JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Abstract

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Introduction

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. اليرقية تربية من اثنين A. المجموعات الضنك إلى سن الرشد

  1. تعيين اثنين خزانات الضوئية مع الإضاءة القابلة للبرمجة في 21 درجة مئوية لمدة الأمثل السكون التعبير 16 والرطوبة النسبية حوالي 80٪.
    1. برنامج مجلس الوزراء واحد ل16L: ضوء 8D: دورة الظلام (غير السكون الذي يحفز LD الضوئية). تعيين مجلس الوزراء الثاني ل8L: 16D ضوء: دورة الظلام (السكون حمل) 13.
    2. "أضواء على 'برنامج في نفس الوقت في كل من خزائن لمزامنة الوقت الساعة البيولوجية بين الفترات الضوئية.
  2. حساب كمية من البيض اللازمة لأداء التجربة. تهدف ل300-500 بيضة في القفص. ما لا يقل عن ثلاثة تكرار أقفاص السكون وثلاثة تكرار هناك حاجة إلى أقفاص غير الكمون لتوليد RNA. هذه المجاميع إلى كاليفورنيا. 1،800-3،000 البيض في التجربة.
    1. يفقس البيض عن طريق غمر أوراق البيض في كاليفورنيا. 500 مل من H 2 O. منزوع الأيونات
    2. إضافة <م> كاليفورنيا. 1 مل الطين المواد الغذائية التي تتكون من الكلب الأرض الغذاء والماء المالح الروبيان كما هو موضح سابقا 24. تغطية الحاويات مع شبكة، والحفاظ على شبكة في مكان مع الشريط المطاطي.
    3. ضع في مجلس الوزراء LD الضوئية لكاليفورنيا 24 ساعة.
  3. نقل اليرقات إلى 10 × 10 × 2 سم بيتري أطباق مليئة كاليفورنيا 90 مل منزوع الأيونات H 2 O.
    1. الحفاظ كاليفورنيا 30 يرقات لكل طبق. نقل اليرقات لتنظيف الأطباق كل 48-72 ساعة، على سبيل المثال في أيام الاثنين والأربعاء، والجمعة (MWF) 24.
    2. تغذية كاليفورنيا 1 مل الطين المواد الغذائية التي تتكون من الكلب الأرض الغذاء والماء المالح الروبيان في المياه منزوع الأيونات كل MWF كما سبق وصفها 24.
  4. انشاء 03:57 أقفاص الكبار لكل معاملة الضوئية، حيث يضم كل قفص لتكرار البيولوجي.
    1. من جانبي 9.5 L الدلاء، وقطع واحد 10-ب-14 سم حفرة، وثقب آخر مع 15 سم القطر. شركةVER الأول مع شبكة. قطع ما يقرب من طول القدم لتخزين العظام، والغراء طرف واحد في جميع أنحاء داخل حفرة أخرى.
    2. قطع نهاية سفح تخزين وإيقاف عقدة مغلقة - مفتوحة فقط عند الحاجة الوصول إلى المناطق الداخلية من القفص. لغطاء القفص، وقطع من كل من الداخلية، ولم يتبق سوى الحافة، واستبدال البلاستيك الداخلية مع شبكة 24.
    3. لاحظ الضوئية، وتكرار العدد، قفص تاريخ البدء، وغيرها من المعلومات ذات الصلة إلى التجربة مع علامة دائمة على جانب القفص.
  5. تبطن الجزء السفلي من أقفاص الكبار مع ورق الترشيح الرطب. بلل ورقة الترشيح مع ما يكفي منزوع الأيونات H 2 O لزيادة الرطوبة المحلية في القفص، ولكن تجنب المياه الراكدة، والتي يمكن أن تحفز وضع البيض على ورقة الترشيح 24. تحقق من ورقة الترشيح يوميا لمدة التجفيف، وإعادة الرطب عند الضرورة.
  6. لإنتاج البيض كافية لمكتبة RNA، وتشمل على الأقل 100 إناث / 9.5 L كاليفورنياجنرال الكتريك، مع عدم وجود أكثر من 500 البعوض في القفص.
  7. جمع MWF الشرانق وضعها في كوب صغير من H 2 O نظيفة في كثافة لا يزيد عن 50 الشرانق في 25 مل H 2 O. نقل كوب الشرانق إلى قفص الكبار. مكان أقفاص في مجلس الوزراء الضوئية منها - A. الضنك الشرانق وحساس 15.
  8. ضمان اليومية ان H 2 O في أكواب غير نظيفة وواضحة، وإزالة الشرانق ميت، لأن تراكم الشرانق ميت يمكن أن يسبب النفوق الجماعي. إزالة H 2 O أكواب بعد ظهور كل الشرانق.
  9. وضع الزبيب العضوية على شبكة العليا من القفص لتوفير السكر للبالغين ظهرت. مراقبة الزبيب، وتغييرها كل 3-5 أيام لمنع تراكم العفن.

2. صيانة الكبار إلى السماح التزاوج وإنتاج البيض

  1. الحفاظ على أقفاص في الرطوبة العالية (حوالي 80٪) من بطانة أسفل القفص مع ورق الترشيح رطبة، وتوفير الوصول إلى الزبيب غير متعفن، كما هو موضح أعلاه (Sectiإضافات 1.5 و 1.9).

3. الدم التغذية

  1. الاستعداد للإناث الدم التغذية بين يومين إلى ستة أيام بعد eclosion لضمان أن الإناث قد تعرضت لثمانية أيام على الأقل قصيرة لا لبس فيها، قبل أن يبدأ وضع البيض لنحو 100 بيضة٪ السكون 14.
  2. إعداد نظام تغذية Hemotek غشاء. قم بتوصيل وحدة التغذية في امدادات الطاقة. ضبط درجة الحرارة كل وحدة إلى 37 درجة مئوية باستخدام المسمار تعديل. استخدام مقياس الحرارة الالكتروني والتحقيق لقياس درجة حرارة وحدة التغذية أثناء المعايرة.
  3. إعداد الخزان وجبة. تمتد مربع من غشاء الكولاجين التغذية خلال فتحة الخزان وجبة وضمان الحصول عليها مع يا الدائري. سحب بعناية الزوايا لإزالة التجاعيد. تقليم الغشاء الزائدة مع مقص.
    ملاحظة: غشاء الكولاجين قد لا تعمل بشكل جيد لجميع أنواع البعوض، وأنه قد يكون من الضروري محاولة عدة أنواع للعثور على غشاء الأمثل إذا كان يعمل معالأنواع الأخرى من A. الضنك. بارافيلم يعمل بشكل جيد مع بعوض الكيولكس.
    1. إذا تم تخزين الدم المجمدة، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل استخدام.
    2. عقد الخزان ذلك الغشاء لأسفل، غير معتمد، والموانئ ملء تواجه ما يصل. استخدام ماصة نقل أو حقنة لملء الخزان مع ما يقرب من 3 مل من الدم الكامل من الدجاج الذي لديه سترات الصوديوم بوصفها مضادة للتخثر. ختم ملء الموانئ مع المقابس مصنوعة من البلاستيك.
  4. إرفاق أعدت الخزان إلى وحدة التغذية من قبل الشد وضعها على مسمار على لوحة نقل الحرارة على الجزء السفلي من وحدة التغذية. عكس وحدة التغذية ووضعه على أعلى القفص، جنبا غشاء أسفل، بحيث البعوض يمكن أن تغذي من خلال شبكة من القفص. حافظ على وحدة التغذية في قفص لمدة 45 دقيقة لتحقيق أقصى قدر من التغذية.

4. الحث على وضع البيض

  1. أربعة إلى خمسة أيام بعد انتهاء وجبة الدم وتجهيز كل قفص مع الظلام الملونة 50 مل جحتى اصطف مع غير مقصور رقة إنبات البذور (ورقة البيض) أو بمادة منشفة غير ابيض الورق وملء منتصف الطريق مع الماء منزوع الأيونات 9. إذا كان أكثر من 250 البعوض هي في قفص، استخدم كوبين.
    ملاحظة: للحصول على أقفاص صغيرة أو قنينة واحدة من الإناث، "ضخ القش" في حاويات وضع البيض قد يزيد وضع البيض بسبب رائحة النباتات الجرثومية 25.

5. جمع وتخزين البيض

  1. بدء جمع البيض في غضون 4-5 أيام من تغذية الدم لإنتاج البيض قمم عادة بعد حوالي خمسة أيام التغذية الدم، ومن ثم ينحسر خلال الاسبوع المقبل.
  2. تختلف وتيرة جمع البيض على الضروريات من التجربة. لأغراض عامة، وجمع الأوراق البيض على جدول زمني MWF. إزالة الأوراق البيض من كل قفص واستبدالها مع ورقة جديدة. ضع أوراق إزالتها مؤخرا في أطباق بتري وتخزينها في SD مجلس الوزراء الضوئية لتجنب آثار الخلط من تخزين البيض.
  3. السماح الأوراق البيض لإعادة الرئيسية الرطب لمدة 2 أيام بعد وضع البيض للسماح بتشكيل المصلي بشرة، والذي يزيد من مقاومة جفاف البيض 26.
  4. ما يقرب من 48 ساعة جمع آخر، والبيض الجافة في الهواء الطلق. تجفيف الورق مثل أنه يعرج ورطبة قليلا لمسة، ولكن ليس الرطب حتى أن ورقة مظلمة من H 2 O أو يحفز الفقس من البيض.
    ملاحظة: "× 4" ورقة 6.5 قد يستغرق حوالي 3.5 ساعة لتجف. الحرص على عدم الإفراط في تجفيف أوراق البيض، لأن ذلك سيؤدي إلى تجفيف البيض 27.
  5. احتياطي البيض إضافية من كلا LD وSD الضوئية لتقييم حالات السكون وتفسير تأثير دور التعرض للضوء (انظر قياس الكمون، القسم 6).
  6. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على الأوراق البيض في 21 ° C وحوالي 80٪ الرطوبة في أطباق بتري. حافظ على أطباق بتري في حاوية تخزين تثبرور مع قارورة من الماء للحفاظ على رطوبة المحلية والتطور الجنيني يأخذ أربعة إلى خمسة أيام في 21 ° C.
ove_title "> 6. قياس الكمون الإصابة

  1. استخدام أجنة محفوظة إضافية (انظر تحفيز وضع البيض، القسم 4) التي هي 7-20 يوما من العمر لقياس استجابة السكون.
  2. تسجيل عدد من البيض موجودة على كل ورقة بيضة.
  3. تحفيز البيض ليفقس من قبل غمر تماما أوراق البيض الفردية في طبق 90 مل بيتري مع ما يقرب من 80 مل H 2 O. منزوع الأيونات إضافة ما يقرب من 0.25 مل الطين الغذاء.
  4. بعد 24 ساعة حصر عدد الفقس الأولى يرقات العمر. وضع طبق بتري على سطح أسود لتصور اليرقات ووضع مصدر الضوء على جانب واحد من الطبق. سوف اليرقات الابتعاد عن مصدر الضوء، والسماح لرصيده واضح لليرقات الفردية. إزالة اليرقات الفردية مع ماصة في حين عد لمنع سرد اليرقات الفردية.
  5. أوراق مكان البيض في طبق بيتري جديدة وإعادة الجافة. إعادة يفقس البيض بعد ~ 1 الأسبوع، ومرة ​​أخرى تتطابق البيض تحاك باستخدام الأسلوب أعلاه.
  6. أوراق مكان البيض مع ش المتبقية البيض ن تحاك في أطباق بتري جديدة 90 مل مع ما يقرب من 80 مل تبيض حل 28. تأكد من أن الأوراق البيض ومغمورة تماما في الحل تبيض وترك بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان لتجنب رائحة التبييض.
    ملاحظة: التبييض حل يمكن تخزينها ل~ 1 أسبوع في 4 درجات مئوية، ولكن ينبغي على خلاف ذلك أن تدلي جديدة.
  7. تفقد البيض باستخدام المجهر الضوئي كما تبيض سوف مسح المشيمه والسماح التصور للأجنة والبيض من الامم المتحدة وتفقس. إذا تم أجنة البيض، فإن البيض يكون لها لون من البيض مع عيون الظهور عن اثنين من النقط السوداء الصغيرة عكس بعضها البعض على الجانب الظهري. حصر عدد من الامم المتحدة وفقست، البيض المحتوي 13.
  8. تحديد حالات السكون مع الصيغة التالية:٪ السكون = لا. البيض المحتوي الامم المتحدة التي تحاك / (رقم بيض فقس + رقم البيض من الامم المتحدة وتحاك المحتوي) × 100 (13).

7. استخراج الحمض النووي الريبي من البيض / pharate يرقات

ontent "> ملاحظة: استخدام Trizol في غطاء تدفق الصفحي.

  1. فرشاة بيض البعوض التي تحتوي على أجنة نامية أو يرقات pharate في نقاط زمنية تنمية متميزة من الأوراق البيض إلى المطاحن الزجاج باستخدام فرشاة شعر الجمل. طحن البيض في Trizol (1 مل لكل 50-100 ملغ من الأنسجة) حتى المسحوق تماما. استخدام لا يقل عن 400 بيضة في مكتبة لانتاج RNA كافية.
    1. بدلا من ذلك، والمفاجئة البيض تجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية في أنابيب microcentrifuge لمدة تصل إلى شهر قبل طحن في Trizol.
  2. أداء استخراج الحمض النووي الريبي في Trizol تليها الأيزوبروبانول هطول الأمطار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  3. علاج مقاعد البدلاء مع حل ريبونوكلياز إزالة التلوث أو غيرها من العوامل لإزالة أي nucleases المتبقية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
    1. علاج الحمض النووي الريبي المستخرج مع الدناز. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، احتضان عينات الحمض النووي الريبي مع الدناز لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. استخدام 1 & #181؛ ل الدناز لمدة تصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل 50 ميكرولتر. زيادة كمية الدناز إذا كان هناك أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في رد فعل واحد.
    2. تعطيل الدناز عن طريق إضافة 5 ميكرولتر الدناز علقت تعطيل كاشف. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والخلط ثلاث مرات خلال فترة الحضانة (vortexing لطيف).
    3. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1.5 دقيقة. نقل طاف تحتوي على عينات الحمض النووي الريبي المعالجة لأنابيب جديدة لخطوات لاحقة.
  4. تقييم نوعية من مجموع عينات الحمض النووي الريبي عن طريق قياس التألق. إرسال العينات إلى مرفق التخصص مع أداة المناسب لهذه المهمة. ومرفق أداء على رقاقة الكهربائي للهلام لتحديد أحجام الأنواع RNA في العينة، التي تصور صبغة الفلورسنت تغرس في رقاقة. سيتم إرجاع النتائج باعتبارها رحلاني.
    1. تحديد سلامة من مجموع عينات الحمض النووي الريبي عن وجود أو عدم وجود نواتج التحلل، كما يتضح من س جودالقمم و بين 18S و5S قمم RNA الريباسي على رحلاني الناتجة (الشكل 1B).

8. RNA تسلسل

  1. إرسال مجموع عينات الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية بما فيه الكفاية (الشكل 1A) وكمية (عادة> 3 ميكروغرام في المكتبة) إلى مركز تجاري تسلسل لبناء أثرى المكتبات مرنا تقرن نهاية ومرنا التسلسل، بعد البروتوكولات القياسية.
  2. في حالة استخدام حارة أكثر من واحد للتسلسل تجربة واحدة، وتقسيم المكتبات الفردية إلى مسربين لتسلسل لحساب التباين التقني فيما بين الممرات خلال التسلسل.

9. lllumina مقروءة تنظيف

ويلخص الشكل 2 الجزء المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول: ملاحظة. للحصول على قائمة كاملة لجميع البرامج والموارد المستخدمة في قسم المعلوماتية الحيوية من هذا البروتوكول، والرجوع إلى الجدول 1. وفيبالإضافة إلى ذلك، الملف التكميلي 1 يحتوي على أمثلة سطر الأوامر لكل من المعلوماتية الحيوية الخطوات التالية البروتوكول.

  1. استخدام ssaha2 29 (الجدول 1) لتحديد مباريات٪ هوية 95 أو أعلى لقاعدة البيانات NCBI UniVec الأساسية (الجدول 1)، A. الضنك تسلسل الرنا الريباسي (بنك الجينات # L22060.1)، ومحولات التسلسل (أمثلة مفصلة سطر الأوامر المتوفرة في ملف إضافي 1). إزالة أزواج القراءة مع المباريات باستخدام بيرل أو أداة البرمجة مماثلة، على سبيل المثال من خلال تكييف بيرل النصي المقدمة (ملف التكميلي 2).
  2. نظيفة المتبقية يقرأ مع الحزمة SolexaQA 30 (الجدول 1؛ التكميلي ملف 1): تقليم المناطق بنتيجة يعادل PHRED أقل من 20 باستخدام الإعدادات الافتراضية من DynamicTrim.pl.
    1. إزالة يقرأ أقصر من 25 نقطة مع LengthSort.pl على حد سواء إلى الأمام وعكس يقرأ في وقت واحد. تقييم جودة الملفات تنظيفها fastq مع FastQC (الجدول 1 ) - على وجه الخصوص، تحقق من جودة تسلسل لكل قاعدة ونقاط جودة لكل تسلسل هي أعلى من 20.

10. التطبيع الرقمية

  1. أداء جولة واحدة من التطبيع الرقمي على تنظيف يقرأ باستخدام أداة الخمير 31 (الجدول 1؛ التكميلي ملف 1)، normalize-by-median.py على وجه التحديد (باستخدام حجم ك مير 20، تغطية قطع من 20، والعاشر = 1e10).
  2. بدلا من ذلك، إذا كان الجهاز مع RAM عالية متوفرة (مئات باريه)، استخدم الثالوث النصي normalize_by_kmer_coverage.pl (الجدول 1).

11. دي نوفو الجمعية Transcriptome على

  1. الحصول على حق الوصول إلى مجموعة الكمبيوتر أو الكمبيوتر مع ما يصل إلى 256 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي و 24 وحدات المعالجة المركزية، اعتمادا على حجم التجمع.
  2. استخدام الثالوث 32 (الجدول 1؛ الملف التكميلي 1) لتجميع مجموعة الى contigs القراءة تطبيع رقميا. للحد مناستخدام الذاكرة، واستخدام --min_kmer_cov 2.

تقييم جمعية 12.

  1. تشغيل assemblathon_stats.pl من المشروع Assemblathon2 33 على الانتاج contig الثالوث. هذا السيناريو يؤدي العمليات الحسابية الأساسية ذات الصلة لتقييم جودة التجميع، مثل عدد من السقالات، N50، تكوين التجمع، وأكثر من (الجدول 1؛ ملف إضافي 1).

13. الشرح من Transcriptome على تجميعها

  1. أداء Blastx (الجدول 1) من التجمع ضد مجموعة البروتين المرجعية؛ للبعوض، ذبابة الفاكهة، الأنوفيلة الغامبية، بعوض الكيولكس، والزاعجة المصرية إشارات مناسبة. على وجه التحديد، تنسيق ملف FASTA البروتين مرجعية للانفجار، تليها blastx (ملف إضافي 1).

14. خريطة يقرأ إلى الجمعية عن طريق RSEM 34 (الجدول 1)

  1. إنشاء ملف "نسخة إلى الجينات خريطة"، الذيالعمود الأول يحتوي على معرفات الجينات المرجعية، والعمود الثاني معرفات contig. في محرر جداول البيانات، ومبادلة الأعمدة الأولى والثانية من إخراج Blastx، وكتابة هذه الأعمدة إلى ملف txt. استخدام البرنامج LINEBREAK لتحويل فواصل سطر في ملف txt مما أدى إلى تنسيق يونكس.
  2. إنشاء قاعدة بيانات مرجعية من ملف FASTA Transcriptome على استخدام النصي rsem-إعداد الإسناد، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1).
  3. حساب القيم التعبير بشكل منفصل لكل مكتبة باستخدام الأمر rsem-حساب-التعبير، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1). كما يقرأ، استخدام الملفات المقترنة fastq الناتجة عن خطوات تنظيف قراءة (الخطوة 9.2).
    1. إذا تم تقسيم RNA من تكرار البيولوجي في مسربين للتسلسل، تشمل كلا من ملفات fastq في حساب التعبير لتوليد ملف واحد.
  4. تحويل نتائج التعبير من كل مكتبة لمصفوفة معالجتها بسهولة من قبل ع الآخركل من برنامج باستخدام المقدمة النصي rsem-توليد للبيانات المصفوفة، المنصوص عليها في صفقة RSEM (ملف إضافي 1).

15. تحليل التعبير التفاضلي

  1. تثبيت R والمقلم (الجدول 1).
  2. استخدام read.delim لتحميل النتائج RSEM من الخطوة 14.3 (ملف إضافي 1). إذا لزم الأمر، على مدار التهم إلى أقرب عدد صحيح.
    ملاحظة: يوصي دليل المقلم الحد من مجموعة البيانات إلى الجينات مع ارتفاع التعبير يكفي للكشف عن أهمية.
  3. لتنسيق البيانات لالمقلم، وتوليد كائن DGEList من ملف البيانات تحميل (ملف إضافي 1). ثم، وتطبيع البيانات باستخدام TMM التطبيع (ملف إضافي 1). تقدير التفرق المشتركة وtagwise من البيانات (ملف إضافي 1).
  4. تحديد الجينات وأعرب تفاضلي مع Benjamini-هوشبرج تصحيح ف قيمة <0.05 (ملف إضافي 1). رسم توزيع سجل أضعاف تغيير مقابل وفرة (ملف إضافي 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أظهر التألق اثنين من عينات الحمض النووي الريبي تمثيلية شريطين في حوالي 2،000 الإقليم الشمالي (الشكل 1A، B). وتتألف 28S الحشرات RNA الريباسي اثنين من سلاسل عديد النوكليوتيد عقدت معا عن طريق روابط هيدروجينية، التي تتعطل بسهولة عن طريق التسخين وجيزة أو وكلاء التي تعط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويعرض هذا البروتوكول طرق لاكتشاف الجينات وأعرب تفاضلي بسبب photoperiodically السكون الناجم في A. الضنك. بروتوكول مهم في أنه يجمع بشكل فريد تربية البعوض وتقنيات المعلوماتية الحيوية لجعل جميع جوانب التجريبية من برنامج الفيزيولوجيا الجزيئية في متناول المستخدمين المبتدئي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Incubator - Model 818Thermo-Scientific3751120 V
Controlled environment roomThermax ScientificN/AWalk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulbPhilips3921834 W
Petri Dish 100 mm x 20 mmFisher08-772-E
Filter Paper 20.5 cmFisher09-803-6J
9.5 L BucketPlasticanBway Productshttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting WhiteJoann10173292http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockingsAlbahealth23650-040product no. 081420
Organic RaisinsNewman's OwnUPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)Fisher Scientific03-007-52The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper TowelsSeventh Generation30BPT120
Modular Mates Square Tupperware SetTupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass GrinderCorning Incorporated7727-2These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI ReagentSigma AldrichT9424Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-freeAmbion/Life TechnologiesAM1907This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AAPlace up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane FeederHemotek 5W1This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and ProbeHemotek MT3KFUMicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium CitratePel-Freez Biologicals33130-1The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

93 RNA Transcriptome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved