JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Abstract

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Introduction

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הזחל גידול של שני א קבוצות albopictus לבגרות

  1. הגדר שני ארונות photoperiod עם תאורה הניתנת לתכנות ב 21 מעלות צלזיוס במשך ביטוי דיאפאוזה אופטימלי 16 וכ 80% לחות יחסית.
    1. קבינט תכנית אחת ל16L: אור ד 8: מחזור כהה (שאינה דיאפאוזה גרימת photoperiod LD). הגדר את הארון השני ל8L: אור 16 ד: מחזור כהה (דיאפאוזה התרמה) 13.
    2. "האורות ב'התכנית באותו הזמן בשני הארונות ללסנכרן את זמן היממה בין photoperiods.
  2. לחשב את כמות הביצים הדרושים לביצוע הניסוי. לשאוף 300-500 ביצים בכלוב. לפחות שלוש לשכפל כלובי דיאפאוזה ושלוש לשכפל כלובים הלא דיאפאוזה נדרשים לייצור RNA. זה מסתכם לCA. 1,800-3,000 ביצים לכל ניסוי.
    1. האץ הביצים על ידי השריית ניירות ביצה לתוך בערך 500 מיליליטר של H 2 O. deionized
    2. להוסיף ca. 1 מיליליטר תרחיף מזון מורכב ממזון כלבי קרקע וארטמיה כפי שתואר קודם לכן 24. כיסוי מיכל עם רשת, ולשמור על הרשת במקום עם גומייה.
    3. מניחים בארון photoperiod LD לבערך 24 שעות.
  3. זחלים בקעו העברה עד 10 x 10 x 2 סנטימטר פטרי H מנות מלאות מיליליטר 90 בערך deionized 2 O.
    1. לשמור בערך 30 זחלים לכל צלחת. העבר את הזחלים לנקות מנות כל שעות 48-72, למשל בכל יום שני, רביעי ושישי (MWF) 24.
    2. slurry מזון 1 מיליליטר בערך Feed בהיקף של מזון לכלבי קרקע וארטמיה במים ללא יונים כל MWF כמו בעבר תאר 24.
  4. הגדרה 03:57 כלובים מבוגרים לכל טיפול photoperiod, שבו כל כלוב כולל לשכפל ביולוגי.
    1. משני צדי מתרס של 9.5 דליי L, לגזור חור סנטימטר 10-by-14 אחד, ועוד חור בקוטר 15 סנטימטר. CoVer הראשון עם רשת. חותך כ אחד אורך רגל של גרב אורתופדים, ודבק קצה אחד סביב החלק הפנימי של החור האחר.
    2. חותך את קצה הרגל של הגרב ומסגר קשר - פתוח רק כאשר יש צורך בגישה לחלק הפנימי של הכלוב. למכסה הכלוב, לחתוך את כל הפנים, ומשאירים רק את השפה, ולהחליף את הפלסטיק הפנימי עם רשת 24.
    3. הערה photoperiod, לשכפל מספר, תאריך התחלת כלוב, וכל מידע אחר רלוונטי לניסוי עם סמן קבוע בצד של הכלוב.
  5. שורה התחתונה של הכלובים המבוגרים עם נייר סינון רטוב. לצנן את נייר הסינון עם מספיק H 2 O deionized להגדיל לחות מקומית בכלוב, אך להימנע מים עמד, שיכול לעורר ההטלה על נייר הסינון 24. בדוק את נייר הסינון יומי לייבוש, מחדש רטוב בעת צורך.
  6. כדי לייצר ביצים מספיק לספריית RNA, כוללים לפחות 100 נשים / ca 9.5 Lge, עם לא יותר מ -500 יתושים בכל כלוב.
  7. לאסוף MWF גלמים ומקום בכוס קטנה של H 2 O הנקי בצפיפות של לא יותר מ -50 גלמים לכל 25 מיליליטר H 2 O. העבר את כוס הגלמים לכלוב מבוגר. כלובי מקום בארון photoperiod בהתאמה - א גלמי albopictus הם רגישים 15.
  8. ודא יומי שH 2 O בכוסות נקי וברור, ולהסיר גלמים מתים, כי הצטברות של גלמים מתים יכולה לגרום לתמותה המונית. הסר H 2 O כוסות אחרי כל הגלמים לצוץ.
  9. מניחים צימוקים אורגניים ברשת העליונה של הכלוב כדי לספק סוכר למבוגרים יצאו. צג צימוקים, ולשנות אותם כל 3-5 ימים כדי למנוע הצטברות עובש.

2. תחזוקה של מבוגרים כדי לאפשר ייצור של הזדווגות וביצה

  1. לשמור על כלובים בלחות גבוהה (כ. 80%) על ידי המצפה את תחתית הכלוב עם נייר סינון לח, ומספק גישה לצימוקים שאינם מעופשים, כפי שתואר לעיל (sectiתוספות 1.5 ו -1.9).

3. דם-האכלה

  1. הכן לנקבות דם הזנה בין שניים לשישה ימים לאחר eclosion כדי להבטיח שנשים שנחשפו ללפחות שמונה ימים קצרים חד-משמעיים לפני ההטלה מתחילה לכמעט 100 ביצי דיאפאוזה% 14.
  2. הכן את מערכת האכלת Hemotek ממברנה. חבר את יחידות האכלה לאספקת החשמל. כוון את הטמפרטורה של כל יחידה עד 37 מעלות צלזיוס באמצעות בורג ההתאמה. השתמש במדחום ובדיקה אלקטרוניים כדי למדוד את הטמפרטורה של יחידת ההאכלה במהלך כיול.
  3. הכן את מאגר הארוחה. למתוח רבוע של קרום האכלת קולגן על הצמצם של מאגר הארוחה ולאבטח אותו עם O-טבעת. משכו בזהירות את הפינות להסרת קמטים; חתוך את הקרום העודף במספריים.
    הערה: קרום קולגן עשוי שלא לפעול היטב לכל מיני היתושים, וייתכן שיהיה צורך לנסות כמה כדי למצוא את הקרום האופטימלי אם עובד עםמינים אחרים מאשר A. albopictus. Parafilm עובד היטב עם כולכית מצויים.
    1. אם דם מאוחסן קפוא, להפשיר בטמפרטורת חדר למשך שעה לפחות 1 לפני השימוש.
    2. החזק את המאגר, וכך הקרום פונה כלפי מטה, והיציאות שאינן נתמכות, המילוי הם פונים כלפי מעלה. השתמש פיפטה העברה או מזרק כדי למלא את המאגר עם כ 3 מיליליטר של דם מלא מתרנגולות שיש נתרן ציטרט כנוגדת קרישה. לאטום יציאות מילוי עם תקעי פלסטיק.
  4. צרף את המאגר מוכן המזין על ידי הברגתו על ההרבעה על צלחת העברת חום בתחתית המזין. הפוך את המזין ולמקם אותו בחלק העליון של הכלוב, צד קרום למטה, כך שיתושים יכולים להאכיל דרך רשת הכלוב. שמור המזין בכלוב לכ 45 דקות על מנת למקסם את ההאכלה.

4. עידוד הטלה

  1. ארבעה עד חמישה ימי הודעה ארוחת דם, לצייד כל כלוב עם הצבע כהה 50 מיליליטר געד מרופד בנייר מולבן נביטת זרעים (נייר ביצה) או מגבת נייר מולבן ללא מרקם ולמלא באמצע הדרך עם מים ללא יונים 9. אם יותר מ -250 יתושים נמצאים בכלוב, להשתמש בשתי כוסות.
    הערה: לכלובים קטנים או בקבוקונים חד-נשיים, "עירוי חציר" במכולות ההטלה עלול להגביר ההטלה בשל הריח של צמחיית חיידקי 25.

5. לאסוף ולאחסן ביצים

  1. להתחיל אוסף ביצה בתוך 4-5 ימים של האכלת דם בגלל ייצור ביצים בדרך כלל מגיע לשיא כחמישה ימים לאחר האכלת דם, ולאחר מכן שוככת במהלך השבוע הבא.
  2. להשתנות בתדירות אוסף ביצה על צרכי הניסוי. למטרות כלליות, לאסוף ניירות ביצה על לוח זמנים MWF. הסר ניירות ביצה מכל כלוב ולהחליף עם נייר טרי. תניח נייר הוסר לאחרונה בצלחות פטרי וחנות בקבינט photoperiod SD כדי למנוע תופעות של בלבול אחסון ביצה.
  3. לאפשר ניירות ביצה מחדש עיקרי רטוב במשך 2 ימים לאחר ההטלה-כדי לאפשר היווצרות ציפורן serosal, אשר מגדילה את התנגדות התייבשות ביצת 26.
  4. הודעה אוסף כ 48 שעות, ביצים יבשות באוויר פתוח. ייבש את הנייר כך שהוא רפוי ומעט לח למגע, אבל לא כל כך רטוב שהנייר הוא כהה מH 2 O או ממגר בקיעה של ביצים.
    הערה: "x 4" נייר 6.5 עלול לקחת כ 3.5 שעות לייבוש. היה זהיר לא לניירות ביצה מעל יבש, כמו זה יגרום להתייבשות ביצת 27.
  5. ביצים נוספות ריזרב מphotoperiods שני LD וSD להעריך שכיחות דיאפאוזה ולפרש את השפעת photoperiodic (ראה מדידת דיאפאוזה, סעיף 6).
  6. לאחסון לטווח ארוך, לשמור מסמכי ביצה בגיל 21 ° C ולחות כ -80% בצלחות פטרי. שמור צלחות פטרי במכל אחסון טאפרוור עם בקבוק של מים כדי לשמור על לחות מקומית כהתפתחות עוברית לוקחת ארבעה עד חמישה ימים ב 21 מעלות צלזיוס.
ove_title "> 6. מדוד דיאפאוזה תחולה

  1. השתמש בעוברים שמורות נוספים (ראו לעורר הטלה, סעיף 4), כי הם 7-20 ימים ההם לכמת את תגובת דיאפאוזה.
  2. רשום את מספר הביצים הנוכחיות על כל נייר ביצה.
  3. לעורר ביצים לבקוע על ידי השריית לחלוטין ניירות ביצה בודדים בצלחת פטרי עם 90 מיליליטר כ -80 מיליליטר H 2 O. deionized להוסיף כ 0.25 מיליליטר תרחיף מזון.
  4. לאחר 24 שעות עולים בקנה מספר זחלי instar הראשונים בקע. מניחים את צלחת פטרי על משטח שחור לדמיין זחלים ולמקם את מקור אור בצד אחד של צלחת. זחלים יהיו להתרחק ממקור האור, המאפשרים למניין ברור של זחלים בודדים. הסר זחלים בודדים עם טפטפת תוך ספירה כדי למנוע מספרים זחלים בודדים.
  5. ניירות ביצת מקום בצלחת פטרי חדשה ומחודשת יבשים. ביצים בוקעים מחדש לאחר שבוע 1 ~ ושוב עולות בקנה ביצים בקעו באמצעות השיטה הנ"ל.
  6. ניירות ביצת מקום עם u שנותר n בקע ביצים בצלחות פטרי חדשות 90 מיליליטר עם פתרון הלבנה כ 80 מיליליטר 28. ודא שניירות הביצה שקועים לחלוטין בפתרון ההלבנה ולהשאיר תחת לילה מנדף, כדי למנוע את הריח של אקונומיקה.
    הערה: הלבנת פתרון יכולה להיות מאוחסנת במשך שבוע ~ 1 על 4 מעלות צלזיוס, אבל צריך להיות אחר עשתה טרי.
  7. בדוק ביצים באמצעות מיקרוסקופ אור כהלבנה ינקה את סיסית ולאפשר להדמיה של ביצי embryonated,-בקע un. אם הביצית embryonated, הביצה תהיה צבע off-לבן עם עיניים המופיעות כשתי נקודות שחורות קטנות זה מול זה בצד הגב. עולה בקנה אחד מספר, ביצי embryonated un בקע 13.
  8. לקבוע שכיחות דיאפאוזה עם הנוסחה הבאה: דיאפאוזה% = לא. ביצים בקעו בלתי embryonated / (לא. ביצים בקעו + לא. ביצים בקעו-un embryonated) x 100 13.

7. הפקת RNA מהביצים / pharate זחלים

ontent "> הערה: השימוש Trizol בזרימה למינרית.

  1. ביצי יתושים מברשת מכילות עובר פיתוח או זחלי pharate בנקודות שונות בזמן פיתוח מעיתוני ביצה למטחנות זכוכית בעזרת מברשת משיער גמל. טוחנים את הביצים בTrizol (1 מיליליטר ל50-100 מ"ג של רקמה) עד מרסק לחלוטין. השתמש בלפחות 400 ביצים בספרייה להניב RNA מספיק.
    1. לחלופין, הצמד ביצי הקפאה בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 ° C בצינורות microcentrifuge עד חודש לפני הטחינה בTrizol.
  2. לבצע הפקת RNA בTrizol ואחריו המשקעים isopropanol על פי הוראות יצרן.
  3. פנק את הספסל עם פתרון טיהור RNase או סוכנים אחרים כדי להסיר כל nucleases שייר כדי למנוע השפלה RNA.
    1. פנק את RNA חילוץ עם DNase. על פי הוראות יצרן, דגירה דגימות RNA עם DNase במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש & # 1181; DNase l עד 10 מיקרוגרם של RNA בתגובת 50 μl. להגדיל את כמות DNase אם יש יותר מ -10 מיקרוגרם של RNA בתגובה אחת.
    2. להשבית DNase על ידי הוספה מגיב איון DNase המושעה 5 μl. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר, ערבוב שלוש פעמים במהלך תקופת דגירה (vortexing העדין).
    3. צנטריפוגה XG ב 10,000 עבור 1.5 דקות. מעביר את supernatant המכיל דגימות RNA שטופלו לצינורות טריים לשלבים הבאים.
  4. להעריך את איכות הכוללת דגימות RNA על ידי fluorometry. שלח את הדגימות למתקן מיוחד עם מכשיר נכון למשימה זו. המתקן יבצע ג'ל אלקטרופורזה על השבב כדי לקבוע את הגדלים של מיני RNA במדגם, דמיינו ידי צבע פלואורסצנטי החדיר בשבב. התוצאות תוחזר כelectropherogram.
    1. לקבוע את היושרה של דגימות RNA הכוללת על ידי הנוכחות או עדר של מוצרים פגומים, כפי שמעיד o הנוכחותפסגות f בין פסגות RNA ריבוזומלי 18S ו5S על electropherogram וכתוצאה מכך (איור 1).

רצף 8. RNA

  1. שלח כוללת דגימות RNA עם איכות גבוהה מספיק (איור 1 א) וכמות (> 3 מיקרוגרם בדרך כלל לספרייה) למרכז מסחרי לבניית רצף של מועשר ספריות לזווג-סוף mRNA ורצף ה- mRNA, הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים.
  2. אם נתיב אחד או יותר משמש לקביעת רצף ניסוי בודד, לפצל ספריות בודדות לשני נתיבים לרצף כדי להסביר וריאציה טכנית בין נתיבים ברצף.

ניקוי קרא 9. lllumina

הערה: איור 2 מסכם את חלק ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה. לקבלת רשימה מלאה של כל התוכניות ומשאבים המשמשים בחלק ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה, עיין בטבלת 1. בבנוסף, קובץ נוסף 1 מכיל דוגמאות שורת הפקודה עבור כל אחד משלבי פרוטוקול ביואינפורמטיקה הבאים.

  1. השתמש ssaha2 29 (טבלת 1) לזהות התאמות של זהות 95% ומעלה למסד נתוני צמח השדה UniVec Core, א '(טבלה 1) רצף albopictus rRNA (# L22060.1 GenBank), ומתאמי רצף (דוגמאות שורת הפקודה מפורטת שנקבעו בקובץ נוסף 1). הסר זוגות קריאה עם גפרורים באמצעות Perl או כלי scripting דומה, למשל על ידי התאמת התסריט סיפק פרל (קובץ נוסף 2).
  2. נקי שנותר קורא עם חבילת SolexaQA 30 (טבלת 1; קובץ נוסף 1): לקצץ אזורים עם מקבילה ציון Phred של פחות מ -20 תוך שימוש בהגדרות ברירת המחדל של DynamicTrim.pl.
    1. הסר קורא נ"ב קצר יותר מ -25 עם LengthSort.pl בשני קדימה ולאחור קוראים בו זמנית. להעריך את האיכות של הקבצים ניקו fastq עם FastQC (טבלת 1 ) - בפרט, לוודא שאיכות רצף לכל בסיס וציוני איכות לכל רצף הם מעל 20.

10. דיגיטלי נורמליזציה

  1. לבצע סיבוב של נורמליזציה דיגיטלית אחד בניקה קורא באמצעות כלי החמר 31 (טבלת 1; קובץ נוסף 1), במיוחד normalize-by-median.py (באמצעות גודל k-mer 20, כיסוי חתך של 20, וx = 1e10).
  2. לחלופין, אם מכונה עם גבוה RAM זמין (מאות GB), להשתמש בסקריפט של טריניטי normalize_by_kmer_coverage.pl (טבלת 1).

11. De עצרת transcriptome Novo

  1. לקבל גישה לאשכול מחשב או מחשב עם עד 256 GB של RAM ו -24 מעבדים, תלוי בגודל של ההרכבה.
  2. השתמש בטריניטי 32 (טבלה 1; קובץ נוסף 1) להרכיב את הקריאה דיגיטלית המנורמלת להגדיר לcontigs. כדי להפחיתשימוש בזיכרון, השתמש --min_kmer_cov 2.

12. עצרת הערכה

  1. הפעל assemblathon_stats.pl מפרויקט Assemblathon2 33 על תפוקת contig טריניטי. סקריפט זה מבצע חישובים בסיסיים רלוונטיים לאיכות הרכבה הערכה, כגון מספר הפיגומים, N50, הרכב הרכבה, ועוד (טבלה 1; קובץ נוסף 1).

13. ביאור של transcriptome מורכבת

  1. בצע Blastx (טבלת 1) של ההרכבה נגד קבוצת חלבון התייחסות; ליתושים, melanogaster דרוזופילה, אנופלס gambiae, כולכית מצוי, וAedes aegypti הפניות מתאימות. באופן ספציפי, לאתחל את קובץ חלבון התייחסות fasta לפיצוץ, ואחריו blastx (קובץ נוסף 1).

14. מפה קוראת לעצרת שימוש RSEM 34 (טבלה 1)

  1. צור קובץ 'תמליל לגן-המפה', שבוהעמודה ראשונה מכילה את תעודות זהות של גן ההתייחסות, והעמודה השנייה את תעודות הזהות של contig. בעורך גיליון אלקטרוני, להחליף את העמודים הראשונים והשני מתפוקת Blastx, ולכתוב טורים אלה לקובץ txt. השתמש בתכנית LINEBREAK להמיר מעברי שורה בקובץ txt וכתוצאה מכך לפורמט יוניקס.
  2. צור מערך התייחסות מקובץ FASTA transcriptome באמצעות סקריפט rsem-להכין-ההתייחסות, המסופק באריזת RSEM (קובץ נוסף 1).
  3. חשב את ערכי הביטוי בנפרד עבור כל ספרייה באמצעות פקודת rsem לחשב הביטוי, המסופקת באריזת RSEM (קובץ נוסף 1). כקורא, להשתמש בקבצים לזווג fastq כתוצאה מצעד ניקוי לקריאה (שלב 9.2).
    1. אם RNA מלשכפל ביולוגי פוצל לשני נתיבים לרצף, כולל שני קבצי fastq בחישוב הביטוי כדי ליצור קובץ יחיד.
  4. להמיר את תוצאות הביטוי מכל ספרייה למטריצת מעובד בקלות על ידי p האחרrograms באמצעות rsem-ליצור-data-מטריצת התסריט סיפקה, המסופקת באריזת RSEM (קובץ נוסף 1).

15. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי

  1. התקן R וEdger (טבלה 1).
  2. השתמש read.delim כדי לטעון את תוצאות RSEM מצעד 14.3 (קובץ נוסף 1). במידת צורך, לעגל. הספירה למספר שלם הקרוב ביותר
    הערה: מדריך Edger ממליץ להגביל את בסיס הנתונים לגנים עם מספיק ביטוי גבוה כדי לזהות משמעות.
  3. כדי לעצב את הנתונים לEdger, ליצור אובייקט DGEList מהקובץ שנטען נתונים (קובץ נוסף 1). לאחר מכן, לנרמל את הנתונים באמצעות הנורמליזציה TMM (קובץ נוסף 1). להעריך את התפוצות הנפוצות וtagwise של הנתונים (קובץ נוסף 1).
  4. זיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי עם Benjamini-הוכברג תיקן p-value <0.05 (קובץ נוסף 1). עלילה ההפצה של יומן-פי-שינוי לעומת שפע (קובץ נוסף 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Fluorometry של שתי דגימות RNA נציג הראה שתי להקות בכ -2,000 NT (איור 1 א ', ב'). RNA ריבוזומלי -28 חרק מורכב משתי רשתות polynucleotide מוחזקות ביחד על ידי קשרי מימן, שהם שיבשו בקלות על ידי חימום או סוכנים המשבשים קשרי מימן 35 קצרים. שני מרכיבים המתקבלים הם בערך באותו גודל כמו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטות לגלות גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בשל photoperiodically דיאפאוזה המושרית בא albopictus. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא משלב באופן ייחודי לגידול יתושים וטכניקות ביואינפורמטיקה לעשות את כל ההיבטים הניסיוניים של תכנית פיזיולוגיה מולקולרית נגישה למשתמ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Incubator - Model 818Thermo-Scientific3751120 V
Controlled environment roomThermax ScientificN/AWalk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulbPhilips3921834 W
Petri Dish 100 mm x 20 mmFisher08-772-E
Filter Paper 20.5 cmFisher09-803-6J
9.5 L BucketPlasticanBway Productshttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting WhiteJoann10173292http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockingsAlbahealth23650-040product no. 081420
Organic RaisinsNewman's OwnUPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)Fisher Scientific03-007-52The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper TowelsSeventh Generation30BPT120
Modular Mates Square Tupperware SetTupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass GrinderCorning Incorporated7727-2These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI ReagentSigma AldrichT9424Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-freeAmbion/Life TechnologiesAM1907This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AAPlace up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane FeederHemotek 5W1This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and ProbeHemotek MT3KFUMicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium CitratePel-Freez Biologicals33130-1The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

93photoperiodicRNA Seq transcriptome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved