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要約

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

要約

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

概要

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

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プロトコル

二A. 1.幼虫飼育成体までヒトスジシマカグループ

  1. 2最適休眠発現の16のために21°Cでプログラム可能な照明の光周期キャビネットと約80％の相対湿度を設定します。
    1. 16Lのためのプログラム1キャビネット：8D光：暗サイクル（非休眠誘導LDの光周期）。 16Dライト：暗サイクル（休眠誘導）13 8L用の2台目のキャビネットを設定します。
    2. 光周期の間に概日時間を同期するため、両方のキャビネットを同時にプログラム」のライト」。
  2. 実験を実行するのに必要な卵の量を計算する。ケージ当たり300〜500卵を目指す。少なくとも3休眠ケージを複製し、3が非休眠ケージを複製するには、RNAの生成のために必要とされる。これは実験ごとに1,800-3,000卵をCAに合計します。
    1. ハッチ卵脱イオンH 2 Oの約 500ミリリットルに卵の論文を沈めることによって
    2. 追加<以前に24を説明するように、グランドドッグフードやブラインシュリンプからなるem>のCA。1ミリリットル食品スラリー。メッシュコンテナを覆い、ゴムバンドで所定の位置にメッシュを保つ。
    3. 約 24時間のLD光周期キャビネットに置きます。
  3. 転送が約 90ミリリットルの脱イオンH 2 Oで満たされた10×10×2センチメートルペトリ皿に幼虫を孵化し
    1. 皿当たり約 30幼虫を維持します。毎週月曜日、水曜日、金曜日（MWF）24例えば、すべての48〜72時間の食器をきれいに転送幼虫。
    2. 以前のように脱イオン水に地上ドッグフードやブラインシュリンプのあらゆるMWFからなるフィード約 1ミリリットル食品スラリーは24を説明した。
  4. 各ケージは、生物学的な複製を含み、各光周期の治療のための三から四大人のケージを設定します。
    1. 9.5 Lバケットの両側から、1つの10による-14センチ穴を切り出し、15cmの直径を有する別の穴。共同メッシュ最初VER。整形外科ストッキングの約1フィートの長さをカットし、他の穴の内側の周りに一端を接着。
    2. ストッキングオフと結び目シャットの足側端部をカット - オープンケージの内部へのアクセスが必要な場合にのみ。ケージの蓋の場合、唯一のリムを残して、インテリアのすべてをカットし、メッシュ24と内装 ​​プラスチックに置き換える。
    3. ケージの側面に永久的なマーカーを用いた実験に関連する数、ケージ開始日、およびその他の情報を複製、日長に注意してください。
  5. 湿った濾紙で大人のケージの下に並ぶ。濾紙24上に産卵を刺激することができ、ケージの中に局所湿度を増加させるが静水回避するために十分な脱イオンH 2 Oでろ紙を湿らせる。乾燥のために毎日のろ紙を確認し、必要なときに再ぬれた。
  6. 少なくとも100人の女性を含む、RNAライブラリーのための十分な卵を生産する/ 9.5 LのCAGE、ケージ当たりせいぜい500蚊と。
  7. 以上50蛹25 ml当たりのH 2 Oの密度でクリーンなH 2 Oの小さなカップに蛹MWFと場所を集める大人のケージに蛹カップを転送します。それぞれの光周期キャビネットに置きケージ- A.ヒトスジシマカの蛹感光15である。
  8. カップ中のH 2 Oがきれいで、明確で、かつ死んだ蛹の蓄積が大量死を引き起こす可能性があるので、死んだ蛹を削除することを毎日確認してください。すべての蛹が出現Oカップの後にH 2を削除します。
  9. 登場大人のための砂糖を提供するために、ケージの上部のメッシュ上に有機レーズンを置きます。レーズンを監視し、金型の蓄積を防ぐために、3〜5日毎に変更します。

交尾と産卵を可能にするために大人の2.メンテナンス

  1. 湿った濾紙でケージ底部をライニングすることにより、高湿度（約80％）でケージを維持し、そして上記のように、非カビレーズンへのアクセスを提供する（Sectiアドオン1.5および1.9）。

3.血液供給

  1. 産卵はほぼ100％の休眠卵14開始する前に、女性は少なくとも8明確な短い日にさらされたことを確認するために羽化後2〜6日の間で血液の供給の雌に準備します。
  2. Hemotekメンブレン給餌システムを準備します。電源に供給ユニットを差し込みます。調整ネジを使用して37℃に各ユニットの温度を調整します。キャリブレーション時の給紙部の温度を測定する電子体温計プローブを使用する。
  3. 食事リザーバを準備します。食事リザーバの開口部の上にコラーゲン供給膜の正方形のストレッチ、Oリングで固定します。慎重にしわを除去するためのコーナーを引っ張る。はさみで余分な膜をトリミング。
    注：コラーゲン膜は、すべての蚊の種のためにうまく動作しない可能性があり、それがで作業している場合、最適な膜を見つけることがいくつかのタイプを試してみる必要があるかもしれないA.以外の種ヒトスジシマカ 。パラフィルムは、 アカイエカでうまく動作。
    1. 血液が凍結保存されている場合、使用前に少なくとも1時間室温で解凍。
    2. 膜が下を向いているように貯水池を持ち、サポートされていない、と充填ポートが上を向いている。抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを有するニワトリからの全血の約3mlでリザーバを充填するためにピペットまたはシリンジを使用する。プラスチック製のプラグを充填ポートをシール。
  4. フィーダの底面の伝熱板上のスタッドの上にねじ込むことにより、フィーダに準備された容器を取り付けます。蚊がケージのメッシュを養うことができるように、フィーダーを反転し、ケージの上に置き、下に膜側。給餌を最大化するために、約45分間ケージにフィーダを保管してください。

4.産卵を刺激

  1. 4〜5日は、血粉を投稿し、暗い色の50ミリリットルcで各ケージを装備無漂白の種子発芽紙（卵紙）またはテクスチャー非漂白紙タオルで並んで、脱イオン水9で途中で埋めるまで。 250以上の蚊がケージ内にある場合、2つのカップを使用しています。
    注：小さなケージまたはシングル女性のバイアルの場合、産卵コンテナの「干し草の注入は、「原因微生物叢25の匂いに産卵を増加させることができる。

5.収集して保存卵

  1. 卵の生産は、典型的には、約5日間の吸血後にピークに達し、その後、来週の上におさまるので、血液供給の4-5日以内に採卵を開始。
  2. 実験の必需品に卵の収集頻度を変更します。一般的な目的のために、MWFスケジュールで卵の論文を収集します。各ケージから卵の論文を削除し、新鮮な紙と交換します。場所は最近、卵の保存の交絡影響を避けるためのSD光周期キャビネットにペトリ皿や店舗の論文を削除しました。
  3. 卵の論文を再することを許可するポスト産卵は卵の乾燥耐性26を増加漿膜キューティクル形成を、可能にするために2日間湿っメイン。
  4. 約48時間後に収集、オープンエアで乾燥した卵。それはぐったりと触ると少し湿らせたが、紙は、H 2 Oから暗い場合や卵の孵化刺激することをそのように濡れないように紙を乾燥させる。
    注：6.5 "×4"紙が乾燥するために、約3.5時間がかかる場合があります。これは卵の乾燥27になりますように、しない過乾燥卵の論文には注意してください。
  5. 休眠発生率を評価し、光周期の影響を解釈するための両方のLD及びSD光周期から準備追加の卵（休眠、第6節の測定を参照してください）​​。
  6. 長期保存のために、ペトリ皿中で21℃〜約80％の湿度で卵論文を保つ。胚発生は、21℃で4〜5日かかるとして地元の湿度を維持するために水のフラスコでタッパーウェア保存容器内のペトリ皿にしてください。
ove_title "> 6。休眠発生率を測定します

  1. 休眠応答を定量化するために7-20日齢である追加の予約胚（産卵、第4節を刺激参照）を使用します。
  2. 各卵の紙の上に存在する卵の数を記録します。
  3. 完全に約80ミリリットルの脱イオンH 2 Oで90ミリリットルペトリ皿に個々の卵の論文を沈めることによって孵化する卵を刺激する約0.25ミリリットルの食品スラリーを追加します。
  4. 24時間後、ハッチング第一齢幼虫の数を集計。幼虫を視覚化し、皿の一方の側に光源を配置する黒色表面上のペトリ皿を置く。幼虫は、個々の幼虫の明確な集計を可能に、光源から離れて移動します。個々の幼虫を再集計防ぐためにカウントしながらピペットで個々の幼虫を削除します。
  5. 新しいペトリ皿に卵の論文を置き、再びドライ。再孵化卵〜1週間後に再度、上記の方法を使用して、孵化した卵を集計する。
  6. 残りのUと卵の論文を置きます約80ミリリットル漂白液28を持つ新しい90ミリリットルペトリ皿中のn-孵化した卵。卵の論文は完全に漂白液中に沈めていることを確認して、漂白剤の匂いを避けるために、ヒュームフード下で一晩のまま。
    注：漂白溶液を4℃で約1週間保存することができるが、そうでなければ新たに作製する必要がある。
  7. 絨毛膜をクリアして、孵化、未孵化した卵の可視化を可能にします漂白などの光学顕微鏡を用いて卵を検査します。卵が孵化した場合、卵は背側に互いに反対つの小さな黒い点のように見える目でオフホワイト色を持つことになります。タリー非ハッチング、孵化卵の数13。
  8. ％の休眠=いいえ：次の式で休眠発生率を決定します。胚の未孵化した卵は、/（NO。孵化した卵は+ありません。胚の未孵化した卵）100 13 xは。

卵/ pharate幼虫から7 RNA抽出

ontent ">注：層流フード内での使用にTrizol。

  1. ラクダ毛のブラシを使用してガラス研磨機に卵の論文からの明確な開発の時点で発生中の胚またはpharate幼虫を含むブラシ蚊の卵。完全に粉砕されるまで（組織の50〜100ミリグラムあたり1ミリリットル）トリゾールで卵を挽く。十分なRNAを得るために図書館あたり少なくとも400の卵を使用してください。
    1. あるいは、液体窒素中で凍結卵をスナップトリゾールで粉砕する前の月までのために微量遠心管中で-80℃で保存した。
  2. トリゾールにRNA抽出を行い、製造業者の説明書に従ってイソプロパノール沈殿を行った。
  3. RNAの分解を避けるために残留ヌクレアーゼを除去するためのRNアーゼ除染液または他の薬剤とのベンチを扱う。
    1. DNアーゼで抽出したRNAを扱う。製造業者の説明書に従って、37℃で30分間のDNaseとRNAサンプルをインキュベートする。 1＆＃を使用してください181; 50μlの反応におけるRNAの最大10μgのためのL DNアーゼ。 RNAの10以上μgの1の反応であるかどうDNアーゼの量を増やします。
    2. 5μlの一時停止のDNase不活性化試薬を添加することにより、DNアーゼを不活性化する。インキュベーション期間（穏やかにボルテックス）の間に3回混合し、室温で5分間インキュベートする。
    3. 1.5分間万×gで遠心分離する。後続のステップのための新鮮なチューブに処理したRNAサンプルを含む上清を移し。
  4. 蛍光法による全RNAサンプルの品質を評価。この作業のための適切な器具を用いて専門施設にサンプルを送る。施設は、チップ内に注入した蛍光色素により可視化し、サンプル中のRNA種のサイズを決定するために、オンチップゲル電気泳動を行います。その結果、電気泳動図として返されます。
    1. プレゼンス○で証明されるように、分解生成物の有無により全RNA試料の完全性を決定する結果の電気泳動図（ 図1B）上の18Sおよび5SリボソームRNAのピーク間のfのピーク。

8. RNAシーケンシング

  1. 標準プロトコルに従って、濃縮されたペアエンドmRNAのライブラリとのmRNAの配列決定の建設のための商業シングセンターに十分に高い品質（ 図1A）と量（ライブラリごと通常>3μgの）とのトータルRNAサンプルを送信します。
  2. 複数のレーンが単一の実験を配列決定するために使用されている場合、配列決定の間のレーン間の技術的変動を考慮するためにシークエンシングのための2つのレーンに個々のライブラリを分割する。

9. lllumina読むクリーニング

メモ：図2は、このプロトコルのバイオインフォマティクス部分をまとめたもの。このプロトコルのバイオインフォマティクスのセクションで使用されているすべてのプログラムやリソースの完全なリストについては、 表1を参照してください。でさらに、補足ファイル1は、以下のバイオインフォマティクスプロトコルの各ステップのためのコマンドラインの例が含まれています。

  1. NCBI UniVecコアデータベースに95％の同一性またはそれ以上の一致を識別するssaha2 29（ 表1）を使用した（ 表1）A. ヒトスジシマカ rRNA配列（ジェンバンク＃1 L22060.1）、および配列決定アダプター（補足ファイル1に提供される詳細なコマンドラインの例）。提供Perlスクリプト（補足ファイル2）を適応させることによって、たとえば、Perlや類似のスクリプト·ツールを使用してマッチで読み取りペアを削除します。
  2. 残りのクリーンSolexaQAパッケージ30を読み出す（ 表1;補足ファイル1）：DynamicTrim.plのデフォルト設定を使用して20未満のPHREDスコア当量領域をトリミング。
    1. 取り外しは、順方向の両方でLengthSort.plとより短い25塩基対を読み取り、逆が同時に読み込む。 FastQCと洗浄FASTQファイルの品質を評価した（ 表1 ） - 特にごとのベースシーケンスの品質と単位のシーケンスの品質スコアが20を超えていることを確認してください。

10.デジタル正規化

  1. のk-merのサイズ20、20のカバレッジカットオフ、およびXを使用して（具体的normalize-by-median.py;洗浄デジタル正規化の一ラウンドを実行するクメールツール31（補足ファイル1、表1）を用いて読み取る= 1E10）。
  2. 高いRAMを搭載したマシンは（GBSの数百）が利用可能である場合には別の方法として、トリニティのnormalize_by_kmer_coverage.plスクリプト（ 表1）を使用します。

11. デ·ノボトランスクリプトームアセンブリ

  1. アセンブリのサイズに応じて、RAMの最大256 GBと24のCPUを搭載したコンピュータまたはコンピュータクラスタへのアクセスを取得します。
  2. コンティグにセットデジタルで正規化された読み取りを組み立てるために、トリニティ32（補足ファイル1、表1）を使用します。減少させるために、メモリ使用量、--min_kmer_cov 2を使用。

12.アセンブリ評価

  1. トリニティコンティグ出力にAssemblathon2プロジェクト33からassemblathon_stats.plを実行します。このスクリプトは、そのような足場の数、N50、組立物、及びより（;補足ファイル1、表1）などの組立品質を評価に関連する基本的な計算を実行。

組み立てトランスクリプトームの13注釈

  1. 参照タンパク質のセットに対してアセンブリのBLASTX（ 表1）を行う。蚊のために、 キイロショウジョウバエ、ハマダラカ、アカイエカ 、およびネッタイシマカは、適切な参照です。具体的には、BLASTX（補足ファイル1）に続いて爆風のための参照タンパク質のFASTAファイルを、フォーマットします。

14.マップRSEM 34（表1）を用いて総会に読み込みます

  1. 「転写産物·ツー·遺伝子マップ」ファイルを作成し、その中で最初の列は、参照遺伝子ID、および第二列コンティグIDが含まれています。スプレッドシートエディタでは、BLASTX出力から1列目と2列を入れ替えて、.txtファイルにこれらの列を記述します。 Unixのフォーマットに結果の.txtファイルに改行を変換するためのLineBreakプログラムを使用します。
  2. RSEMパッケージ（補足ファイル1）で提供rsem-PREPARE-参照スクリプトを使用して、トランスクリプトームFASTAファイルから参照データセットを作成します。
  3. RSEMパッケージ（補足ファイル1）で提供rsem-計算式のコマンドを使用して、ライブラリごとに別々の発現値を計算します。読み込み、読み出し洗浄工程（ステップ9.2）から生じるFASTQペアファイルを使用します。
    1. 生物学的な複製からのRNAが、配列決定のために二車線に分けた場合、単一のファイルを生成するために、式の計算で両方FASTQファイルが含まれています。
  4. 各ライブラリーからの発現結果は、簡単に他のpによって処理行列への変換RSEMパッケージ（補足ファイル1）で提供提供されたスクリプトrsem-生成するデータ·マトリックスを使用してrograms。

15.ディファレンシャル発現解析

  1. Rとエッジャー（ 表1）をインストールします。
  2. ステップ14.3（補足ファイル1）からRSEM結果をロードするread.delimを使用してください。必要に応じて、最も近い整数にカウントを丸める。
    注：エッジャーガイドは意義を検出するために十分に高い発現を有する遺伝子にデータセットを制限することをお勧めします。
  3. エッジャーのデータをフォーマットするには、ロードされたデータファイル（補足ファイル1）からDGEListオブジェクトを生成する。その後、TMM正規化（補足ファイル1）を使用してデータを正規化する。データの共通とtagwise分散液を推定（補足ファイル1）。
  4. Benjamini-Hochbergので示差的に発現する遺伝子を同定は、p値<0.05（補足ファイル1）を修正しました。豊富対対数倍数変化（補足ファイル1）の分布をプロットします。

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結果

つの代表RNAサンプルの蛍光測定は、約2000塩基（ 図1A、B）2つのバンドを示した。昆虫28SリボソームRNAを容易に短時間加熱または水素結合35を破壊する薬剤によって破壊された水素結合によって一緒に保持された2つのポリヌクレオチド鎖から構成されている。得られた2つの成分​​は、18SリボソームRNAとほぼ同じ大きさである。第二のRNAサンプルは、分解（ 図1B）

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ディスカッション

このプロトコルは、Aのphotoperiodically誘起休眠による差次的に発現する遺伝子を発見するための方法を提示ヒトスジシマカ 。光周休眠応答に焦点を当てた人のため特に - プロトコルは、それが一意に初心者のユーザーがアクセス可能な分子生理学プログラムのすべての実験的な側面を作るために蚊の飼育とバイオインフォマティクス技術を組み合わせたことで重要である。飼育ミ...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

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資料

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参考文献

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