutte le immagini.
    3. Immagini di processo utilizzando il software appropriato per l'elaborazione delle immagini e di smistamento e immagini di importazione desiderato in un software di gestione delle immagini.

Risultati

Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio in piccole e grandi fiasche di coltura, da colture primarie e continui passaggi. Crescita dei fibroblasti e sviluppo è stata osservata anche in questo lasso di tempo. Quando fiaschi appena seminati sono stati disturbati prima di 48 ore, c'è stato un calo visibile in adesione cellulare, portando a culture crescita più lenti ea volte senza attaccamento o di crescita a tutti. Le cellule sono state circa il 80% confluenti entro una settima...

Discussione

L'aumento preoccupazioni per quanto riguarda l'afflusso di specie invasive agricole hanno portato ad un aumento della domanda di nuove metodologie per la difesa contro i parassiti e patogeni emergenti. Un focus di prevenzione e gestione della malattia comporta la gestione di vettori patogeni ed era l'obiettivo primario di questo studio. Economia svolgono un ruolo fondamentale nella decisione di produrre questo tipo di biopesticida per gestire vettori di patogeni in agricoltura perché l'applicazione prat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution	Sigma Aldrich	T4049	0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48 wells (TC treated with lid)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water
TRIzol LS	Life Technologies	10296-028
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	For electrophoresis
Ethidium bromide	Sigma Aldrich	E7637	BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick	Qiagen	28704
QuantiTect qRT-PCR kit	Qiagen	204243
4% paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	Reagent grade, crystalline
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphate buffered saline
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin	Life Technologies	R415	Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
ProLong Gold Antifade Reagent	Life Technologies	P36934
LSM510 Meta Confocal System	Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software	Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ glutamine)	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ leafhopper medium component
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	H2G+ leafhopper medium component
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ leafhopper medium component