In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Zusammenfassung

Protein-Arginin-Methylierung durch eine Klasse von Enzymen katalysiert viz., Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), ist das Verfahren der enzymatischen Addition von Methyl-Gruppe (n) Arginine in Proteinen. Die in-vitro-Methylierungstest ist die zuverlässigste Werkzeug für die Beurteilung der Methylierungsstatus von bekannten oder neuen PRMT Substraten.

Zusammenfassung

Protein-Arginin-Methylierung ist eine der am häufigsten vorkommenden posttranslationalen Modifikationen in den Zellkern. Protein-Arginin-Methylierung können identifiziert und / oder durch proteomische Ansätze bestimmt und / oder Immunoblotting mit Methyl-Arginin-spezifischen Antikörpern. Diese Techniken können manchmal irreführend sein und oftmals falsch positive Ergebnisse. Am wichtigsten ist, können diese Techniken nicht einen direkten Beweis zur Unterstützung der PRMT Substratspezifität. In vitro Methylierung Assays auf der anderen Seite, sind nützlich biochemische Assays, die empfindlich sind und durchweg zeigen, ob die identifizierten Proteine ​​sind in der Tat PRMT Substraten. Eine typische in vitro-Methylierungsassay enthält gereinigtes, aktives PRMTs gereinigte Substrat und einem Radioisotop markiert Methyldonors ^{(S-Adenosyl-L-[Methyl-3} H]-Methionin). Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu katalytisch aktiven PRMT1, ein ubiquitär exprimiert PRMT Familienmitglied zu isolieren. Die michthyl-Transferase-Aktivitäten der gereinigten PRMT1 wurden später auf Ras-GTPase-aktivierendes Protein-Bindungsprotein 1 (G3BP1), einem bekannten PRMT Substrat getestet, in Gegenwart von ^{S-Adenosyl-L-[Methyl-3} H] Methionin als Methyl-Donor. Dieses Protokoll kann nicht nur zur Bestimmung des Methylierungsstatus von neuen physiologischen PRMT1 Substrate, sondern auch für das Verständnis des grundlegenden Mechanismus der Protein-Arginin-Methylierung eingesetzt werden.

Einleitung

Protein-Methylierung wurde erstmals im Jahre 1968 beschrieben ^1. Es war nicht bis zum ersten Klonen von PRMT1 im Jahr 1996, dass die Forscher begannen, die Bedeutung dieser post-translationale Modifikation ² zu schätzen wissen. Interessanterweise etwa 2% der Argininreste in den Proteinen des Zellkernextrakten methyliert ^3, was die Häufigkeit dieser Modifikation. Arginin ist eine positiv geladene Aminosäure mit basischer Seitenkette und der Stickstoff / s in den Seitenketten von Arginin kann posttranslational durch die Zugabe einer Methylgruppe, einem Verfahren, wie Arginin Methylierung ^4-6 bekannt sind, modifiziert. Arginin-Methylierung wird durch eine Klasse von Enzymen katalysiert nämlich., Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs). Arginine entweder monomethylierte oder dimethyliert, und letztere kann entweder symmetrisch oder asymmetrisch sein, abhängig von der Art des PRMTs Katalyse der Prozess ^4-6.

Proteine, die Arginin anzeigenE-Glycin-reiche Motive sind mögliche Ziele für PRMT-vermittelten Katalyse. PRMT-vermittelte Methylierung von Substraten wurde gezeigt, dass Protein-Protein-Wechselwirkung, Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung, Proteinfunktion, Genexpression und / oder zelluläre Signal, die alle für die normale zelluläre Homöostase ^7-9 modulieren. Um die biologische Rolle von Protein-Arginin-Methylierung zu verstehen, werden genaue, effiziente und reproduzierbare Tests erforderlich, um den Methylierungsstatus der identifizierten PRMT Substraten herzustellen.

In-vitro-Methylierungsassay, der die Fähigkeiten des gereinigten PRMTs ausgewertet Methylierung ihrer Substrate katalysieren, ist eine gut akzeptierte Assays zur Untersuchung Arginin Methylierung ^10-12. Der Gesamterfolg dieses Tests hängt weitgehend von der Aktivität der gereinigten PRMTs. PRMTs exprimiert und aus Bakterien oder Säugetierzellen ^10,11, gereinigt werden. Diese in-vitro-Methylierungsassay, wie din der Protokollabschnitt etailed, basiert auf einer Methode, die ursprünglich von Tini und Kollegen ¹⁰ beschrieben basiert. In diesem Protokoll zeigen wir im Detail die Schritte in der Expression und Reinigung von PRMT1 in Säugerzellen. Die Fähigkeit des gereinigten PRMT1 Methylierung Ras-GTPase-aktivierendes Protein katalysieren binding protein 1 (G3BP1), einem bekannten PRMT Substrat ⁸ wurde später in der Gegenwart von ^{S-Adenosyl-L-[Methyl-3} H]-Methionin als ermittelten Methyldonor. Unter Verwendung dieses Tests können wir zuverlässig die Fähigkeiten der PRMTs definieren Methylat neuen oder bekannten Substrate, die eine primäre Schritt bei der Untersuchung von Protein-Arginin-Methylierung ist.

Protokoll

1. Herstellung der Expressionskonstrukte

1. Vor dem Starten des Protokolls Klon PRMTs in Säugetier-Expressionsvektoren mit einer N-terminalen Epitop-Tag (Myc oder HA), und das Substrat in-frame mit Glutathion-S-Transferase (GST) für High-Level-Proteinexpression und Aufreinigung von Bakterienzellen Lysaten unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken.

2. Reinigung von PRMTs

1. Verwenden Sie 100 mm Kulturschalen für die menschliche bronchialen Epithelzellen (Beas2B) zu halten. Durchgang die Zellen alle 3 Tage und lassen Sie sie nicht zu Zusammenfluss wachsen.
2. Am Tag vor der Transfektion Saatgut 7,5 x 10 ⁵ Zellen in 10 ml Kulturmedium in einer 100 mm Kulturschale. Wirbel um gleichmäßig zu verteilen, die Zellen, und bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator.
3. Am nächsten Tag, aspirieren die Medien und mit 5 ml Kulturmedium ohne Serum und Antibiotika. Wirbeln und saugen das Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt einmehr Zeit, und schließlich mit 5 ml Serum / Antibiotika-freiem Medium, und fahren Sie Transfektion.
4. Verdünnen 6 ug Plasmid-DNA in 750 ul serumfreiem Medium in einem sterilen 1,5 ml-Plastikzentrifugenröhrchen.
5. In einer weiteren 1,5 ml-Plastikzentrifugenröhrchen verdünnt 30 ul Transfektionsreagenz in 750 ul serumfreiem Medium.
6. Übertragen Sie die verdünnte Lösung Transfektionsreagenz (Schritt 2.5), um das Röhrchen mit DNA verdünnt (Schritt 2.4). Vorsichtig mischen und Abpipettieren mehrmals.
7. Inkubieren der Transfektion Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.
8. Nach 15 min, Pipette die Transfektion Mischung sanft auf die Zellen, Wirbel gleichmäßig zu mischen, und bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator.
9. Nach 3 Stunden absaugen Medium mit Transfektion Mischungen aus den Zellen. Fügen Sie frisches Zellkulturmedium mit Serum und Antibiotika ergänzt.
10. Bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO ₂Inkubator für 48 Stunden.
11. Nach 48 Stunden lysieren die Zellen in 1 ml Lyse-Puffer (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 1% Nonidet P-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat und 1 ug / ml phenlymethyl Sulfonylfluoridform). Sammle die Lysate in ein Kunststoffzentrifugenröhrchen mit einem Zellheber und Inkubation der Lysate auf Eis für 30 min.
12. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 15.000 g für 10 min auf einer Tischzentrifuge, um die Lysate von Zelltrümmer zu entfernen. [* Es wird dringend empfohlen, die Expression von HA-PRMT1 über Immunoblotting eines Aliquots der Lysate mit Anti-HA-Antikörper, bevor Sie fortfahren, um die Reinigung der Enzyme für Methylierungstest bestätigen.]
13. Zur Reinigung von PRMTs inkubieren 3 mg von Zelllysaten mit 30 ul 50:50 Suspension von Anti-HA-Affinitätsmatrix in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), und drehbar über Nacht bei 4 ° C in einem Rohrdrehgelenk.
14. Nächsten Tag drehen die Rohre bei 14.000 xg auf einer Tischzentrifuge für 2 min zu sammelndie Perlen. Überstand verwerfen und Waschen der Kügelchen 3x mit 1 ml RIPA-Puffer [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA und 1% Triton-X-100] in jedem Waschen durch Zentrifugation bei 14.000 g für 2 Minute Nach dem dritten Waschen, Waschen der Kügelchen einmal mit 100 ul Methylierungspuffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 1 mM β-Mercaptoethanol, 100 mM Saccharose). Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen. Die Perlen, die die immobilisiert PRMTs sind bereit, bei der Methylierung Assay verwendet werden. [* Es wird dringend empfohlen, die immobilisiert PRMTs sofort in der Methylierungstest zu verwenden.]

3. Reinigung der Substrat

1. Inokulieren eine einzelne Kolonie von GST-G3BP1 transformierten BL21 in 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium, enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Wachsen die Kulturen über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 UpM.
2. Am nächsten Tag überweisen Sie den Nacht-Kultur auf 50 ml frisches LB-Medium und Fortsetzunginue zu einer OD ₆₀₀ von 0,5-0,7 wachsen (es dauert ca. 2 h).
3. Wenn die OD ₆₀₀ 0,5-0,7 erreicht, fügen Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM und weiterhin Kultur für weitere 4 Stunden bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 UpM.
4. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 10 min und verarbeiten das Pellet für GST Reinigung oder bei -80 ° C.
5. Resuspendieren der Bakterienpellet in 5 ml Lyse-Puffer (1 × PBS mit Proteaseinhibitoren, 100 ug / ml Lysozym und 0,1% Triton-X-100) und Inkubation der Lysate bei 37 ° C für 30 min. Zu diesem Zeitpunkt werden die Lysate trübe und viskos aufgrund der Freisetzung der bakteriellen genomischen DNA auftreten.
6. Scherung der genomischen DNA durch Ultraschallbehandlung (10 Impulse jeder mit einer Amplitude von 30% 1 sec).
7. Deaktivieren Sie die Lysate durch Zentrifugation bei 15.000 g für 10 min und übertragen Sie die klare Überstand in ein 15-ml-Tube. Wenn der Überstand ist nicht klar, die centrifu wiederholengation Prozess noch einmal.
8. Inzwischen, waschen Sie die GST-Sepharose-Kügelchen zweimal mit eiskaltem PBS und eine 50:50 Aussetzung der GST-Sepharose in PBS. Jeweils 200 ul des GST-Sepharose-Suspension auf die frei bakteriellen Zelllysat und rotieren bei 4 ° C für 1 Stunde.
9. Nach 1 Stunde Zentrifugation der Röhrchen bei 500 g für 3 min, um die Perlen zu sammeln. Waschen der Kügelchen 3x mit eiskaltem PBS.
10. Nach dem letzten Waschen, Resuspendieren der Kügelchen in 100 ul Elutionspuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM Glutathion) und drehen sich bei 4 ° C für 10 min.
11. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 g für 2 min und den Überstand der gereinigten Protein enthält, in einem anderen Kunststoffzentrifugenröhrchen. Durchführung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse von 5 ul des gereinigten Proteins mit bekannten Mengen an Rinderserumalbumin (BSA), um die Konzentration des gereinigten Proteins zu bestimmen.

4. Methylierung Assay

HINWEIS: Führen Sie folgende Schritte in einem Radioisotop für Arbeit und in Übereinstimmung mit den Protokollen des Instituts auf die Durchführung von Experimenten mit radioaktiven Isotopen bezeichnet separaten Bereich.

1. Add 2 ug von gereinigtem GST-Substrat und einer Master-Mix, enthaltend 1x Methylierungspuffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 1 mM β-Mercaptoethanol, 100 mM Saccharose), 1 uCi S-Adenosyl ^L-[Methyl-3 H]-Methionin und Wasser auf ein Endvolumen von 10 ul zu den immobilisierten PRMTs (Schritt 2.13), und Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 1 Stunde.
2. Nach 1 Stunde, stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 2x SDS-Probenpuffer. Nach der Denaturierung der Proben bei 95 ° C für 10 min, Trennen der Proben auf einem SDS-PAGE-Gel.
3. Später übertragen die aufgetrennten Proteine ​​aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines halbtrockenen elektrophoretischen Transfer.
4. Nach der Übertragung umfassen die Membran mit einemutofluor (eine autoradiographische Bildverstärker) und schaukeln für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach 2 Stunden, abgießen autofluor und behalten für die spätere Verwendung. [* Das Röhrchen als radioaktives Material]
5. Luft trocknen schnell die Membran auf ein Filterpapier, versiegeln in einem Kunststoffbeutel und setzen die Membran auf einem Röntgenfilm bei -20 ° C. Ausreichende Belichtungszeit liegt zwischen 5-30 Tagen.

5. Bestätigung des PRMT Expression und gleichmäßige Beladung des Substrats

1. Nach Erreichen einer ausreichenden Engagements, übertragen Sie die Membran auf eine Kunststofffenster mit Blocking-Puffer [Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST + 3% fettfreier Milch)], und schaukeln für 1 Stunde.
2. Entsorgen Sie die Blockierungspuffer als radioaktiver Abfall. Inkubieren der Membran mit anti-HA-Antikörper (1: 1000 Verdünnung) in TBST über Nacht bei 4 ° C, unter leichtem Schütteln.
3. Waschen Sie die Membran mit TBST 3x und Inkubation der Membran mit HRP-markierte Anti-Maus-Sekundärantikörper(1: 5000 Verdünnung) in TBST bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
4. Nach 1 Stunde, waschen Sie die Membran mit TBST 3x, und führen Chemilumineszenz Detektion von Proteinen mit einem HRP-Substrat.
5. Nach Erkennen des HA-markierten PRMTs, Inkubation der Membran mit Ponseau-S-Färbelösung für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen schnell die Membran 3x mit Wasser, um die GST-markierten Substraten zu erkennen. Scannen Sie das Bild.

Ergebnisse

Die Fähigkeit von HA-PRMT1 GST-G3BP1 methylieren wurden durch einen in-vitro-Methylierungsassay bestimmt. HA-getaggte PRMT1 von Beas2B Zelllysate gereinigt wurde, in einem Methylierungsreaktion enthaltende GST-G3BP1 verwendet und 1 uCi von ^{S-Adenosyl-L-[Methyl-3} H]-Methionin als Methyl-Donor. PRMT1 könnte effizient katalysieren die Methylierung von GST-G3BP1 (Abbildung 1, oben). Methylierungsreaktionen mit Pulldown-Menüs auf Lysaten von leeren Vektor transfizierten Zellen Be...

Diskussion

Das hierin beschriebene Protokoll wird routinemäßig verwendet, um den Methylierungsstatus der identifizierten PRMT Substraten herzustellen. Diese robuste und konsistente Assay wird auch definitive Beweise für die Spezifität der PRMTs für ihre Substrate. Die Schlüsselkomponenten für den Erfolg dieses Tests sind: 1. Die Expression von PRMTs in Säugerzellen, 2. Aktivität von gereinigtem PRMTs, 3. Expression und Reinigung des Substrats, und 4. Vollständige westlichen Transfer der Proteine ​​auf die Nitrocellul...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific