Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em

Riepilogo

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Abstract

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Introduzione

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms^1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change⁴, the spread of invasive species⁵, and host-pathogen interactions^6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism^8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa^11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus^15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant^5,18 and contain more total lipids¹⁹ than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects^20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect²². In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause²³, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

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Protocollo

1. larvale allevamento di due A. albopictus gruppi di età adulta

1. Impostare due armadi fotoperiodo con illuminazione programmabile a 21 ° C per l'espressione ottimale diapausa ¹⁶ e circa l'80% di umidità relativa.
   1. Programma un armadio per un 16L: luce 8D: ciclo scuro (un non-diapausa indurre LD fotoperiodo). Impostare il secondo armadio per 8L: 16D luce: ciclo scuro (diapausa indurre) ^13.
   2. 'Luci' del programma contemporaneamente in entrambe le armadi per sincronizzare l'ora circadiano tra fotoperiodi.
2. Calcolare la quantità di uova necessarie per eseguire l'esperimento. Obiettivo per 300-500 uova per gabbia. Almeno tre replicare gabbie diapausa e tre replicano gabbie non diapausa sono necessari per la produzione di RNA. Questo ammonta a circa il 1,800-3,000 uova per esperimento.
   1. Hatch le uova immergendo carte uovo in circa 500 ml di H ₂ O. deionizzata
   2. Aggiungi ca. 1 ml sospensione degli alimenti costituiti da cibo per cani a terra e il gambero di salamoia come descritto in precedenza ^24. Coprire il contenitore con rete, e mantenere la maglia in posizione con un elastico.
   3. Mettere nell'armadio LD fotoperiodo per circa 24 ore.
3. Trasferimento larve schiuse a 10 x 10 x 2 cm Petri piatti pieni di ca. 90 ml di acqua deionizzata H ₂ O.
   1. Mantenere ca. 30 larve per piatto. Trasferimento larve per pulire piatti ogni 48-72 ore, ad esempio ogni Lunedi, Mercoledì e Venerdì (MWF) ^24.
   2. Alimentazione circa 1 ml sospensione degli alimenti costituiti da cibo per cani a terra e artemie in acqua deionizzata ogni MWF come descritto in precedenza ^24.
4. Impostare 3-4 gabbie per adulti per ogni trattamento fotoperiodo, dove ogni gabbia comprende una replica biologica.
   1. Da bande opposte 9.5 L secchi, tagliare una 10-by-14 centimetri foro, e un altro foro di diametro 15 cm. Conel corso dei primi con rete. Tagliare circa un lunghezza di piede di una calza ortopedica, e incollate un'estremità intorno l'interno del foro.
   2. Tagliare l'estremità di piede della calza off e nodo arresto - aperto solo quando è necessario accedere all'interno della gabbia. Per il coperchio della gabbia, tagliare fuori tutto l'interno, lasciando solo il bordo, e sostituire la plastica interno con rete ^24.
   3. Notare il fotoperiodo, replicare numero, data di inizio della gabbia, e altre informazioni pertinenti per l'esperimento con pennarello indelebile sul lato della gabbia.
5. Foderare il fondo delle gabbie adulti con carta da filtro umida. Inumidire la carta da filtro con abbastanza deionizzata H ₂ O per aumentare l'umidità locale nella gabbia, ma evitare acqua stagnante, che può stimolare ovideposizione sulla carta da filtro ^24. Controllare la carta da filtro giornaliera per essiccamento, ri-bagnato quando necessario.
6. Per produrre uova sufficienti per una libreria di RNA, comprende almeno 100 donne / 9.5 L cage, con non più di 500 zanzare per gabbia.
7. Raccogliere pupe MWF e posto in una tazzina di H ₂ O pulita con una densità di non oltre il 50 pupe per 25 ml di H ₂ O. Trasferire la coppa pupe di una gabbia adulto. Posizionare gabbie nel rispettivo cabinet fotoperiodo - A. albopictus pupe sono fotosensibile ^15.
8. Assicurarsi quotidiana che H ₂ O in tazze è pulito e chiaro, e rimuovere pupe morti, perché l'accumulo di pupe morta può causare la mortalità di massa. Rimuovere H ₂ O tazze dopo tutti pupe emergono.
9. Mettere uvetta organici sulla maglia superiore della gabbia di fornire zucchero per adulti emerse. Monitorare uvetta, e cambiarle ogni 3-5 giorni per evitare l'accumulo di muffe.

2. Manutenzione di adulti per consentire l'accoppiamento e Egg Production

1. Mantenere gabbie a umidità elevata (circa. 80%) allineando il fondo della gabbia con una carta da filtro umida e fornire accesso a uva non-muffa, come descritto sopra (Sezioons 1.5 e 1.9).

3. si nutrono di sangue

1. Preparatevi a femmine di sangue-alimentazione tra 2-6 giorni dopo eclosion per garantire che le femmine sono stati esposti ad almeno otto giorni prima della deposizione delle uova brevi inequivocabili inizia per quasi 100 uova% diapausa ^14.
2. Preparare il sistema di alimentazione Hemotek membrana. Collegare le unità di alimentazione alla presa di corrente. Regolare la temperatura di ciascuna unità di 37 ° C con la vite di regolazione. Utilizzare un termometro elettronico e sonda per misurare la temperatura del gruppo di alimentazione durante la calibrazione.
3. Preparare il serbatoio pasto. Allungare un quadrato di membrana di collagene alimentazione sopra l'apertura del serbatoio pasto e fissarlo con un O-ring. Tirare con attenzione gli angoli per rimuovere le rughe; tagliare la membrana in eccesso con le forbici.
   NOTA: membrana collagene non può funzionare bene per tutte le specie di zanzara, e può essere necessario provare diversi tipi di trovare membrana ottimale se si lavora con unspecie diverse da A. albopictus. Parafilm funziona bene con Culex pipiens.
   1. Se il sangue è conservato congelato, scongelare a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di utilizzare.
   2. Tenere il serbatoio in modo che la membrana è rivolta verso il basso, e le porte di riempimento non supportati sono rivolti verso l'alto. Utilizzare una pipetta di trasferimento o una siringa per riempire il serbatoio con circa 3 ml di sangue intero da polli che ha citrato di sodio come anticoagulante. Sigillare porte di riempimento con tappi di plastica.
4. Fissare il serbatoio preparata all'alimentatore avvitandolo sul perno sulla piastra di trasferimento di calore sul fondo dell'alimentatore. Invertire l'alimentatore e posizionarlo sulla parte superiore della gabbia, lato membrana verso il basso, in modo che le zanzare possono alimentare attraverso le maglie della gabbia. Tenere l'alimentatore sulla gabbia per circa 45 min per massimizzare alimentazione.

4. Stimolare Deposizione delle uova

1. Quattro o cinque giorni dopo pasto di sangue, dotare ogni gabbia con un colore scuro 50 ml cup foderata con carta greggi germinazione dei semi (carta d'uovo) o il tovagliolo strutturato non sbiancata carta e riempire a metà con acqua deionizzata ^9. Se più di 250 zanzare sono in una gabbia, utilizzare due tazze.
   NOTA: Per le piccole gabbie o fiale singolo femminile, "infuso fieno" in contenitori di deposizione delle uova può aumentare deposizione causa l'odore della flora microbica ^25.

5. Raccogliere e deposito Uova

1. Iniziare la raccolta delle uova entro 4-5 giorni di alimentazione sangue, perché la produzione di uova picchi tipicamente di circa cinque giorni dopo l'alimentazione di sangue, e poi scompare nel corso della settimana prossima.
2. Variare frequenza di raccolta delle uova sulla necessità dell'esperimento. Per scopi generali, raccogliere documenti di uova su una pianificazione MWF. Rimuovere carte uovo da ogni gabbia e sostituirla con carta nuova. Posizionare i documenti rimossi di recente in piastre di Petri e conservare in cabinet fotoperiodo SD per evitare effetti confondenti di stoccaggio delle uova.
3. Lasciare carte uovo di ri principale bagnato per 2 giorni dopo la deposizione delle uova per permettere la formazione sierosa cuticola, che aumenta la resistenza uovo essiccazione ^26.
4. Raccolta postale circa 48 ore, uova asciugare all'aria aperta. Essiccare la carta in modo che sia molle e leggermente umido al tatto, ma non così bagnato che la carta è scuro da H ₂ O o stimola la schiusa delle uova.
   NOTA: A "x 4" carta 6.5 potrebbe richiedere circa 3,5 ore ad asciugare. Fare attenzione a non troppo secca carte d'uovo, in quanto questo si tradurrà in uovo essiccazione ^27.
5. Riserva uova aggiuntivi sia da LD e SD fotoperiodi per valutare l'incidenza diapausa e interpretano l'effetto photoperiodic (vedi Misurazione diapausa, sezione 6).
6. Per la conservazione a lungo termine, tenere le carte d'uovo a 21 ° C e circa l'80% di umidità in piastre di Petri. Tenere piastre di Petri in un contenitore Tupperware con un pallone di acqua per mantenere l'umidità locale come lo sviluppo embrionale richiede 4-5 giorni a 21 ° C.

ove_title "> 6. Misura diapausa Incidenza

1. Utilizzare ulteriori embrioni riservati (cfr Stimolare Deposizione delle uova, sezione 4) che sono 7-20 giorni per quantificare la risposta diapausa.
2. Registrare il numero di uova presenti su ogni carta uovo.
3. Stimolare le uova per schiudersi immergendo completamente carte uovo individuali in un piatto di 90 ml di Petri con circa 80 ml ​​di H ₂ O. deionizzata Aggiungere circa 0,25 ml cibo liquami.
4. Dopo 24 ore coincidere il numero di tratteggiata prima larve instar. Porre la capsula Petri su una superficie nera per visualizzare larve e posizionare una sorgente di luce su un lato del piatto. Le larve si allontanerà dalla fonte di luce, consentendo una chiara conteggio delle larve individuale. Rimuovere larve individuo con una pipetta, mentre il conteggio per evitare raccontare larve individuale.
5. Carte Luogo d'uovo in una nuova piastra di Petri e ri-asciutto. Re-hatch uova dopo ~ 1 settimana e ancora coincidono uova schiuse utilizzando il metodo di cui sopra.
6. Documenti Posizionare uovo con lo u rimanenti uova n-covato in nuovi 90 ml capsule di Petri con una soluzione sbiancante circa 80 ml ^​​28. Assicurarsi che le carte di uova sono completamente immersi in soluzione sbiancante e lasciare sotto una cappa durante la notte per evitare l'odore di candeggina.
   NOTA: Bleaching soluzione può essere conservata per ~ 1 settimana a 4 ° C, ma dovrebbe tuttavia essere fatta fresca.
7. Controllare le uova con un microscopio ottico come sbiancamento cancellerà il corion e permettere la visualizzazione di embrionate, uova non-covato. Se l'uovo è embrionate, l'uovo avrà un colore bianco sporco, con gli occhi che appaiono come due piccoli punti neri di fronte all'altro sul lato dorsale. Coincidere il numero di non-nati, uova embrionate ^13.
8. Determinare l'incidenza diapausa con la seguente formula:% diapausa = no. uova embrionate un-nati / (n. di uova schiuse + n. embrionate di uova non-covato) x 100 ^13.

7. RNA Estrazione da uova / pharate Larve

ONTENUTO "> NOTA: Uso Trizol in una cappa a flusso laminare.

1. Uova di zanzara Brush contenenti embrioni in via di sviluppo o larve pharate in distinti momenti di sviluppo dalle carte a base di uova a macine di vetro con un pennello di peli di cammello. Macinare le uova in Trizol (1 ml per 50-100 mg di tessuto) fino a completo polverizzato. Utilizzare almeno 400 uova per biblioteca per produrre RNA sufficiente.
   1. In alternativa, far scattare le uova congelare in azoto liquido e conservati a -80 ° C in provette da microcentrifuga fino a un mese prima della macinazione, in Trizol.
2. Eseguire l'estrazione di RNA in Trizol seguita da isopropanolo precipitazione secondo le istruzioni del produttore.
3. Trattare panchina con soluzione RNase decontaminazione o altri agenti per rimuovere eventuali residui nucleasi per evitare la degradazione dell'RNA.
   1. Trattare l'RNA estratto con DNasi. Secondo le indicazioni del produttore, incubare i campioni di RNA con DNasi per 30 minuti a 37 ° C. Utilizzare 1 & #181; l DNasi fino a 10 mg di RNA in una reazione di 50 microlitri. Aumentare la quantità di DNasi se vi sono più di 10 mg di RNA in una reazione.
   2. Inattivare DNase aggiungendo 5 ml DNasi sospeso inattivazione reagente. Incubare 5 min a temperatura ambiente, mescolando tre volte durante il periodo di incubazione (vortex).
   3. Centrifugare a 10.000 g per 1.5 min. Trasferire il surnatante contenente i campioni di RNA trattati ai tubi freschi per fasi successive.
4. Valutare la qualità dei campioni di RNA totale da fluorometria. Inviare i campioni ad un impianto di specialità con strumento adeguato per questo compito. L'impianto eseguirà elettroforesi su gel-chip per determinare le dimensioni delle specie di RNA nel campione, visualizzati da colorante fluorescente instillato nel chip. I risultati saranno restituiti come elettroferogramma.
   1. Determinare l'integrità dei campioni di RNA totale dalla presenza o l'assenza di prodotti di degradazione, come dimostra la presenza opicchi F tra le 18S e 5S ribosomiale picchi RNA sul dell'elettroferogramma risultante (Figura 1B).

8. RNA Sequencing

1. Invia campioni di RNA totale con qualità sufficientemente elevata (Figura 1A) e quantità (generalmente> 3 mg per libreria) a un centro commerciale sequenziamento per la costruzione di librerie arricchiti accoppiato fascia mRNA mRNA e sequenziamento, seguendo protocolli standard.
2. Se più di una corsia viene utilizzato per il sequenziamento di un singolo esperimento, dividere singole biblioteche in due corsie per il sequenziamento in funzione delle variazioni tecniche tra vicoli durante la sequenza.

9. lllumina Leggi Cleaning

NOTA: La Figura 2 riassume la parte bioinformatica di questo protocollo. Per un elenco completo di tutti i programmi e le risorse utilizzate nella sezione bioinformatica di questo protocollo, fare riferimento alla Tabella 1. InInoltre, File supplementare 1 contiene esempi riga di comando per ciascuna delle seguenti fasi di protocollo di bioinformatica.

1. Utilizzare ssaha2 ²⁹ (Tabella 1) per identificare le partite di 95% di identità o superiore al database NCBI UniVec core (Tabella 1), A. albopictus sequenza rRNA (GenBank # L22060.1), e gli adattatori di sequenziamento (esempi dettagliata della riga di comando fornite in file supplementare 1). Rimuovere le coppie a capire con le partite utilizzando Perl o uno strumento di scripting simile, ad esempio adattando lo script Perl in dotazione (File supplementare 2).
2. Pulire rimanendo legge con il pacchetto SolexaQA ³⁰ (Tabella 1; Supplemental File 1): tagliare le regioni con un punteggio Phred equivalente di meno di 20 utilizzando le impostazioni predefinite di DynamicTrim.pl.
   1. Rimuovere legge più breve di 25 bp con LengthSort.pl sia in avanti e retromarcia legge simultaneamente. Valutare la qualità dei file puliti FASTQ con FastQC (Tabella 1 ) - in particolare, verificare che la qualità per-base di sequenza e il punteggio di qualità per-sequenza sono al di sopra di 20.

10. Digital Normalizzazione

1. Effettuare un giro di normalizzazione digitale sul pulito legge utilizzando lo strumento khmer ³¹ (Tabella 1; Supplemental File 1), in particolare normalize-by-median.py (con dimensioni della k-mer 20, una copertura cut-off di 20, e x = 1e10).
2. In alternativa, se una macchina ad alta RAM è disponibile (centinaia di GB), utilizzare lo script normalize_by_kmer_coverage.pl di Trinity (Tabella 1).

11. De Novo trascrittoma Assembly

1. Ottenere accesso a un computer o un computer cluster con fino a 256 Gb di RAM e 24 CPU, a seconda delle dimensioni del gruppo.
2. Utilizzare Trinity ³² (Tabella 1; File supplementare 1) per assemblare la lettura digitale normalizzato impostare in contigs. Per ridurrel'utilizzo della memoria, uso --min_kmer_cov 2.

12. Assemblea valutazione

1. Eseguire assemblathon_stats.pl dal progetto Assemblathon2 ³³ sull'uscita contig Trinità. Questo script esegue i calcoli di base per affrontare la valutazione della qualità di assemblaggio, come il numero di ponteggi, N50, la composizione di assemblaggio, e più (Tabella 1; File supplementare 1).

13. Annotazione del trascrittoma Assemblato

1. Eseguire BLASTX (Tabella 1) l'insieme contro una serie proteina di riferimento; per le zanzare, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, e Aedes aegypti sono riferimenti adeguati. In particolare, formattare il file FASTA proteina di riferimento per esplosione, seguita da BLASTX (File supplementare 1).

14. Map Legge all'Assemblea Utilizzo RSEM ³⁴ (Tabella 1)

1. Creare un file 'trascrizione-to-gene-map', in cui laprima colonna contiene gli ID del gene di riferimento, e la seconda colonna della IDS contig. In un editor di fogli di calcolo, scambiare la prima e la seconda colonna della uscita BLASTX, e scrivere queste colonne in un file .txt. Utilizzare il programma per convertire linebreak interruzioni di riga nel file .txt risultante in formato Unix.
2. Creare un set di dati di riferimento dal file FASTA trascrittoma utilizzando lo script rsem-preparare-riferimento, fornito nella confezione RSEM (File supplementare 1).
3. Calcolare i valori di espressione separatamente per ciascuna libreria utilizzando il comando rsem-calcolo-espressione, fornito nella confezione RSEM (File supplementare 1). Come si legge, utilizzare i file abbinati FASTQ risultanti dal passo-lettura pulizia (punto 9.2).
   1. Se RNA da una replica biologico è stato diviso in due corsie per il sequenziamento, includere entrambi i file FASTQ nel calcolo dell'espressione per generare un unico file.
4. Convertire i risultati di espressione di ogni libreria a una matrice facilmente trattati da altri programs utilizzando lo script rsem-generate-data-matrix forniti, forniti nella confezione RSEM (File supplementare 1).

15. Espressione Differential Analysis

1. Installare R e levigabordi (Tabella 1).
2. Utilizzare read.delim per caricare i risultati RSEM dal punto 14.3 (File supplementare 1). Se necessario, completano i conteggi al numero intero più vicino.
   NOTA: La guida Edger raccomanda di limitare il dataset di geni con abbastanza espressione elevata per rilevare significato.
3. Per formattare i dati per edger, generare un oggetto DGEList dal file di dati caricati (File supplementare 1). Poi, normalizzare i dati utilizzando TMM normalizzazione (File supplementare 1). Stimare le dispersioni comuni e tagwise dei dati (File supplementare 1).
4. Identificare geni differenzialmente espressi con un Benjamini-Hochberg corretto p-value <0.05 (File supplementare 1). Tracciare la distribuzione di log-fold-change vs. abbondanza (File supplementare 1).

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Risultati

Fluorometria di due campioni di RNA rappresentativi mostrato due bande a circa 2.000 nt (Figura 1A, B). Il 28S insetti RNA ribosomiale è costituito da due catene polinucleotidiche tenuti insieme da legami di idrogeno, che sono facilmente interrotti da brevi riscaldamento o agenti che sconvolgono legami idrogeno ^35. Le risultanti due componenti sono approssimativamente le stesse dimensioni del 18S RNA ribosomiale. Il secondo campione RNA mostrato elevati livelli di degrado (Figura 1B)...

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Discussione

Questo protocollo presenta i metodi per scoprire i geni differenzialmente espressi a causa photoperiodically diapausa indotta in A. albopictus. Il protocollo è significativo in quanto combina in modo unico allevamento di zanzare e di bioinformatica tecniche per rendere tutti gli aspetti sperimentali di un programma di fisiologia molecolare accessibile agli utenti alle prime armi - in particolare quelli incentrati sulla risposta diapausa photoperiodic. Metodi esistenti, a nostra conoscenza, non forniscono più ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator - Model 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Controlled environment room	Thermax Scientific	N/A	Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb	Philips	392183	4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Filter Paper 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L Bucket	Plastican	Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings	Albahealth	23650-040	product no. 081420
Organic Raisins	Newman's Own	UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)	Fisher Scientific	03-007-52	The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels	Seventh Generation	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder	Corning Incorporated	7727-2	These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent	Sigma Aldrich	T9424	Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder	Hemotek	5W1	This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate	Pel-Freez Biologicals	33130-1	The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.