في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Summary

بروتين أرجينين مثيلة، يحفزه فئة من الإنزيمات وهي، البروتين الميثيل أرجينين transferases (PRMTs)، هو عملية إضافة الأنزيمية من مجموعة الميثيل (ق) إلى arginines داخل البروتينات. في المختبر فحص الحامض هو الأداة الأكثر الاعتماد عليها لتقييم حالة مثيلة من ركائز PRMT معروفة أو جديدة.

Abstract

بروتين أرجينين مثيلة هي واحدة من التعديلات بعد متعدية الأكثر وفرة في النواة. يمكن تحديد البروتين أرجينين مثيلة و / أو عبر تحديد النهج البروتين و / أو immunoblotting مع الأجسام المضادة المحددة ميثيل أرجينين. ومع ذلك، هذه التقنيات يمكن أن تكون أحيانا مضللة وغالبا ما تقدم نتائج إيجابية كاذبة. الأهم من ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا توفر دليلا مباشرا في دعم خصوصية PRMT الركيزة. في المختبر فحوصات الحامض، من ناحية أخرى، هي فحوصات الكيمياء الحيوية المفيدة، التي تعتبر حساسة، وتكشف باستمرار إذا كانت البروتينات التي تم تحديدها هي في الواقع ركائز PRMT. يتضمن نموذجية في المختبر فحص الحامض المنقى، PRMTs النشطة، الركيزة المنقى والنظائر المشعة وصفت المانحة الميثيل (S-أدينوزيل-L- [ميثيل ³ H] ميثيونين). نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل PRMT1 نشطة حفاز، أحد أفراد الأسرة PRMT أعرب بتواجد مطلق. وليتم اختبار الأنشطة ترانسفيراز thyl من PRMT1 تنقيته في وقت لاحق الراس GTPase تفعيل البروتين البروتين 1 (G3BP1) ملزمة، ركيزة PRMT معروف، في حضور S-أدينوزيل-L- [ميثيل ³ H] ميثيونين كما المانح الميثيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول ليس فقط لإنشاء وضع ركائز جديدة مثيلة من PRMT1 الفسيولوجية، ولكن أيضا لفهم الآلية الأساسية من البروتين أرجينين مثيلة.

Introduction

وكان أول وصف مثيلة البروتين في عام 1968 ^1. لم يكن حتى استنساخ أول من PRMT1 في عام 1996، أن الباحثين بدأوا نقدر أهمية هذا التعديل بعد متعدية ^2. ومن المثير للاهتمام، الميثيلي وحوالي 2٪ من بقايا أرجينين في البروتينات مقتطفات النووية ^3، مما يدل على وفرة من هذا التعديل. أرجينين هو حمض أميني موجبة مع سلسلة الجانبية الأساسية والنيتروجين / س في غضون السلاسل الجانبية للأرجينين يمكن أن يكون بعد translationally تعديل عن طريق إضافة مجموعة الميثيل، وهي عملية تعرف باسم أرجينين مثيلة ^4-6. يتم تحفيز أرجينين مثيلة من قبل فئة من الإنزيمات وهي، transferases البروتين الميثيل أرجينين (PRMTs). Arginines يمكن أن تكون إما monomethylated أو dimethylated وهذا الأخير يمكن أن يكون إما متماثل أو غير متماثل تبعا لنوع من PRMTs تحفيز عملية ^4-6.

البروتينات التي تعرض argininزخارف الإلكتروني جليكاين الغنية هي أهداف محتملة لبوساطة PRMT الحفز. وقد تبين بوساطة PRMT مثيلة من ركائز لتعديل التفاعل البروتين البروتين، البروتين النووي تفاعل حامض، وظيفة البروتين، والتعبير الجيني، و / أو الإشارات الخلوية، والتي تعتبر بالغة الأهمية لالتوازن الخلوي العادي ^7-9. من أجل فهم الدور البيولوجي للبروتين أرجينين مثيلة، يطلب فحوصات دقيقة وفعالة، وقابلة للتكرار لإنشاء مركز مثيلة من ركائز PRMT تحديدها.

في المختبر فحص الحامض، الذي يقيم قدرات PRMTs تنقيته لتحفيز مثيلة من ركائز بهم، هو فحص مقبولة تماما لدراسة مثيلة أرجينين ^10-12. النجاح الشامل لهذا الاختبار يعتمد إلى حد كبير على نشاط PRMTs المنقى. ويمكن التعبير عن PRMTs وتنقيته من البكتيريا، أو خلايا الثدييات ^10،11. هذا الفحص في المختبر مثيلة، ودetailed في قسم البروتوكول، وبناء على الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل تيني وزملاؤه ^10. في هذا البروتوكول، وتبين لنا بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير وتنقية PRMT1 في خلايا الثدييات. تم تقييم قدرة PRMT1 تنقيته لتحفيز مثيلة على رأس GTPase تفعيل بروتين بروتين ملزمة 1 (G3BP1)، وPRMT الركيزة المعروف ^8، في وقت لاحق وجود S-أدينوزيل-L- [ميثيل ³ H] ميثيونين باسم المانحة الميثيل. باستخدام هذا الاختبار، يمكننا تحديد موثوق قدرات PRMTs لرواية ميثيل أو ركائز معروفة، وهي الخطوة الأولى في دراسة البروتين أرجينين مثيلة.

Protocol

1. إعداد التركيبات التعبير

1. قبل البدء في البروتوكول، PRMTs استنساخ في ناقلات التعبير الثدييات مع-N محطة حاتمة العلامة (MYC أو HA)، والركيزة في الإطار مع الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST) للتعبير البروتين رفيع المستوى وتنقيتها من الخلايا البكتيرية لست]، وذلك باستخدام التقنيات البيولوجية الجزيئية القياسية.

2. تنقية PRMTs

1. استخدام 100 ملم الأطباق الثقافة للحفاظ على الخلايا الظهارية القصبية الإنسان (Beas2B). مرور الخلايا كل 3 أيام وعدم السماح لهم تنمو لالتقاء.
2. في اليوم قبل ترنسفكأيشن، البذور 7.5 × 10 ⁵ خلايا في 10 مل مستنبت في طبق ثقافة 100 ملم. دوامة لتفريق بالتساوي الخلايا، واحتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO ₂ الحاضنة.
3. في اليوم التالي، ونضح وسائل الإعلام وإضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة دون المصل والمضادات الحيوية. دوامة ونضح المتوسطة. كرر هذه الخطوة واحدةالمزيد من الوقت، وأخيرا إضافة 5 مل من المصل / متوسطة الحرة المضادات الحيوية والشروع في ترنسفكأيشن.
4. تمييع 6 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 750 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة في العقيمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيك.
5. في 1.5 مل البلاستيك الطرد المركزي أنبوب آخر، تمييع 30 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في 750 ميكرولتر من مصل المتوسطة مجانا.
6. نقل الحل ترنسفكأيشن كاشف المخفف (الخطوة 2.5) إلى أنبوب يحتوي على الحمض النووي المخفف (الخطوة 2.4). المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
7. احتضان الخليط ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
8. بعد 15 دقيقة، ماصة الخليط بلطف على ترنسفكأيشن الخلايا، ودوامة لخلط بالتساوي، واحتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO ₂ الحاضنة.
9. بعد 3 ساعة، نضح المتوسطة التي تحتوي على خليط ترنسفكأيشن من الخلايا. إضافة جديدة خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع المصل والمضادات الحيوية.
10. احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO ₂حاضنة لمدة 48 ساعة.
11. بعد 48 ساعة، ليز الخلايا في 1 مل من تحلل العازلة (1X الفوسفات مخزنة المالحة، 1٪ Nonidet P-40، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم، و 1 ميكروغرام / مل phenlymethyl سلفونيل الفلورايد). جمع لست] في جهاز للطرد المركزي أنبوب بلاستيكي مع رافع الخلية واحتضان لست] على الجليد لمدة 30 دقيقة.
12. الطرد المركزي في 15،000 لست] x ج لمدة 10 دقيقة على جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي لمسح لست] من الحطام الخلية. [* من المستحسن للغاية لتأكيد التعبير عن HA-PRMT1 عبر immunoblotting من قسامة من لست] مع معاداة HA الأجسام المضادة، قبل الشروع في تنقية الانزيمات لفحص الحامض.]
13. لتنقية PRMTs، واحتضان 3 ملغ من الخلية لست] مع 30 ميكرولتر من 50:50 تعليق معاداة HA تقارب مصفوفة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في محور دوار الأنبوب.
14. اليوم التالي، وتدور الأنابيب في 14،000 x ج على جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي لمدة 2 دقيقة لجمعالخرز. تجاهل طاف وتغسل حبات 3X مع 1 مل من RIPA العازلة [20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA و 1٪ تريتون-X-100] في كل غسل تليها الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 2 دقيقة. بعد غسل الثالث، تغسل حبات مرة واحدة مع 100 ميكرولتر من العازلة مثيلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.5، 20 ملي بوكل، 10 ملم MgCl _2، 1 ملم β المركابتويثانول، 100 ملي السكروز). بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف. حبات تحتوي على PRMTs يجمد جاهزة لاستخدامها في فحص الحامض. [* ينصح بشدة استخدام PRMTs يجمد فورا في مقايسة مثيلة.]

3. تنقية الركيزة

1. تلقيح مستعمرة واحدة من GST-BL21 G3BP1 حولت إلى 5 مل من لوريا، Bertani (LB) متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
2. اليوم التالي، ونقل الثقافة بين عشية وضحاها الى 50 مل من الطازجة المتوسطة LB وتابعinue أن تنمو إلى OD ₆₀₀ من 0.5-0.7 (يستغرق حوالي 2 ساعة).
3. عندما يصل OD ₆₀₀ 0.5-0.7، إضافة الآيزوبروبيل-β-D-thiogalactoside (IPTG) إلى تركيز النهائي من 1 ملم والاستمرار في ثقافة لمدة 4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
4. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة، ومعالجة بيليه لتنقية ضريبة المبيعات أو تخزينها في -80 درجة مئوية.
5. إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 5 مل من تحلل العازلة (1X PBS مع مثبطات الأنزيم البروتيني، 100 ميكروغرام / مل من الليزوزيم، و 0.1٪ تريتون-X-100) واحتضان لست] عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في هذا الوقت لست] سيظهر العكرة ولزج بسبب الإفراج عن الحمض النووي الجيني البكتيري.
6. القص الحمض النووي الجيني بواسطة صوتنة (10 نبضات من كل 1 ثانية مع اتساع 30٪).
7. مسح لست] بواسطة الطرد المركزي عند 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة ونقل طاف واضحة إلى أنبوب 15 مل. إذا طاف غير واضح تكرار centrifugation عملية واحدة لمزيد من الوقت.
8. وفي الوقت نفسه، تغسل حبات GST-سيفاروز مرتين مع PBS الجليد الباردة وجعل 50:50 تعليق GST-sepharose و في برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من تعليق GST-sepharose و لالمحللة الخلية البكتيرية التي تم تطهيرها وتناوب على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
9. بعد 1 ساعة، أنابيب الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 3 دقائق لجمع الخرز. تغسل حبات 3X مع الثلج الباردة PBS.
10. بعد غسل النهائي، resuspend والخرز في 100 ميكرولتر من العازلة شطف (50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 30 ملي الجلوتاثيون) وتناوب على 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة.
11. أنابيب الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 2 دقيقة ونقل طاف تحتوي على البروتين النقي في أنبوب الطرد المركزي البلاستيك آخر. تنفيذ SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) تحليل في 5 ميكرولتر من البروتين النقي جنبا إلى جنب مع كميات معروفة من ألبومين المصل البقري (BSA) لتقدير تركيز البروتين النقي.

