Подготовка Mica Поддерживаемые липидного бислоя за большой размер оптической микроскопии изображений

Резюме

Мы представляем способ получения слюды поддерживается бислоев для микроскопия высокого разрешения. Слюда является прозрачным и помещения в атомном масштабе, но редко используется в визуализации из-за трудностей обработки; наша подготовка приводит к отложению даже слюды лист, а также снижает материал, используемый в процессе подготовки двухслойной.

Аннотация

Поддерживаемые липидного бислоя (SLBS) широко используются в качестве модели для исследования мембранных свойств (разделение фаз, кластеризации, динамика) и его взаимодействия с другими веществами, такими как наркотики или пептидов. Однако SLB характеристики отличаются в зависимости от поддержки используется.

Обычно используемые методы SLB изображений и измерений одной молекулы флуоресцентной микроскопии, ФТС и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Поскольку большинство оптических изображений исследования проводятся на стеклянной подложке, в то время как АСМ требует чрезвычайно плоскую поверхность (как правило, слюды), результаты этих методов не может сравниться непосредственно, так как заряд и гладкости свойства этих материалов сильно влияют диффузии. К сожалению, высокий уровень ловкости рук, необходимых для резки и склеивания тонкие ломтики слюды на стекло представляет собой препятствие для рутинного применения слюды для подготовки SLB. Хотя это было бы методом выбора, например подготовлены слюдыповерхности часто тратятся неравномерно (волнистые) и трудно изображения, особенно с малым рабочим расстоянием, высокие линз числовой апертурой. Здесь мы представляем простой и воспроизводимый способ получения тонких плоских слюды поверхности для липидов осаждения везикул и подготовки SLB. Кроме того, наша заказ камера требует только очень небольшие объемы пузырьков для формирования SLB. Общие процедура приводит к эффективной, простой и недорогой производства высококачественных липидный бислой поверхностей, которые сопоставимы с используемыми в АСМ исследований.

Введение

Общая цель настоящего Протокола заключается, чтобы показать способ получения слюды поверхности для изображения с высоким разрешением слюдяных поддерживается липидного бислоя (SLBS) с использованием оптического общей флуоресценции внутреннего отражения микроскопии (TIRFM) или конфокальной микроскопии, который также может быть в сочетании с атомно-силовой микроскопии (AFM).

SLBS являются широко используется модель для многочисленных исследований липидного кластеризации, разделение фаз, динамики компонентов двухслойных или их взаимодействия с пептиды, белки или других соединений ^1-5. Различные подложки могут быть использованы для формирования SLB (т.е. стекло, слюда, диоксид кремния, полимеры) в зависимости от характера исследования ^4,6-8. Типичные исследования мембранных полагаться на методы визуализации микроскопии на основе, например, TIRFM и АСМ. Таким образом, для работы с изображениями TIRFM, поверхность стекла является типичным выбором, потому что стекло прозрачно. Подготовка стекла относительно легко, и качество результатов в первую очередьопределяется тщательной очистки поверхности перед осаждением липидных везикул. АСМ из-за своей резолюции высокой осевой требуется слюды поверхности. Мика является силикатный минерал, с близко к совершенной базальной декольте. Таким образом, свежесколотой слюда атомарно плоской, позволяя наблюдать перепада высот мембранных даже в суб-нанометровом масштабе ^9.

Диффузионные исследования с использованием таких методов, как флуоресценции корреляционной спектроскопии (FCS), одной молекулы отслеживания (SMT), и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) показал однако, что динамика липидной мембраны в значительной степени зависят от типа поверхности, на которую они оседают, в результате чего стекло и слюда может дать самые различные результаты ^10,11. Эти различия относятся не только коэффициентов диффузии мембранных зондов, но и обнаружение отдельных популяций частиц, диффундирующих с разной скоростью, и, возможно переключение между различными государствами.

Таким образом,Прямое сравнение результатов, полученных с помощью TIRFM и АСМ методы зачастую проблематично, если же поверхность (в данном случае слюды) не используется. Хотя есть некоторые исследования, где TIRFM и АСМ двухслойная изображений проводилось на той же поверхности слюды ^12,13, слюда редко используется для оптической микроскопии, в основном из-за проблем обработки. Подготовка Мика требуется резка вручную на тонкие листовок, которые затем приклеены к покровного стекла с использованием оптического клея ^12. Этот метод, однако, требуется некоторая практика, чтобы достичь удовлетворительных результатов. Кроме того, поверхности, полученные часто волнистые и густые, что делает их трудно использовать с низким рабочим расстоянием, высокие линз числовой апертурой.

Слюды поверхности, полученные, как описано в данном протоколе очень тонкие (~ 220 мкм, включая толщину покровного 170 мкм) и очень плоским, избегая "волнистость", которая имеет решающее значение для успешного изображений с высоким разрешением. Они могут быть использованыдля TIRFM или конфокальной установок. Кроме того, те же образцы могут быть переданы в АСМ, и даже отображаемого одновременно с TIRFM / конфокальной и АСМ. Сочетание этих двух методов позволяет прямую зависимость диффузии поведения с двухслойной мембраной структуры ^14. Потому слюды поверхности свежесколотой, они чистые и не требуют затрат времени, плохо воспроизводимы, и потенциально опасные процедуры очистки (очистки стекла протоколы обычно включают химикаты, такие как решения Piranha, серная кислота, натрия / гидроксид калия). Монтаж небольшую камеру, также описанного в протоколе, уменьшает объем пузырьков, необходимых для эффективного образования двухслойной до менее чем 50 мкл. Наконец, весь процесс поверхностного монтажа не отнимает много времени (подготовка занимает менее 30 мин), и не требует высокой степени мастерства ручной, так же как обычные расщепление слюды и склеивание.

протокол

1. Слюды и Слайды Подготовка

1. Место № 1 ½ (0.17 мм) покровные в окрашивания стойке.
2. Разрушать ультразвуком в течение 30 мин в 2% моющего средства при температуре 60 ° С.
3. Промыть 20 раз деионизированной водой.
4. Удалить слайды с помощью щипцов и сушить с помощью сжатого воздуха или азота.
5. Вырезать слюды лист в 10 х 10 мм квадратных части, используя ножницы или лезвие.
6. Разрежьте каждый слюды часть в 2-3 тонких листовок, используя лезвие бритвы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует использования острым лезвием.

2. Слюды Ассамблея и камерной Монтаж

1. Чистый микроскопические предметное стекло с этанолом.
2. Клей листовка слюды сократить в шаге от 1,6 до предметное стекло с помощью оптического клея. Клей с низкой вязкостью рекомендуется лучше распространять падение и приклейте слюды.
3. Лечение под УФ-лампой, 10 мин.
   Примечание: Клей отверждают УФ-светом с максимальной абсорбции в диапазоне от 350 до 380 нм и рекомендованной энергии RequIRED для полного излечения составляет 4,5 Дж / ​​см ^2. Однако различные источники света могут быть использованы для этого шага (см. материалы от поставщика клея).
4. Expose чистую поверхность слюды, удалив несколько первых слоев с скотча.
5. Поместите небольшую каплю (~ 20 мкм) оптического клея на поверхности слюды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, высокая клей вязкость с низким уровнем автофлуоресцентной рекомендуется. Наш опыт показал, что с помощью комбинации низких (шаг 2.2) и высоких клеев вязкости увеличивает значительно эффективность слюды расщепления (шаг 2.7).
6. Аккуратно поместите свежеочищенной покровное на каплю клея, избегая пузырьков воздуха, пусть осесть в течение 1 мин.
7. Лечение под УФ-лампой, 10 мин.
   Примечание: После этой стадии сэндвич из предметное стекло, слюды и покровным можно хранить в течение относительно длительного периода времени (до нескольких недель). Переходите к следующему шагу только до фактического подготовки SLB, чтобы убедиться, что поверхность слюды свежее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клей отверждают УФ-светом с максимальной абсорбции в диапазоне от 350 до 380 нм и рекомендованной энергии, необходимой для полного отверждения является 4.5J/cm ^2. Однако различные источники света могут быть использованы для этого шага (см. материалы от поставщика клея).
8. Использование Exacto нож, аккуратно демонтировать покровное из стороны стекло, как показано на видео. В большинстве случаев, тонкий и плоский слой слюды будет оставаться присоединенным к покровное. Мика прикреплены к стеклу можно использовать повторно (повторите процедуру с шага 2.4).
9. Проверьте качество поверхности невооруженным глазом или под микроскопом рассекает, чтобы убедиться, что слюда слой еще приклеены к покровным и не был полностью удален во время расщепления в шаге 2.8. Создание мелкие царапины с пинцетом или рассечения иглу поможет различать клея, который имеет детектируемо другой последовательности из слюды.
10. Удалить резиновый уплотнитель от 1,5 мл флакона и приклейте крышку вверх дном на поверхность с помощью оптическогоклей или лак для ногтей, и вылечить с УФ-лампой, или пусть воздух сухой 10 мин, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если проба подготовлена ​​для одновременного оптического (TIRFM или конфокальной) с АСМ, 1,5 мл флаконе крышка может быть слишком мал, чтобы смонтировать голову АСМ на столик микроскопа. В этом случае крышка может быть замещена любой пластиковой уплотнительным кольцом с большим диаметром, подходящим для АСМ головка монтажа. В случае, когда эксперимент требует удаления колпачка без повреждения поверхности слюды, силиконовые смазки могут быть использованы вместо клея или лака для ногтей.

3. Поддерживаемые липидов Bilayer (SLB) Формирование

1. Наведите свежеприготовленный раствор липосом в камеру с поверхности. Минимальный объем необходим для формирования SLB составляет ~ 30 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробной информации о липосомы и формирования SLB см. опубликованных протоколов, таких как, например, сумка и др., 2014 ^15..
2. Перейдите с образованием SLB используя нужный протокол. Во время инкубации иизображений, камера может быть размещена в тепловой блок или столике микроскопа с подогревом для поддержания температуры, необходимой для поддержания липиды быть использованы выше их температуры плавления.

Результаты

Поведение диффузии флуоресцентных зондов в липидных SLBS отличается в зависимости от субстрата. TIRFM сочетании с техникой SMT является ценным методом для визуализации движения частиц и извлечения их коэффициентов диффузии. Одной молекулы сигналы в Сфингомиелин-ATTO647N зонда диффундирующег?...

Обсуждение

Этот протокол описывает способ получения гладких и тонких поверхностей слюды для липидов осаждения двухслойной и высоким разрешением. Методика требует минимальных ручной труд, ограниченные в основном к тщательной разборки бутерброд стекло-слюда-стекло (шаг 2.8), которая имеет решающе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power