Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Resumen

Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.

Resumen

Bicapas lipídicas soportadas (SLBS) son ampliamente utilizados como modelo para el estudio de propiedades de la membrana (separación de fases, la agrupación, la dinámica) y su interacción con otros compuestos, como los fármacos o péptidos. Sin embargo las características SLB difieren dependiendo del soporte utilizado.

Técnicas utilizadas comúnmente para SLB óptica y mediciones son microscopía de fluorescencia de una sola molécula, de FCS y microscopía de fuerza atómica (AFM). Debido a que la mayoría de los estudios de formación de imágenes ópticas se llevan a cabo en un soporte de vidrio, mientras que AFM requiere una superficie extremadamente plana (generalmente de mica), los resultados de estas técnicas no se pueden comparar directamente, ya que las propiedades de carga y la suavidad de estos materiales influyen fuertemente en la difusión. Desafortunadamente, el alto nivel de destreza manual necesaria para el corte y pegado de láminas finas de mica para el portaobjetos de vidrio presenta un obstáculo para el uso rutinario de la mica para la preparación SLB. Aunque esto sería el método de elección, tales mica preparadosuperficies con frecuencia terminan siendo desigual (ondulado) y difícil de la imagen, especialmente con la pequeña distancia de trabajo, lentes de alta apertura numérica. Aquí presentamos un método simple y reproducible para la preparación de superficies planas delgadas de mica para la deposición de vesículas de lípidos y preparación SLB. Además, nuestra cámara por encargo requiere sólo pequeñas cantidades de vesículas para la formación de SLB. Los resultados del procedimiento general en la producción eficiente, simple y barato de superficies bicapa de lípidos de alta calidad que son directamente comparables a los utilizados en los estudios de AFM.

Introducción

El objetivo general del presente protocolo es mostrar un método para la preparación de superficies de mica de alta resolución de imagen de mica apoyados bicapas lipídicas (SLBS) mediante microscopía óptica total de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) o microscopía confocal, que también se podría combinar con la fuerza atómica microscopía (AFM).

SLBS son un modelo ampliamente utilizado para numerosos estudios de la agrupación de lípidos, la separación de fases, la dinámica de componentes de la bicapa o sus interacciones con péptidos, proteínas u otros compuestos ^1-5. Diferentes sustratos pueden ser utilizados para la formación de SLB (es decir, vidrio, mica, dióxido de silicio, polímeros) dependiendo de la naturaleza del estudio ^4,6-8. Estudios de membrana típicos se basan en técnicas de formación de imágenes basada en microscopía, tales como TIRFM y AFM. Por lo tanto, para obtener imágenes TIRFM, una superficie de vidrio es una opción típica porque el vidrio es transparente. Preparación de vidrio es relativamente fácil, y la calidad de los resultados es principalmentedeterminado por la superficie de limpieza a fondo antes de la deposición de las vesículas de lípidos. AFM, debido a su elevada resolución axial requiere superficies de mica. La mica es un mineral de silicato, con cerca de clivaje basal perfecto. Así, el recién exfoliados mica es atómicamente plana, lo que permite la observación de las diferencias de altura de la membrana, incluso a escala sub-nanométrica ^9.

Los estudios de difusión utilizando métodos tales como la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), sola molécula de seguimiento (SMT), y la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) mostraron sin embargo, que la dinámica de la membrana de lípidos dependen en gran medida del tipo de superficie sobre la que se depositan, en el que el vidrio y la mica puede dar resultados muy variables ^10,11. Estas diferencias incluyen no sólo los coeficientes de difusión de las sondas de membrana, sino también la detección de poblaciones separadas de las partículas que se difunden con diferentes tasas, y posiblemente la conmutación entre diferentes estados.

Por lo tanto,la comparación directa de los resultados obtenidos utilizando técnicas TIRFM y AFM es a menudo problemática, a menos que la misma superficie (en este caso la mica) se utiliza. Aunque hay algunos estudios en los que se llevó a cabo TIRFM y AFM de imágenes bicapa en la misma superficie de mica ^12,13, mica se utiliza muy poco para la microscopía óptica, sobre todo debido a problemas de manejo. Preparación Mica requiere de corte a mano en folletos delgadas, que luego se pegan a la cubreobjetos usando adhesivo óptico ^12. Este método, sin embargo requiere un poco de práctica para lograr resultados satisfactorios. Además, las superficies obtenidas son a menudo ondulado y grueso, lo que dificulta su uso con distancia de trabajo bajo, lentes de alta apertura numérica.

Superficies de mica preparados como se describe en este protocolo son muy delgadas (~ 220 m, incluyendo el espesor cubreobjetos de 170 m) y extremadamente plana, evitando "ondulación", que es fundamental para la imagen de alta resolución con éxito. Se pueden utilizarpara TIRFM o confocal configuraciones. Por otra parte, las mismas muestras se pueden transferir a AFM, e incluso reflejados simultáneamente con TIRFM / confocal y AFM. La combinación de estas dos técnicas permite la correlación directa de comportamiento de la difusión con la estructura ¹⁴ de la membrana bicapa. Debido a que las superficies de mica están recién troceados, que estén limpias y no requieren mucho tiempo, poco reproducibles, y los procedimientos de limpieza potencialmente peligrosos (protocolos de limpieza de vidrio por lo general incluyen productos químicos como solución Piranha, ácido sulfúrico, hidróxido de sodio / potasio). Montaje de una pequeña cámara, también se describe en el protocolo, reduce el volumen de vesículas necesarios para la formación de bicapa eficaz a menos de 50 l. Finalmente, todo el proceso de montaje de superficie no es mucho tiempo (preparación tarda menos de 30 min), y no requiere un alto grado de habilidad manual, al igual que la escisión de mica convencional y encolado.

Protocolo

1. Mica y Preparación Diapositivas

1. Lugar N º 1 ½ (0,17 mm) en cubreobjetos gradilla de tinción.
2. Someter a ultrasonidos durante 30 min en 2% de detergente a 60 ° C.
3. Lavar 20 veces con agua desionizada.
4. Retirar los portaobjetos usando pinzas y secar con aire comprimido o nitrógeno.
5. Cortar la hoja de mica en 10 x 10 mm piezas cuadradas con unas tijeras o cuchilla de afeitar.
6. Corte cada pedazo de mica en 2-3 foliolos delgados utilizando una hoja de afeitar.
   NOTA: Este paso requiere el uso de la hoja afilada.

2. Asamblea Mica y la Cámara de montaje

1. Limpio portaobjetos de vidrio microscópico con etanol.
2. Pegamento folleto de mica cortado en el paso de 1,6 a portaobjetos de vidrio utilizando adhesivo óptico. Se aconseja adhesivo de baja viscosidad, para difundir mejor la caída y la cola de la mica.
3. Curar bajo la lámpara UV, 10 min.
   NOTA: El adhesivo se curó con luz UV con un máximo de absorción en el intervalo de 350 a 380 nm y la energía recomendada required para el curado total es de 4,5 J / cm ^2. Sin embargo, diferentes fuentes de luz se pueden utilizar para este paso (ver materiales proporcionados por proveedor del adhesivo).
4. Exponer una superficie de mica limpio mediante la eliminación de las primeras capas con cinta Scotch.
5. Coloque una pequeña gota (~ 20 m) de adhesivo óptico sobre la superficie de mica.
   NOTA: En este paso, se aconseja alto pegamento viscosidad con bajo nivel de autofluorescencia. Nuestra experiencia ha demostrado que el uso de combinación de baja (paso 2.2) y los adhesivos de alta viscosidad aumenta significativamente la eficacia de la escisión mica (paso 2.7).
6. Coloque suavemente el cubreobjetos recién limpiada en la gota de adhesivo, evitando las burbujas de aire, dejar reposar durante 1 minuto.
7. Curar bajo la lámpara UV, 10 min.
   NOTA: después de este paso, el sándwich de lámina de vidrio, mica y cubreobjetos se puede almacenar durante un período relativamente largo de tiempo (hasta varias semanas). Continúe con el siguiente paso justo antes de la preparación efectiva SLB, para asegurarse de que la superficie de la mica es fresco.
   NOTA: Adhesivo se cura por la luz UV con la máxima absorción en el intervalo de 350 a 380 nm y la energía recomendada necesaria para el curado completo es 4.5J/cm ^2. Sin embargo, diferentes fuentes de luz se pueden utilizar para este paso (ver materiales proporcionados por proveedor del adhesivo).
8. Usando un cuchillo exacto, desmontar suavemente el cubreobjetos de portaobjetos de vidrio lateral como se muestra en el video. En la mayoría de los casos, una capa delgada y plana de la mica permanecerá unido a la cubreobjetos. Mica adjunta a portaobjetos de vidrio pueden ser reutilizados (repita desde el paso 2.4).
9. Compruebe la calidad de la superficie a simple vista o bajo un microscopio de disección, para asegurarse de que la capa de mica está todavía pegada a la cubreobjetos y no se ha eliminado completamente durante la división en el paso 2.8. Haciendo un pequeño rasguño con una pinza o aguja de disección ayudará a distinguir entre el adhesivo que tiene una consistencia de forma detectable diferente de mica.
10. Retire el sello de goma de un ml frasco tapa 1,5 y pegar la tapa boca abajo a la superficie utilizando ópticaadhesivo o esmalte de uñas, y curar con lámpara UV, o dejar secar al aire 10 minutos, respectivamente.
    NOTA: Si se prepara la muestra para su uso simultáneo óptica (TIRFM o confocal) con imágenes de AFM, un ml frasco tapa 1.5 puede ser demasiado pequeño para montar la cabeza AFM en la platina del microscopio. En ese caso, la tapa podría ser sustituida por cualquier junta tórica de plástico con un diámetro más grande, adecuada para el montaje de la cabeza de AFM. En caso de que el experimento requiere quitar la tapa sin dañar la superficie de la mica, grasa de silicona se puede utilizar en lugar de pegamento o esmalte de uñas.

3. Apoyado bicapa lipídica (SLB) Formación

1. Coloque solución de liposomas recién preparada en la cámara con la superficie. El volumen mínimo requerido para la formación de SLB es ~ 30 l.
   NOTA: Para más detalles sobre el liposoma y la formación de SLB, se refieren a los protocolos publicados, como por ejemplo, bolsa y otros, 2014 ^15..
2. Proceda con la formación de SLB con el protocolo deseado. Durante la incubación yde formación de imágenes, la cámara se puede colocar en un bloque de calor o platina del microscopio calentado para mantener la temperatura necesaria para mantener los lípidos que se utilizan por encima de su temperatura de fusión.

Resultados

El comportamiento de la difusión de sondas fluorescentes de lípidos en SLBS es diferente dependiendo del sustrato. TIRFM combinado con la técnica SMT es un método valioso para la visualización de movimientos de partículas y la extracción de sus coeficientes de difusión. Señales de moléculas individuales de una sonda de esfingomielina-ATTO647N de difusión en un DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) bicapa apoyado sobre el vidrio y mica se muestran en la figura animada adjunto. La superficie de ...

Discusión

Este protocolo describe un método para la preparación de superficies lisas y finas de mica para la deposición de bicapa de lípidos y formación de imágenes de alta resolución. La técnica requiere habilidades manuales mínimas, limitadas principalmente a la desmontaje cuidadoso de la sándwich de vidrio-mica y vidrio (paso 2.8), que es crítico para la obtención de una superficie de mica de alta calidad. Inspección de la mica recién escindido siempre se requiere en este punto, ya que es posible para la mica se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power