4. مثلأيشن الفحص

ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في منطقة منفصلة مخصصة للعمل والنظائر المشعة في الامتثال للبروتوكولات المؤسسة على إجراء التجارب مع النظائر المشعة.

1. إضافة 2 ميكروغرام من المنقى GST-الركيزة والتي تحتوي على مزيج الرئيسي 1X عازلة مثيلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.5، 20 ملي بوكل، 10 ملم MgCl _2، 1 ملم β المركابتويثانول، والسكروز 100 ملم)، 1 μCi من S-adenosyl- L- [ميثيل ³ H] ميثيونين، والماء إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر إلى PRMTs يجمد (الخطوة 2.13)، واحتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. بعد 1 ساعة، ووقف رد الفعل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من 2X SDS عينة العازلة. بعد تمسخ من العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وفصل العينات على هلام SDS-PAGE.
3. في وقت لاحق، نقل البروتينات فصلها عن هلام SDS على غشاء النيتروسليلوز باستخدام نقل الكهربي شبه الجافة.
4. بعد نقل، وتغطي الغشاء معutofluor (صورة تكثيف autoradiographic)، وصخرة بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد 2 ساعة، صب قبالة autofluor والاحتفاظ بها لاستخدامها لاحقا. [* تسمية أنبوب كمادة مشعة]
5. بسرعة الهواء يجف الغشاء على ورق الترشيح، وختم في كيس من البلاستيك وتعرض الغشاء إلى فيلم الأشعة السينية في -20 درجة مئوية. يكفي التعرض الوقت يتراوح بين 5-30 أيام.

5. التأكيد التعبير PRMT تحميل والمساواة من الركيزة

1. بعد تحقيق التعرض كافية، ونقل إلى غشاء مربع من البلاستيك تحتوي على عرقلة العازلة [تريس مخزنة المالحة مع توين 20 (TBST + 3٪ الحليب الخالي من الدسم)] وصخرة بلطف لمدة 1 ساعة.
2. تجاهل عازلة تمنع والنفايات المشعة. احتضان الغشاء مع مكافحة HA الأجسام المضادة (1: 1،000 تمييع) في TBST بين عشية وضحاها في 4 ° C، مع هزاز لطيف.
3. يغسل الغشاء مع TBST 3X واحتضان الغشاء مع HRP المسمى مكافحة فأر الضد الثانوية(1: 5،000 تمييع) في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع هزاز لطيف.
4. بعد 1 ساعة، ويغسل الغشاء مع TBST 3X، وإجراء الكشف chemiluminiscence من البروتينات مع الركيزة HRP.
5. بعد الكشف عن PRMTs HA الموسومة، واحتضان الغشاء مع Ponseau-S الحل تلطيخ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل بسرعة 3X الغشاء مع الماء للكشف عن ركائز الموسومة GST. مسح الصورة.

النتائج

تم تحديد قدرات HA-PRMT1 إلى ميثيل GST-G3BP1 من قبل في المختبر فحص الحامض. كان يعمل PRMT1 HA الموسومة تنقيته من الخلية لست] Beas2B في رد فعل مثيلة تحتوي GST-G3BP1، و1 μCi من S-أدينوزيل-L- [ميثيل ³ H] ميثيونين، باعتباره المانح الميثيل. PRMT1 يمكن أن تحفز بكفاءة مثيلة من GST-G3BP1 (الشك...

Discussion

يتم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا بشكل روتيني لتحديد الوضع مثيلة من ركائز PRMT تحديدها. وهذا الاختبار قوي، ومتماسك تقدم أيضا دليل قاطع على خصوصية PRMTs لركائز بهم. المكونات الرئيسية لنجاح هذا الاختبار هي: 1. التعبير عن PRMTs في خلايا الثدييات، 2. آخر من PRMTs المنقى، 3. التعبير و...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific