JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة التي كتبها التصوير الخلية الحية وكميا.

Abstract

النانوية الفلورسنت (NPS) مع المواد الكيميائية مرغوب فيه، الخصائص البصرية والميكانيكية هي أدوات واعدة لتسمية عضيات داخل الخلايا. هنا، ونحن نقدم طريقة استخدام الذهب-BSA-رودامين مصادر القدرة النووية لتسمية نظام إندو الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة ورصد التلاعب من المضيف مسارات الخلوية من قبل الممرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة. وقد استوعبت مصادر القدرة النووية بسهولة عن طريق خلايا هيلا ومحلية في أواخر الإندوسومات / الجسيمات الحالة. عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الحويصلات وتراكم تلك المصادر في الهياكل غشاء Salmonella- المستحث. نحن نشر حزمة البرامج Imaris للالتحليلات الكمية من الصور مبائر المجهري. وكان عدد من الأشياء وتوزيع حجمها في الخلايا غير المصابة تختلف عن تلك الموجودة في خلايا -infected السالمونيلا، مشيرا إلى إعادة تشكيل للغاية من نظام إندو الليزوزومية التي كتبها WT السالمونيلا.

Introduction

وقد اجتذبت النانوية الفلورسنت (NPS)، بما في ذلك مصادر القدرة النووية المعدنية، ونقاط الكم، البوليمر مصادر القدرة النووية، مصادر القدرة النووية السيليكا، النقاط الكربون وغيرها، اهتماما كبيرا خلال العقود الماضية 1،2. مقارنة الأصباغ العضوية التقليدية، وتبين مصادر القدرة النووية الفلورسنت الكيميائية والخصائص البصرية والميكانيكية مرغوبة، مثل قوة قوية إشارة، ومقاومة للphotobleaching من وارتفاع 3،4 توافق مع الحياة. هذه المزايا تجعل منها طريقة اختيار للاستشعار داخل الخلايا والتصوير الخلية الحية. وعلاوة على ذلك، مجموعة متنوعة من NPS-الإلكترون كثيفة مرئية بواسطة المجهر الإلكتروني (EM)، وتسهيل استخدامها لتحليل مجهري مترابطة، والذي يسمح الجمع بين الخلية الحية تتبع مع ​​المجهر الضوئي (LM) ودقة أعلى في مستوى التركيبية مع EM 5. على سبيل المثال، كانت مصادر القدرة النووية الذهب وقت طويل استخدامها بكفاءة كما أجهزة الاستشعار في خلايا حساسة للتشخيص يعيشون وكذلك في مجال المناعة وضع العلامات 6. الصورة الأخيرةtudies تشير إلى أن مصادر القدرة النووية الذهب مع حجم وشكل مختلف يمكن أن يكون بسهولة امتصاص من قبل مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الخلايا ونقل بشكل روتيني من خلال مسار endosomal، وبالتالي يكون كبيرا يجري المحتمل تطبيقها لداخل الخلايا تتبع النقل حويصلة ووضع العلامات نظام إندو الليزوزومية 7،8 .

مسببات الأمراض الميكروبية، مثل السالمونيلا الملهبة، الشيجلا الفلكسنرية والليستريا المستوحدة، وضعت آليات مختلفة لغزو الخلايا المضيفة غير أكلة 9. بعد أن المنضوية، ومسببات الأمراض، والمترجمة إما في العصارة الخلوية أو عزلها في أماكن محددة الغشاء، تتفاعل على نطاق واسع مع البيئات التي تستضيفهم وتعدل هذه لصالح بقائهم على قيد الحياة 10. على سبيل المثال، السالمونيلا الملهبة لليقيم ويتكاثر داخل phagosomal حجرة داخل الخلايا وصفته السالمونيلا المحتوية فجوة (SCV) عند إصابة 11. وSCV النضجبالاتجار نحو جهاز جولجي، تمر التفاعل المستمر مع مسار التقامي، ويدفع تشكيل الهياكل واسعة أنبوبي، مثل السالمونيلا خيوط يسببها (SIF) والفرز الأنابيب نيكسين، السالمونيلا يسببها الناقل إفرازية البروتين غشاء 3 (SCAMP3) الأنابيب، الخ . 12-14. دراسة كيف يمكن لهذه مسببات الأمراض البكتيرية التلاعب مسارات خلايا المضيف أمر ضروري لفهم الأمراض المعدية.

هنا، تم استخدام مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين كأثر السوائل لتسمية المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية، واستخدم الإنسان الممرض الهضمي السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (السالمونيلا)، وبكتيريا نموذج لدراسة التفاعلات من مسببات المرض مع استضافة المسار التقامي. تم تصوير مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين الخلايا في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع WT السالمونيلا أو سلالات متحولة من قبل متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي (CLSM).ثم تم استخدام البرمجيات Imaris لقياس توزيع مصادر القدرة النووية، مشيرا إلى أن عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الشديد من الإندوسومات / الجسيمات الحالة. وبعد وصف هذا الأسلوب، والتجارب المشابهة يمكن أن تكون مصممة لتتبع مصير طويلة الأجل للمعايير المهنية الوطنية المنضوية وللتحقيق في تأثير المواد الخارجية المختلفة أو العوامل الداخلية على مسار التقامي الخلايا حقيقية النواة.

Protocol

1. توليف 10 نانومتر الذهب النانوية (الذهب NPS) 15

  1. يعد حل A: إضافة 2 مل 1٪ مائي كلوريد الذهب إلى 160 مل ملي-Q، أو مزدوج المقطر والماء.
  2. يعد حل ب: إضافة 8 مل 1٪ ثلاثي الصوديوم سترات × 2 H 2 O وحمض التانيك 160 ميكرولتر 1٪ إلى 32 مل ملي-Q، أو مزدوج المقطر والماء.
  3. الاحماء حل A و B إلى 60 درجة مئوية، ومزجها مع التحريك. نلاحظ اللون الأزرق الداكن على الفور. لاحظ اللون الأحمر بعد حوالي 15 دقيقة. ثم تسخين إلى 95 ° C، والحفاظ 5 دقائق وتبريد حل لRT.
  4. إضافة قطرة من تعليق NP على شبكة الكربون المغلفة والسماح ليجف في الهواء. التحقق من حجم والتشكل مصادر القدرة النووية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ.

2. طلاء من الذهب مصادر القدرة النووية مع BSA وصفها مع رودامين N-hydroxysuccinimidyl استر (NHS) 16

  1. إضافة 900 ميكرولتر مصادر القدرة النووية الذهب إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب، الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 30 دقيقة. المرجعدوليا هو، وإعداد أنابيب متعددة يجوز دفعة واحدة.
  2. تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه في 900 ميكرولتر تعقيم المياه ملي-Q وإضافة 100 ميكرولتر 2 ملغ / مل BSA / PBS، مزيج على دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  3. لإزالة الزائد BSA، أجهزة الطرد المركزي في إعداد 15،000 x ج لمدة 60 دقيقة.
  4. تجاهل طاف، وإعادة تعليق مصادر القدرة النووية الذهب BSA في 125 ميكرولتر PBS، إضافة 12.5 ميكرولتر من 1 M بيكربونات.
  5. فورا قبل الاستخدام، ويعد حل 10 ملغ / مل من رودامين NHS / DMSO، إضافة 30 ميكرولتر من رودامين NHS حل / DMSO إلى 1ml من تعليق الذهب BSA مصادر القدرة النووية. احتضان رد فعل لمدة 2 ساعة (أو O / N) في RT خلال 800 دورة في الدقيقة الاختلاط، وتجنب التعرض للضوء.
  6. تنقية الذهب NPS-BSA-رودامين من خلال غسيل الكلى ضد PBS في 4 درجة مئوية مع 5 التغييرات عازلة خلال الفترة من 36 - 48 ساعة.
  7. لتحقيق الاستقرار في مصادر القدرة النووية، إضافة 10 ميكرولتر من 200 ملغ / مل BSA / PBS في كل 1 مل مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين. لإزالة أجهزة الطرد المركزي مجانا أو الإفراج عنهم BSA-رودامين، في 15،000 x ج لمدة 60 دقيقة. Resuspend وبيليه في 2 ملغ / مل BSA / PBS، وقياس OD 520، وتخزينها في 4 ° C، وتجنب التعرض للضوء.
  8. تمييع مصادر القدرة النووية 10 مرات مع ميلي-Q أو الماء المقطر مزدوج، إضافة قطرة على شبكة المغلفة الكربون، والسماح ليجف في الهواء. التحقق من حجم ومورفولوجية مصادر القدرة النووية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
    تم تعقيمها جميع المواد التي تستخدم في إعداد NP وأجريت العملية في غطاء ثقافة الخلية أو على مقاعد البدلاء بجانب لهب: ملاحظة.

3. ثقافة خلايا هيلا

  1. خلايا هيلا معربا عن LAMP1-GFP بشكل دائم يتم تربيتها في DMEM مع المصل 10٪ العجل الجنين (FCS) ونمت عند 37 درجة مئوية في جو تحتوي على 5٪ CO 2.
  2. البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 50،000 لكل بئر في 8 جيد غرفة الشريحة (Ibidi)، واحتضان O / N.

4. ثقافة البكتيريا

  1. استخدام السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية NCTC 12023 فيلد من نوع (WT) سلالة. وعلى سبيل المقارنة، واستخدام سلالات متحولة Δ ssaV المعيبة في SPI2-T3SS وΔ سيفا تفتقر المستجيب رئيسيا سيفا لSIF. استخدام سلالات إيواء بلازميد pFPV25.1 للتعبير التأسيسي من تعزيز GFP.
    ملاحظة: سلالات جرثومية يتم تربيتها بشكل روتيني في لوريا، BERTANI مرق (LB) مع اضافة 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين (WT) وLB مع اضافة 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و / أو 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (Δ ssaV، Δ سيفا ) من المطلوب للحفاظ على البلازميدات.
  2. تطعيم مستعمرة واحدة من البكتيريا في 3 مل LB مع المضادات الحيوية المناسبة وتنمو O / N في 37 درجة مئوية تحت ظروف اهتزاز للتهوية، ثم تمييع 01:31 في LB جديدة ومواصلة نمو 3.5 ساعة. في هذه النقطة الوقت، والثقافات تصل إلى مرحلة سجل في وقت متأخر والبكتيريا والغازية للغاية. A 'طبل الأسطوانة "هو ملائم لاحتضان الثقافات أنبوب اختبار مع التهوية.

5. العدوى من خلايا هيلا بواسطةالسالمونيلا والذهب BSA-رودامين مصادر القدرة النووية نبض تشيس وضع العلامات (انظر الشكل 1 للمخطط)

  1. قياس OD 600 من البكتيريا شبه مثقف وتمييع لOD 600 = 0.2 في 1 مل PBS (~ 3 × 10 8 وت م / مل)، إضافة الكميات المناسبة من البكتيريا إلى خلايا هيلا في الشرائح غرفة 8-جيدا لتحقيق تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 100.
  2. احتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة خلية، وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير المنضوية (تم تعيين هذه النقطة الوقت ك 0 ساعة بعد العدوى، أو 0 ساعة بي). إضافة 300 ميكرولتر من مستنبت الطازجة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين والحفاظ لمدة 1 ساعة. ثم استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لبقية فترة حضانة.
  3. بعد الحضانة مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لمدة 1 ساعة، يتم استبدال المتوسطة عن طريق التصوير المتوسطة (النسور MEM دون FCS، L-الجلوتامين، الفينول الحمراء وبيكربونات الصوديوم، مع 30 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) شاركntaining 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تضاف NPS-الذهب BSA-رودامين إلى خلايا هيلا للحصول على التركيز النهائي من OD 520 = 0.1.
    ملاحظة: يمكن أيضا إضافة مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين إلى الخلايا قبل الإصابة، أو في مختلف نقاط في الوقت بي
  4. بعد 1 ساعة الحضانة، وإزالة المتوسطة، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة التصوير الطازجة تحتوي على 10٪ FCS و 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لبقية فترة حضانة.
    ملاحظة: مدة حضانة المرض قد تختلف اعتمادا على تركيز تلك المصادر وخطوط الخلايا المستخدمة. لالضامة RAW264.7، لاحظنا أن 30 دقيقة الحضانة مع مصادر القدرة النووية بتركيز OD 520 = 0.05 يسمح استيعاب كافية.

6. التصوير

  1. استخدام نظام التصوير متحد البؤر مثل متحد البؤر الليزر المسح الضوئي (CLSM) أو قرص الغزل (SD) المجهر مع الغرفة البيئية مرطب للالتصوير عالية الدقة على مختلف نقاط الوقت.
  2. التبديل على درجات الحرارة جontrol النظام والانتظار حتى أنها مستقرة. تحسين إعدادات التصوير مثل التكبير، سرعة المسح الضوئي، والقرار، Z-كومة الخ استخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة لGFP ومصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين. لهذا البروتوكول، استخدم 400 هرتز سرعة المسح الضوئي، وقرار من 512 × 512 بكسل وحجم Z-خطوة من 0.25 ميكرون. تثير GFP والذهب-BSA-رودامين باستخدام الليزر هارون (488 نانومتر) والليزر الحنة (543 نانومتر)، على التوالي. تشمل مشرق الميدان (BF) قناة لرصد شكل الخلايا. لغيرها من نظم المجهري والشروط العدوى، والإعداد يجب أن يتم تعديلها وفقا لذلك.
    ملاحظة: استخدم نفس الليزر AR كمصدر للضوء من قناة BF وإشارة تم الكشف مع صورة المضاعف (PMT) كاشف.
  3. في الوقت المشار إليه نقاط بي، جبل الشرائح الغرفة 8 جيدا تحتوي على الخلايا المصابة على المسرح المجهر والصور قياسية.

7. تحليل الصور

  1. استخدام برامج التحليل المجهري صورة (انظر مواد ومعدات الجدول) للتحليل في إعادة بناء نظام إندو الليزوزومية من قبل الخلايا السالمونيلا. فتح البيانات عن طريق النقر على 'فتح' واختيار الملف.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، مفتوحة حزم برمجيات المصدر مثل يماغيج أو فيجي يمكن أن تستخدم لصورة الكمية تحلل.
  2. في شريط الأدوات كائنات من فق رأي انقر على أيقونة figure-protocol-8542 لإضافة عنصر سطح جديد. انقر على figure-protocol-8660 (التالى).
  3. لتحليل المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، حدد جزء من العائد على الاستثمار. في منطقة المشاهدة، قسم تحدها المستطيل مضافين على الصورة ويمثل العائد على الاستثمار. أدخل القيم في X- المقابلة، Y-، وحقول Z-، أو النقر مباشرة على الأسهم في المعاينة المستطيل لتعديل حجم وموضع من العائد على الاستثمار. ثم انقر فوق figure-protocol-9102 = "/ الملفات / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (التالي).
  4. كقناة المصدر، حدد القناة 3 (إشارة للذهب-BSA-رودامين NPS). التحقق من الخيار السلس لإعداد نعومة المنطقة الناتجة عن ذلك. تعريف قيمة يدويا أو قبول القيمة التي تنشأ تلقائيا. للعتبة، حدد الخيار كثافة المطلق.
  5. لتعديل العتبة، حدد الخيار اليدوي وتعيين قيمة. في مساحة العرض، يتم عرض معاينة عتبة السطح في الرمادي.
  6. على علامة التبويب صنف السطوح السطح الناتجة يمكن أن تتم تصفيته وفقا لمعايير مختلفة. مرشح الافتراضي هو يمكن أيضا أن يدرج 'عدد من voxels> 10'، وغيرها من المرشحات بواسطة الضغط على 'إضافة'. إذا كان الترشيح ليست ضرورية، ثم حذف جميع المرشحات عن طريق النقر على زر حذف. انقر figure-protocol-9950 (التالى).
  7. لاستكمال إنشاء السطحية، انقر على/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (إنهاء). في قائمة كائن، والآن برنامج الأمم المتحدة للتحقق مربع لهذا البند حجم والجدد سطح إنشاؤها يتم عرض في عرض المنطقة.
  8. تصدير الإحصاءات. الآن، في رأي فق لون الموضوعات تختلف من الأرجواني إلى الأحمر وفقا لمنطقتهم. ويبين الجدول 'أرقام مساحة الأرض' المعلومات إحصاءات (على سبيل المثال، رقم الهوية ومجال الكائنات). تصدير جميع الإحصاءات من سطح 1 إلى ملف Excel عن طريق النقر figure-protocol-10607 (حفظ).

النتائج

وقد تم توليد مصادر القدرة النووية الذهب من خلال طريقة راسخة عبر الحد من حمض chloroauric بواسطة سترات وحمض التانيك. كما هو مبين في الشكل 2A، كانت مصادر القدرة النووية الذهب توليفها شبه كروية الشكل مع حجم ما يقرب من 10 نانومتر. لم BSA طلاء ورودامين وضع العلامات لا تؤثر ا...

Discussion

النظام إندو-الليزوزومية من خلايا الثدييات يتحكم العمليات الفسيولوجية الهامة، بما في ذلك امتصاص العناصر الغذائية، بوساطة هرمون نقل الإشارة والمراقبة المناعة، وعرض المستضد 17. حتى الآن، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من علامات لوضع العلامات على مسار وتتبع الدراسات ...

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Gold chlorideSigma-Aldrich520918
Tannic acidSigma-Aldrich403040
Tri-sodium citrateSigmaC8532
Bovine serum albuminSigmaA2153
NHS-RhodaminePierce46406
DMSOSigmaD8418
HEPESSigmaH3375
GentamicinApplichemA1492
KanamcyinRothT832
CarbenicillinRoth6344
8-well chamber slidesIbidi80826tissue culture treated, sterile
Imaris SoftwareBitplaneversion 7.6various configurations available

References

  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
  18. . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved