In vitro metilazione Assay per studiare proteine ​​Arginina Metilazione

Riepilogo

Proteine ​​arginina metilazione, catalizzata da una classe di enzimi viz., Proteina arginina metil transferasi (PRMTs), è il processo di aggiunta enzimatica di gruppi metile (s) per arginines all'interno di proteine. Il test in vitro metilazione è lo strumento più affidabile per valutare lo stato di metilazione di substrati PRMT noti o nuovi.

Abstract

Proteina arginina metilazione è una delle più abbondanti modificazioni post-traduzionali nel nucleo. Proteine ​​arginina metilazione può essere identificato e / o determinato mediante approcci di proteomica, e / o immunoblotting con anticorpi specifici metil-arginina. Tuttavia, queste tecniche a volte possono essere fuorvianti e spesso fornire risultati falsi positivi. Soprattutto, queste tecniche non possono fornire prove dirette a sostegno della specificità di substrato PRMT. In vitro test di metilazione, d'altra parte, sono saggi biochimici utili, che sono sensibili, e costantemente rivelano se le proteine ​​identificate sono davvero substrati PRMT. Un tipico test di metilazione in vitro comprende purificati, PRMTs attivi, substrato purificato e un radioisotopo marcato donatore di metile ^{(S-adenosil-L-[metil-3} H] metionina). Qui si descrive un protocollo step-by-step per isolare PRMT1 cataliticamente attivo, un membro della famiglia PRMT ubiquitariamente espresso. Il meThyl attività transferasi del PRMT1 purificato sono stati successivamente testati su Ras-GTPasi attivando binding protein 1 (G3BP1) proteina, un substrato PRMT noto, in presenza di ^{S-adenosil-L-[metil-3H]} metionina come donatore di metile. Questo protocollo può essere impiegato non solo per stabilire lo stato di metilazione di nuovi substrati PRMT1 fisiologici, ma anche per comprendere il meccanismo di base della proteina arginina metilazione.

Introduzione

Proteine ​​metilazione è stata descritta per la prima nel 1968 ^1. Fu solo la prima clonazione di PRMT1 nel 1996, che i ricercatori hanno cominciato ad apprezzare l'importanza di questa modificazione post-traslazionale ^2. È interessante notare che circa il 2% dei residui di arginina nelle proteine ​​di estratti nucleari sono metilato ^3, che indica l'abbondanza di questa modifica. L'arginina è un aminoacido carico positivamente con una catena laterale di base ei azoto / s all'interno delle catene laterali di arginina può essere post-traduzionali modificato mediante l'aggiunta di un gruppo metile, un processo noto come arginina metilazione ^4-6. Metilazione Arginina è catalizzata da una classe di enzimi viz., Transferasi proteine ​​metile arginina (PRMTs). Arginine possono sia essere monometilato o dimethylated la quale può essere sia simmetrica o asimmetrica a seconda del tipo di PRMTs catalizzano il processo ^4-6.

Le proteine ​​che visualizzano argininaricchi di motivi e-glicina sono potenziali bersagli per la catalisi PRMT-mediata. PRMT mediata da metilazione dei substrati è stato dimostrato di modulare l'interazione proteina-proteina, l'interazione proteina-acido nucleico, la funzione della proteina, l'espressione genica, e / o di segnalazione cellulare, che sono tutti critici per la normale omeostasi cellulare ^7-9. Al fine di comprendere il ruolo biologico delle proteine ​​arginina metilazione, precisi, efficienti e riproducibili test sono necessari per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati.

In vitro la metilazione, che valuta le capacità di PRMTs purificati per catalizzare metilazione dei loro substrati, è un saggio ben accettato per lo studio metilazione arginina ^10-12. Il successo complessivo di questo test dipende in gran parte l'attività dei PRMTs purificati. PRMTs possono essere espressi e purificati da batteri o cellule di mammifero ^10,11. Questa metilazione test in vitro, come dNell'odontoiatria nella sezione del protocollo, si basa su un metodo originariamente descritto da Tini e colleghi ^10. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio i passaggi necessari per l'espressione e la purificazione di PRMT1 in cellule di mammifero. La capacità del PRMT1 purificato per catalizzare metilazione su Ras-GTPasi attivando la proteina binding protein 1 (G3BP1), un noto substrato PRMT ^8, è stato poi valutato in presenza di ^{S-adenosil-L-[metil-3} H] metionina come donatore di metile. Usando questo test, possiamo definire in modo affidabile le capacità dei PRMTs di romanzo metilato o substrati noti, che è un passo fondamentale nello studio della proteina arginina metilazione.

Protocollo

1 Preparazione di costrutti di espressione

1. Prima di iniziare il protocollo, PRMTs clone in vettori di espressione di mammifero con un epitopo tag N-terminale (Myc o HA), e il substrato in-frame con glutatione-S-transferasi (GST) per l'espressione di proteine ​​di alto livello e la purificazione da cellule batteriche lisati, utilizzando tecniche di biologia molecolare standard.

2 Purificazione di PRMTs

1. Usare piatti 100 mm di coltura per mantenere le cellule umane epiteliali bronchiali (Beas2B). Passage le cellule ogni 3 giorni e non lasciarli crescere a confluenza.
2. Il giorno prima della trasfezione, seminare 7.5 x 10 ⁵ cellule in 10 ml di terreno di coltura in un piatto di cultura a 100 mm. Agitare per disperdere uniformemente le cellule, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5%.
3. Il giorno successivo, aspirare i media e aggiungere 5 ml di coltura senza siero e antibiotici. Agitare e aspirare il terreno. Ripetere questo passo sipiù tempo, e, infine, aggiungere 5 ml di siero / terreno privo di antibiotici e procedere alla trasfezione.
4. Diluire 6 mg di DNA plasmidico in 750 ml di mezzo privo di siero in una sterile da 1,5 ml di tubo di plastica da centrifuga.
5. In un altro 1,5 ml tubo da centrifuga di plastica, diluire 30 ml di reagente di trasfezione in 750 ml di mezzo privo di siero.
6. Trasferire la soluzione reagente di trasfezione diluito (punto 2.5) alla provetta contenente DNA diluito (punto 2.4). Mescolare delicatamente pipettando su e giù parecchie volte.
7. Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 15 min.
8. Dopo 15 minuti, pipettare la miscela di trasfezione delicatamente sulle celle, agitare per mescolare in modo uniforme, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5%.
9. Dopo 3 ore, aspirare il terreno contenente miscele di trasfezione delle cellule. Aggiungere fresco terreno di coltura cellulare integrato con siero e antibiotici.
10. Incubare a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO ₂incubatore per 48 ore.
11. Dopo 48 ore, lisare le cellule in 1 ml di tampone di lisi (1x tampone fosfato salino, 1% Nonidet P-40, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% di sodio dodecil solfato, e 1 mg / ml phenlymethyl sulfonil fluoruro). Raccogliere i lisati in un tubo da centrifuga di plastica con un sollevatore cellulare e incubare i lisati in ghiaccio per 30 min.
12. Centrifugare i lisati a 15.000 xg per 10 minuti su una centrifuga da banco per cancellare i lisati da detriti cellulari. [* Si consiglia vivamente di confermare l'espressione di HA-PRMT1 tramite immunoblotting di una aliquota dei lisati con anticorpi anti-HA, prima di procedere alla purificazione degli enzimi per l'analisi di metilazione.]
13. Per la purificazione di PRMTs, incubare 3 mg di lisati cellulari con 30 ml di sospensione 50:50 di anti-HA matrice di affinità in tampone fosfato salino (PBS), e ruotare notte a 4 ° C in un rotatore tubo.
14. Il giorno dopo, girare le provette a 14000 g in una centrifuga da banco per 2 minuti per raccoglierele perline. Eliminare il surnatante e lavare le perline 3x con 1 ml di tampone RIPA [20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA e 1% Triton-X-100] in ogni lavaggio seguito da centrifugazione a 14000 g per 2 min. Dopo il terzo lavaggio, lavare le perle di una volta con 100 ml di buffer di metilazione (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 1 mM β-mercaptoetanolo, saccarosio 100 mm). Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante. Le perle contenenti i PRMTs immobilizzati sono pronti per essere utilizzati nel test di metilazione. [* Si consiglia vivamente di utilizzare i PRMTs immobilizzati immediatamente nel test di metilazione.]

3. Purificazione di substrato

1. Inoculare una singola colonia di GST-G3BP1 trasformato BL21 in 5 ml di Luria-Bertani (LB) medium contenenti 100 mg / ml di ampicillina. Far crescere le culture per una notte a 37 ° C con agitazione a 250 rpm.
2. Il giorno dopo, trasferire la cultura durante la notte a 50 ml di terreno LB fresco e continue a crescere ad un OD ₆₀₀ di 0,5-0,7 (Ci vogliono circa 2 ore).
3. Quando il diametro esterno ₆₀₀ raggiunge 0,5-0,7, aggiungere isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e continuare a cultura per ulteriori 4 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm.
4. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 10 minuti, ed elaborare il pellet per la purificazione GST o conservare a -80 ° C.
5. Risospendere il pellet batterico in 5 ml di tampone di lisi (PBS 1x con inibitori della proteasi, 100 ug / ml di lisozima e 0,1% Triton-X-100) e incubare i lisati a 37 ° C per 30 min. In questo momento i lisati appariranno torbido e viscoso a causa del rilascio di DNA genomico batterico.
6. Shear il DNA genomico mediante sonicazione (10 impulsi di 1 secondo ciascuno con un'ampiezza di 30%).
7. Cancellare i lisati di centrifugazione a 15.000 xg per 10 minuti e trasferire il surnatante limpido in una provetta da 15 ml. Se il surnatante è chiaro non ripetere l'centrifugogazione processo ancora una volta.
8. Nel frattempo, lavare le perle GST-sefarosio due volte con PBS freddo ghiaccio e fare una sospensione di 50:50 GST-sefarosio in PBS. Aggiungere 200 microlitri della sospensione GST-sefarosio al lisato cellulare batterica eliminato e ruotare a 4 ° C per 1 ora.
9. Dopo 1 ora, centrifugare le provette a 500 xg per 3 minuti per raccogliere le perline. Lavare le perline 3x con ghiaccio freddo PBS.
10. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 100 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutatione) e ruotare a 4 ° C per 10 min.
11. Centrifugare le provette a 15.000 xg per 2 minuti e trasferire il surnatante contenente la proteina purificata in un'altra provetta da centrifuga di plastica. Effettuare SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) analisi su 5 microlitri della proteina purificata insieme con quantità note di albumina di siero bovino (BSA) per stimare la concentrazione della proteina purificata.

4. Metilazione Assay

NOTA: Effettuare operazioni seguenti in una zona separata designata per il lavoro radioisotopo e in conformità con i protocolli delle istituzioni su come eseguire gli esperimenti con isotopi radioattivi.

1. Aggiungere 2 mg di purificato GST-substrato e una master mix contenente tampone metilazione 1x (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 1 mM β-mercaptoetanolo, saccarosio 100 mm), 1 μCi di S-adenosyl- L- ^[metil-3H] metionina e acqua ad un volume finale di 10 pl alle PRMTs immobilizzati (passo 2.13) e incubare la reazione a 30 ° C per 1 ora.
2. Dopo 1 ora, fermare la reazione aggiungendo 10 ml di tampone campione 2x SDS. Dopo denaturazione dei campioni a 95 ° C per 10 min, separare i campioni su un gel SDS-PAGE.
3. Più tardi, trasferire le proteine ​​separate dal gel SDS su membrana di nitrocellulosa mediante un trasferimento elettroforetico semi-secco.
4. Dopo il trasferimento, coprire la membrana con unutofluor (un intensificatore di immagine autoradiografica), e delicatamente roccia per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo 2 ore, versare fuori il autofluor e conservare per un uso successivo. [* Etichettare la provetta come materiale radioattivo]
5. Aria rapidamente asciugare la membrana su una carta da filtro, sigillarlo in un sacchetto di plastica e di esporre la membrana di una pellicola a raggi X a -20 ° C. Tempo di esposizione sufficiente varia tra 5-30 giorni.

5 Conferma di PRMT espressione e Pari carico di substrato

1. Dopo aver raggiunto le esposizioni sufficienti, trasferire la membrana di una scatola di plastica contenente tampone bloccante [salina tamponata con Tris con Tween-20 (TBST + latte scremato 3%)] e scuoterla delicatamente per 1 ora.
2. Scartare il tampone bloccante come rifiuti radioattivi. Incubare la membrana con anticorpi anti-HA (1: 1.000 diluizione) in TBST notte a 4 ° C, con dolce dondolio.
3. Lavare la membrana con TBST 3x e incubare la membrana con l'anticorpo secondario HRP-marcato anti-topo(1: 5.000 diluizione) in TBST a temperatura ambiente per 1 ora con dolce dondolio.
4. Dopo 1 ora, lavare la membrana con TBST 3x, ed eseguire il rilevamento chemiluminescenza di proteine ​​con un substrato HRP.
5. Dopo la rilevazione dei PRMTs HA-tag, incubare la membrana con soluzione colorante Ponseau-S per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare rapidamente le 3x membrana con acqua per rilevare i substrati GST-tagged. Eseguire la scansione dell'immagine.

Risultati

Le capacità di HA-PRMT1 a metilato GST-G3BP1 sono stati determinati da un test in vitro metilazione in. PRMT1 HA-tag purificata da lisati cellulari Beas2B è stato impiegato in una reazione di metilazione contenente GST-G3BP1, e 1 μCi di ^{S-adenosil-L-[metil-3} H] metionina, come donatore di metile. PRMT1 potrebbe efficacemente catalizzare la metilazione di GST-G3BP1 (Figura 1, pannello superiore). Reazioni di metilazione mediante pull-down eseguite su lisati di vuoto ...

Discussione

Il protocollo qui descritto è abitualmente utilizzato per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati. Questo test robusto e coerente fornirà anche prove definitive sulla specificità del PRMTs per i loro substrati. I componenti chiave per il successo di questo test sono: 1 Espressione di PRMTs in cellule di mammifero, 2 attività di PRMTs purificati, 3 Espressione e purificazione di substrato, e 4 completo trasferimento occidentale delle proteine ​​alla membrana di nitrocellulosa.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific