Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo di preparazione mica supportato doppi strati lipidici per microscopia ad alta risoluzione. Mica è trasparente e piatto su scala atomica, ma raramente usata nell'imaging a causa della difficoltà di manipolazione; nostra preparazione comporta anche deposizione del foglio di mica, e riduce il materiale utilizzato nella preparazione bistrato.

Abstract

Doppi strati lipidici supportati (SLB) sono ampiamente usati come modello per lo studio delle proprietà di membrana (separazione di fase, di clustering, dinamica) e la sua interazione con altri composti, come i farmaci o peptidi. Tuttavia caratteristiche SLB variano a seconda del supporto utilizzato.

Tecniche utilizzate comunemente per SLB l'imaging e le misure sono single microscopia a fluorescenza molecola, FCS e microscopia a forza atomica (AFM). Poiché la maggior parte degli studi di imaging ottico sono effettuate su un supporto di vetro, mentre AFM richiede una superficie estremamente piatta (generalmente mica), i risultati di queste tecniche non sono direttamente confrontabili, in quanto le proprietà di carica e di funzionamento di questi materiali influenzano fortemente diffusione. Purtroppo, l'alto livello di destrezza manuale richiesto per il taglio e incollaggio fette sottili di mica al vetrino presenta un ostacolo di utilizzare sistematicamente mica per la preparazione SLB. Sebbene questo sarebbe il metodo di scelta, come mica preparatosuperfici spesso finiscono per essere irregolare (ondulato) e difficile da immagine, soprattutto con la piccola distanza di lavoro, alti lenti apertura numerica. Qui vi presentiamo un metodo semplice e riproducibile per la preparazione di sottili superfici piane mica per la deposizione lipidica delle vescicole e preparazione SLB. Inoltre, la nostra camera di misura richiede solo piccole quantità di vescicole per la formazione SLB. I risultati procedura generale nella produzione efficiente, semplice ed economico di superfici doppio strato lipidico alta qualità che sono direttamente paragonabili a quelli utilizzati negli studi AFM.

Introduzione

L'obiettivo generale del presente protocollo è quello di mostrare un metodo per preparare le superfici mica per imaging ad alta risoluzione di mica sostenuta lipidi bistrati (SLB) utilizzando la microscopia ottica riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM) o la microscopia confocale, che potrebbe anche essere combinato con forza atomica Microscopy (AFM).

SLB sono un modello ampiamente utilizzato per numerosi studi di raggruppamento lipidi, separazione di fase, la dinamica di componenti a doppio strato o loro interazioni con peptidi, proteine ​​o altri composti ^1-5. Substrati differenti potrebbero essere utilizzati per la formazione SLB (cioè vetro, mica, biossido di silicio, polimeri) a seconda della natura dello studio ^4,6-8. Gli studi di membrana tipiche si basano su tecniche di imaging basata microscopia-, come TIRFM e AFM. Così, per l'imaging TIRFM, una superficie di vetro è una tipica scelta perché il vetro è trasparente. Preparazione del vetro è relativamente facile, e la qualità dei risultati è principalmentedeterminato dalla accurata pulizia prima della deposizione delle vescicole lipidiche superficie. AFM grazie alla sua elevata risoluzione assiale richiede superfici di mica. Mica è un minerale silicato, con quasi perfetta scissione basale. Così, la mica appena spaccati è atomicamente piatta, che permette l'osservazione di membrana dislivelli anche a scala sub-nanometrica ^9.

Studi di diffusione con metodi quali la spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS), singola molecola di inseguimento (SMT), e recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) hanno mostrato tuttavia che la dinamica della membrana lipidica dipende fortemente dal tipo di superficie su cui sono depositati, per cui vetro e mica può dare risultati ampiamente variabili ^10,11. Queste differenze sono non solo i coefficienti di diffusione delle sonde di membrana, ma anche l'individuazione di popolazioni separate di particelle diffondenti con tassi differenti, e possibilmente la commutazione tra i diversi stati.

Così,il confronto diretto dei risultati ottenuti utilizzando tecniche TIRFM e AFM è spesso problematico, a meno che la stessa superficie (in questo caso mica) viene utilizzato. Anche se ci sono alcuni studi in cui TIRFM e imaging AFM doppio strato è stata condotta sulla stessa superficie mica ^12,13, mica è usato raramente per la microscopia ottica, soprattutto a causa di problemi di gestione. Preparazione Mica richiede il taglio a mano in foglioline sottili, che sono incollati ad coprioggetto con adesivo ottico ^12. Questo metodo richiede tuttavia una certa pratica per ottenere risultati soddisfacenti. Inoltre, le superfici ottenute sono spesso ondulati e di spessore, che li rende difficili da utilizzare con bassa distanza di lavoro, alti lenti apertura numerica.

Mica superfici preparate come descritto in questo protocollo sono molto sottili (~ 220 micron, compreso lo spessore vetrino di 170 micron) ed estremamente piatta, evitando di "ondulazione", che è fondamentale per il successo di imaging ad alta risoluzione. Possono essere utilizzatiper TIRFM o confocale configurazioni. Inoltre, gli stessi campioni possono essere trasferiti AFM, e anche ripreso contemporaneamente TIRFM / confocale e AFM. La combinazione di queste due tecniche consente di correlazione diretta del comportamento diffusione con struttura a membrana a doppio strato ^14. Poiché le superfici mica sono appena spaccati, sono pulite e non richiedono molto tempo, scarsamente riproducibile, e le procedure di pulizia potenzialmente pericolosi (protocolli di pulizia di vetro di solito includono sostanze chimiche come soluzione Piranha, acido solforico, idrossido di sodio / potassio). Montaggio di una piccola camera, anche descritto nel protocollo, riduce il volume di vescicole necessari per la formazione bistrato efficace e meno di 50 microlitri. Infine, l'intero processo di assemblaggio superficie non è molto tempo (preparazione richiede meno di 30 minuti), e non richiede un elevato grado di abilità manuale, così come convenzionale scissione mica e incollaggio.

Protocollo

1. Mica e diapositive Preparazione

1. Luogo No. 1 ½ (0,17 mm) coprioggetto in colorazione rack.
2. Ultrasuoni per 30 min a 2% di detergente a 60 ° C.
3. Lavare 20 volte con acqua deionizzata.
4. Estrarre i vetrini con pinze e asciugare con aria compressa o azoto.
5. Tagliare foglio di mica in 10 x 10 mm pezzi quadrati utilizzando forbici o lama di rasoio.
6. Tagliare ogni pezzo mica in 2-3 foglioline sottili con lama di rasoio.
   NOTA: Questa fase richiede l'uso di lama affilata.

2. Montaggio Mica e della Camera di montaggio

1. Pulire vetrino microscopico con etanolo.
2. Colla foglio di mica tagliati nel passaggio da 1,6 a vetrino con adesivo ottico. Adesivo a bassa viscosità si consiglia di diffondere meglio la goccia e incollare la mica.
3. Cure sotto la lampada UV, 10 min.
   NOTA: Adhesive è curata da luce UV con massimo di assorbimento nell'intervallo di 350 a 380 nm e l'energia raccomandato required per la piena guarigione è di 4,5 J / cm ^2. Tuttavia, diverse fonti di luce possono essere utilizzati per questo passo (vedi materiali forniti dal fornitore adesivo).
4. Esporre una superficie di mica pulito rimuovendo i primi strati con nastro adesivo.
5. Mettere piccola goccia (~ 20 micron) di adesivo ottico sulla superficie di mica.
   NOTA: In questo passaggio, si consiglia l'adesivo ad alta viscosità con un basso livello di autofluorescenza. La nostra esperienza ha dimostrato che l'utilizzo di combinazione di basso (punto 2.2) e adesivi ad alta viscosità aumenta in modo significativo l'efficacia di mica splitting (fase 2.7).
6. Posizionare delicatamente coprioggetto appena pulita sulla goccia di colla, evitando bolle d'aria, lasciare riposare per 1 min.
7. Cure sotto la lampada UV, 10 min.
   NOTA: dopo questa fase, il sandwich di vetrino, mica e coprioggetto può essere conservato per un periodo relativamente lungo di tempo (fino a poche settimane). Procedere alla fase successiva appena prima l'attuale preparazione SLB, per assicurarsi che la superficie di mica è fresco.
   NOTA: Adesivo è curata da luce UV con il massimo assorbimento nel range di 350 a 380nm e l'energia consigliata necessario per la piena guarigione è 4.5J/cm ^2. Tuttavia, diverse fonti di luce possono essere utilizzati per questo passo (vedi materiali forniti dal fornitore adesivo).
8. Utilizzando un taglierino, smontare delicatamente il vetrino dal vetrino lato, come mostrato nel video. Nella maggior parte dei casi, uno strato sottile e piatto di mica rimarrà attaccato alla coprioggetto. Mica attaccato al vetrino può essere riutilizzato (ripetere dal punto 2.4).
9. Controllare la qualità della superficie a occhio nudo o sotto un microscopio da dissezione, per assicurarsi che strato mica è ancora incollato al coprioggetto e non è stato rimosso completamente durante la divisione nel passaggio 2.8. Fare un piccolo graffio con una pinza o dissezione ago aiuterà a distinguere tra l'adesivo che ha una consistenza diversa da rivelabile mica.
10. Rimuovere la guarnizione di gomma da un ml flacone tappo 1.5 e incollare il tappo a testa in giù alla superficie con otticaadesivo o smalto, e la cura con la lampada UV, o lasciare asciugare 10 minuti, rispettivamente.
    NOTA: Se il campione è pronto per simultanea ottico (TIRFM o confocale) con imaging AFM, un ml flacone tappo 1.5 potrebbe essere troppo piccolo per montare la testa AFM sul palco microscopio. In tal caso, il tappo può essere sostituito con qualsiasi plastica O-ring con un diametro più grande, adatto per il montaggio testa AFM. Nel caso in cui l'esperimento richiede la rimozione del tappo senza danneggiare la superficie di mica, grasso al silicone può essere usata al posto della colla o smalto.

3. Supportato doppio strato lipidico (SLB) Formazione

1. Posizionare soluzione liposomi preparata nella camera con la superficie. Il volume minimo richiesto per la formazione SLB è ~ 30 ml.
   NOTA: Per maggiori dettagli sulla liposomi e la formazione SLB, fare riferimento a protocolli pubblicati, come ad esempio il sacchetto et al, 2014 ^15..
2. Procedere con la formazione SLB utilizzando il protocollo desiderato. Durante l'incubazione el'imaging, la camera può essere collocato in un calore-blocco o fase di microscopio riscaldata per mantenere la temperatura necessaria per mantenere i lipidi in uso sopra della loro temperatura di fusione.

Risultati

Il comportamento diffusione di sonde fluorescenti lipidici in SLB è diverso a seconda del substrato. TIRFM combinata con la tecnica SMT è un metodo utile per la visualizzazione movimenti di particelle ed estraendo i loro coefficienti di diffusione. Segnali singola molecola di una sonda sfingomielina-ATTO647N diffusione in un DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina) doppio strato supportato su vetro e mica sono mostrate nella figura animata allegata. La superficie mica è stato preparato secondo il protoco...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per preparare superfici mica lisce e sottili per deposizione bistrato lipidico e imaging ad alta risoluzione. La tecnica richiede abilità manuale minimo, limitato soprattutto alla attenta smontaggio del sandwich vetro-mica-vetro (passo 2.8), che è essenziale per ottenere una superficie di mica alta qualità. Controllo della mica appena spaccati è sempre necessaria, a questo punto, poiché è possibile per la mica staccare dall'adesivo ottica senza fende, lasciando aree esposte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power