إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Summary

نقدم طريقة إعداد الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون عالية الدقة المجهر. الميكا شفافة ومسطحة على المقياس الذري، ولكن نادرا ما تستخدم في التصوير بسبب التعامل مع الصعوبات؛ إعداد لدينا في النتائج حتى ترسب ورقة الميكا، ويقلل من المواد المستخدمة في إعداد طبقة ثنائية.

Abstract

وتستخدم على نطاق واسع بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs) كنموذج لدراسة خصائص الغشاء (مرحلة الانفصال، والتجميع، وديناميات) وتفاعله مع مركبات أخرى، مثل المخدرات أو الببتيدات. ولكن خصائص SLB تختلف تبعا لدعم استخدامها.

التقنيات المستخدمة عادة لSLB التصوير والقياسات هي واحدة جزيء المجهري مضان، FCS والقوة الذرية المجهري (AFM). لأن تتم معظم الدراسات التصوير الضوئي خارجا على الدعم الزجاج، في حين يتطلب فؤاد على سطح مستو للغاية (الميكا عموما)، لا يمكن مقارنة النتائج من هذه التقنيات بشكل مباشر، لأن هذا الاتهام ونعومة خصائص هذه المواد تؤثر بشدة نشرها. للأسف، ومستوى عال من البراعة اليدوية اللازمة لقطع ولصق شرائح رقيقة من الميكا إلى شريحة زجاجية يمثل عقبة أمام الاستخدام الروتيني للالميكا لإعداد SLB. على الرغم من أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة من خيار، مثل إعداد الميكاالأسطح غالبا ما ينتهي الأمر متفاوتة (متموج) ويصعب الصورة، وخاصة مع المسافة العمل الصغيرة، وارتفاع العدسات الفتحة العددية. ونحن هنا نقدم وسيلة بسيطة وقابلة للتكرار لإعداد رقيقة، والسطوح الميكا شقة لترسب الدهون حويصلة وإعداد SLB. بالإضافة إلى ذلك، لدينا غرفة العرف يتطلب سوى كميات صغيرة جدا من حويصلات لتشكيل SLB. نتائج الإجراء العام في كفاءة الإنتاج، بسيطة وغير مكلفة ذات جودة عالية السطوح الدهون طبقة ثنائية قابلة للمقارنة مباشرة لتلك المستخدمة في الدراسات فؤاد.

Introduction

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار طريقة لإعداد الأسطح الميكا لتصوير عالية الدقة من الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs) باستخدام المجهر الضوئي مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRFM) أو المجهري متحد البؤر، والتي يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع القوة الذرية المجهري (AFM).

SLBs هي النموذج المستخدم على نطاق واسع لدراسات عديدة من تجمع الدهون، مرحلة الانفصال، وديناميات مكونات طبقة ثنائية أو تفاعلاتها مع الببتيدات والبروتينات أو غيرها من المركبات ^1-5. يمكن استخدامها ركائز مختلفة لتشكيل SLB (أي الزجاج، والميكا، وثاني أكسيد السيليكون، والبوليمرات) تبعا لطبيعة الدراسة ^4،6-8. دراسات غشاء نموذجية تعتمد على تقنيات التصوير القائم على الفحص المجهري، مثل TIRFM وفؤاد. وبالتالي، لتصوير TIRFM، سطح الزجاج هو خيار نموذجي لأن الزجاج الشفاف. إعداد كوب من السهل نسبيا، ونوعية النتائج هو في المقام الأوليحدده سطح شامل تنظيف قبل ترسب الدهون الحويصلات. فؤاد بسبب قرار المحورية العالية يتطلب السطوح الميكا. الميكا هو معدن سيليكات، مع ما يقرب من الكمال الانقسام القاعدية. وبالتالي، فإن الميكا المشقوق حديثا مسطح بالذرة، مما يتيح مراقبة الخلافات ارتفاع الغشاء حتى على مقياس متناهي الصغر الفرعية ^9.

وأظهرت دراسات نشرها باستخدام أساليب مثل التحليل الطيفي علاقة مضان (FCS)، جزيء واحد تتبع (SMT)، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) مع ذلك، أن ديناميات غشاء الدهون تعتمد اعتمادا كبيرا على نوع من السطحية التي تترسب على أنهم، حيث الزجاج والميكا على نطاق واسع يمكن أن تعطي نتائج متفاوتة ^10،11. وتشمل هذه الخلافات ليس فقط معاملات نشر تحقيقات الغشاء، ولكن أيضا للكشف عن السكان منفصلة من الجزيئات نشرها مع أسعار مختلفة، وربما التبديل بين ولايات مختلفة.

وبالتالي،المقارنة المباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات TIRFM وفؤاد هو في كثير من الأحيان إشكالية، إلا إذا كان السطح نفسه (في هذه الحالة الميكا) يستخدم. على الرغم من أن هناك بعض الدراسات التي أجريت TIRFM والتصوير فؤاد طبقة ثنائية الميكا على نفس السطح ^12،13، ونادرا ما يستخدم لالميكا المجهر الضوئي، ومعظمهم بسبب مشاكل التعامل معها. إعداد الميكا يتطلب القطع باليد الى منشورات رقيقة، والتي يتم بعد ذلك لصقها على ساترة باستخدام لاصق البصرية ^12. ولكن هذا الأسلوب يتطلب بعض الممارسة لتحقيق نتائج مرضية. وعلاوة على ذلك، فإن الأسطح التي تم الحصول عليها في كثير من الأحيان مائج وسميكة، مما يجعل من الصعب استخدامها مع مسافة العمل المنخفضة، وارتفاع العدسات الفتحة العددية.

السطوح الميكا أعدت على النحو المبين في هذا البروتوكول هي رقيقة جدا (~ 220 ميكرون، بما في ذلك سمك ساترة من 170 ميكرون) ومسطحة للغاية، وتجنب "التموج"، وهو أمر حاسم لنجاح عالية الدقة التصوير. يمكن استخدامهالTIRFM أو متحد البؤر الاجهزة. علاوة على ذلك، نفس العينات يمكن نقلها إلى فؤاد، وحتى تصويرها في وقت واحد مع TIRFM / متحد البؤر وفؤاد. الجمع بين هاتين التقنيتين تسمح علاقة مباشرة السلوك نشرها مع هيكل الغشاء طبقة ثنائية ^14. لأن الأسطح الميكا والمشقوق حديثا، فهي نظيفة ولا تتطلب وقتا طويلا، وضعف استنساخه، وإجراءات التنظيف يحتمل أن تكون خطرة (تشمل البروتوكولات تنظيف الزجاج عادة المواد الكيميائية مثل البيرانا حل، وحامض الكبريتيك، والصوديوم / البوتاسيوم هيدروكسيد). تصاعد من غرفة صغيرة، كما هو موضح في البروتوكول، ويقلل من حجم الحويصلات المطلوبة لتشكيل طبقة ثنائية فعالة إلى أقل من 50 ميكرولتر. أخيرا، والعملية برمتها التجمع السطح ليست مضيعة للوقت (إعداد تستغرق أقل من 30 دقيقة)، و لا يتطلب درجة عالية من المهارة اليدوية، وكذلك الانقسام الميكا التقليدية ولصق.

Protocol

1. ميكا وإعداد الشرائح

1. المكان رقم 1 ½ (0.17 ملم) coverslips في تلطيخ الرف.
2. يصوتن لمدة 30 دقيقة في 2٪ المنظفات في 60 درجة مئوية.
3. يغسل 20 مرات مع الماء منزوع الأيونات.
4. إزالة الشرائح باستخدام ملقط وضربة الجافة باستخدام الهواء المضغوط أو النيتروجين.
5. قطع ورقة الميكا إلى 10 × 10 مم قطع مربعة باستخدام مقص أو شفرة حلاقة.
6. قطع كل قطعة الميكا في 2-3 منشورات أرق باستخدام شفرة حلاقة.
   ملاحظة: يتطلب هذا خطوة استخدام شفرة حادة.

2. الجمعية ميكا وغرفة تصاعد

1. شريحة زجاجية مجهرية نظيفة مع الايثانول.
2. النشرة الغراء من الميكا قطع في الخطوة 1.6 إلى شريحة زجاجية باستخدام لاصق البصرية. وينصح اللزوجة المنخفضة لاصقة لنشر أفضل قطرة والغراء الميكا.
3. علاج تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، 10 دقيقة.
   يتم الشفاء لاصق بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع أقصى قدر من الاستيعاب في حدود 350 إلى 380NM والطاقة أوصت REQU ملاحظة:IRED للعلاج الكامل هو 4.5 J / سم ^2. ومع ذلك، مصادر الضوء مختلفة يمكن استخدامها لهذه الخطوة (انظر المواد المقدمة من قبل المورد لاصق).
4. فضح سطح الميكا نظيفة عن طريق إزالة طبقات القليلة الأولى مع لاصق شفاف.
5. وضع قطرة صغيرة (~ 20 ميكرون) من مادة لاصقة البصرية على سطح الميكا.
   ملاحظة: في هذه الخطوة، وينصح لاصقة عالية اللزوجة مع انخفاض مستوى تألق ذاتي. أظهرت تجربتنا أن استخدام مزيج من انخفاض (الخطوة 2.2) ومواد لاصقة عالية اللزوجة يزيد فعالية بكثير من الميكا تقسيم (الخطوة 2.7).
6. وضع بلطف ساترة تنظيفها حديثا على قطرة من مادة لاصقة، وتجنب فقاعات الهواء، والسماح تسوية لمدة 1 دقيقة.
7. علاج تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، 10 دقيقة.
   ملاحظة: بعد هذه الخطوة، وشطيرة من شريحة زجاجية، والميكا وساترة يمكن تخزينها لفترة طويلة نسبيا من الزمن (تصل إلى بضعة أسابيع). انتقل إلى الخطوة التالية قبل إعداد SLB الفعلية، للتأكد من أن سطح الميكا هو جديد.
   ملاحظة: يتم الشفاء لاصق بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع أقصى قدر من الاستيعاب في حدود 350 إلى 380NM والطاقة اللازمة لعلاج أوصى الكامل هو 4.5J/cm ^2. ومع ذلك، مصادر الضوء مختلفة يمكن استخدامها لهذه الخطوة (انظر المواد المقدمة من قبل المورد لاصق).
8. باستخدام سكين exacto، ترجل بلطف ساترة من الشريحة الزجاجية الجانبية كما هو موضح في الفيديو. في معظم الحالات، سوف طبقة رقيقة ومسطحة من الميكا لا تزال تعلق على ساترة. تعلق الميكا لشريحة زجاجية يمكن إعادة استخدامها (اكرر من الخطوة 2.4).
9. تحقق من جودة سطح بالعين المجردة أو تحت مجهر تشريح، للتأكد من أن طبقة الميكا لا يزال لصقها على ساترة وليس ازالتها بالكامل خلال تقسيم في الخطوة 2.8. سوف يجعل خدش صغير مع ملقط أو إبرة تشريح تساعد على التمييز بين اللاصق الذي لديه الاتساق مختلفة detectably من الميكا.
10. إزالة الختم المطاطي من 1.5 مل قارورة غطاء الغراء وغطاء رأسا على عقب إلى السطح باستخدام البصريةلاصقة أو طلاء الأظافر، وعلاج مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية، أو السماح الهواء الجاف 10 دقيقة على التوالي.
    ملاحظة: إذا تم إعداد نموذج لفي وقت واحد البصرية (TIRFM أو متحد البؤر) مع التصوير فؤاد، 1.5 مل قارورة كأب قد تكون صغيرة جدا لتحميل رئيس فؤاد على المسرح المجهر. في هذه الحالة، يمكن استبداله بأي غطاء من البلاستيك يا الدائري بقطر أكبر، ومناسبة للرئيس فؤاد في تصاعد مستمر. في حالة عندما يتطلب التجربة إزالة الغطاء دون الإضرار سطح الميكا، السيليكون الشحوم يمكن استخدامها بدلا من الغراء أو طلاء الأظافر.

3. المدعومة الدهن طبقة ثنائية (SLB) تشكيل

1. وضع حل الحويصلية الطازجة في الغرفة مع السطح. الحد الأدنى للحجم المطلوب لتشكيل SLB هو ~ 30 ميكرولتر.
   ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل حول الحويصلية وتشكيل SLB، راجع بروتوكولات المنشورة، مثل مثل حقيبة وآخرون 2014 ^15.
2. المضي قدما في تشكيل SLB باستخدام بروتوكول المطلوب. أثناء الحضانة ووالتصوير، ويمكن وضعها في غرفة في كتلة الحرارة أو ساخنة المرحلة المجهر للحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة للحفاظ على الدهون المستخدمة فوق درجة حرارة انصهارها.

النتائج

سلوك نشر تحقيقات الفلورسنت الدهون في SLBs مختلفة اعتمادا على الركيزة. TIRFM جنبا إلى جنب مع تقنية SMT هي طريقة قيمة لتصور حركات الجسيمات واستخراج معاملات نشرها. وترد إشارات جزيء واحد من تحقيق سفينغوميالين-ATTO647N نشرها في DOPC (1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) طبقة ثنائية معتمدة عل?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعداد الأسطح الملساء ورقيقة الميكا لترسب طبقة ثنائية الدهون وعالية الدقة التصوير. تقنية تتطلب الحد الأدنى من المهارات اليدوية، تقتصر في معظمها إلى التفكيك حذرا من الساندويتش الزجاج الميكا من الزجاج (الخطوة 2.8)، وهو أمر حاسم للحصول على سطح ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power