Применение люминесцентных наночастиц по изучению ремоделирования Endo-лизосом Системе внутриклеточных бактерий

Резюме

Эта статья описывает методы синтеза и флуоресцентных меток наночастиц (NPS). АПЛ были применены в импульсно-погони экспериментов для обозначения эндо-лизосомальное систему эукариотических клеток. Манипуляции с эндо-лизосомальных системы по деятельности внутриклеточного патогена Сальмонелла энтерика последовали живых клеток изображений и количественно.

Аннотация

Флуоресцентные наночастицы (NPS) с желаемой химической, оптических и механических свойств перспективные методы этикетке внутриклеточных органелл. Здесь мы представляем метод с использованием золото-БСА RHODAMINE NPS для обозначения эндо-лизосомальных систему эукариотических клеток и контролировать манипуляции принимающих клеточных путей внутриклеточной возбудителя Сальмонелла энтерика. АПЛ были легко усвоены HeLa клеток и локализуется в конце эндосомах / лизосом. Сальмонеллез индуцированной перестройки пузырьков и накопления наночастиц в Salmonella- индуцированных мембранных структур. Мы развернули пакет программного обеспечения Imaris для количественного анализа конфокальной микроскопии изображений. Число объектов и их распределение по размерам в неинфицированных клетках отличались от тех, в Salmonella -infected клеток, что указывает на чрезвычайно ремоделирование эндо-лизосомальных системе WT Salmonella.

Введение

Флуоресцентные наночастицы (NPS), в том числе металлических наночастиц, квантовых точек, полимерных наночастиц, кремния наночастиц, углеродных точек и т.д., привлекли значительное внимание в течение последних десятилетий ^{в 1,2 раза.} По сравнению с традиционными органических красителей, флуоресцентные наночастицы показывают желаемые химические, оптические и механические свойства, такие как сильный уровень сигнала, устойчивость к фотообесцвечивание и высокой биосовместимостью ^3,4. Эти преимущества делают их метод выбора для внутриклеточного зондирования и получения изображений живых клеток. Кроме того, различные электронно-плотные НЧ видны с помощью электронной микроскопии (ЭМ), что облегчает их использование в коррелированной микроскопического анализа, который позволяет сочетание живой клетке отслеживание световой микроскопии (LM) и более высоким разрешением на уровне ультраструктуры ЭМ ^5. Например, золото НЧ были давно эффективно использованы в качестве биосенсоров в живых клетках для чувствительной диагностики, а также в области иммуно-маркировки ^6. Последние летtudies показывают, что золото НЧ с различным размером и формой может быть легко поглощать большим разнообразием клеточных линий и регулярно транспортировать через эндосомный пути, следовательно, имеют большой потенциал применяется для внутриклеточного слежения пузырьков транспортировки и эндо-лизосомальных системы маркировки ^7,8 ,

Патогенных микроорганизмов, таких как Сальмонелла энтерика, Shigella Флекснера и листерий, разработали различные механизмы, чтобы вторгнуться без фагоцитоза клеток-хозяев ^9. После того, как усвоены, возбудители, либо локализованные в цитоплазме или поглощенных в мембраносвязанных отсеков, широко взаимодействуют с окружающей их средой принимающих и модулировать их, чтобы способствовать их собственное выживание ^10. Например, Сальмонелла энтерика находится, и повторяет в внутриклеточный phagosomal отсек называется Salmonella -содержащих вакуоль (SCV) при заражении ^11. Со сроком погашения SCVтрафиков к аппарату Гольджи, проходит постоянного взаимодействия с эндоцитотического пути, и индуцирует образование обширных трубчатых структур, таких как Salmonella индуцированной нитей (SIF), сортировка нексин канальцы, Salmonella, индуцированной носители секреторной мембраны белка (3) SCAMP3 канальцев и т.д. ^12-14.. Изучение того, как эти бактериальные патогены манипулировать клетке-хозяине путей имеет важное значение для понимания инфекционной болезни.

Здесь золото-БСА-родамина НЧ были использованы в качестве жидких индикаторов для обозначения узла сотовой системы эндо-лизосомами, и человеческий желудочно-кишечного патогена Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium (Salmonella) был использован в качестве модели бактерии изучить взаимодействие патогена с провести эндоцитотический пути. Внутриклеточные золото-BSA-родаминовые НП в неинфицированных клеток и клеток, инфицированных WT сальмонеллами или мутантных штаммов были обследованы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).Тогда программное обеспечение Imaris был использован для количественного определения распределения наночастиц, указывая, что сальмонеллез индуцированной крайней перестановку эндосомах / лизосом. После описания этого метода, аналогичные эксперименты могут быть разработаны, чтобы отслеживать долгосрочное судьбу интернализованного НП и исследовать влияние различных экзогенных веществ или эндогенных факторов на эндоцитоза пути эукариотических клеток.

протокол

1. Синтез 10 нм наночастиц золота (Gold NPS) ¹⁵

1. Подготовьте раствор А: добавить 2 мл 1% -ного водного хлорида золота в 160 мл Milli-Q или бидистиллированной воды,.
2. Приготовьте раствор B: добавить 8 мл 1% Тринатрийцитрат х 2 H ₂ O и 160 мкл 1% дубильной кислоты в 32 мл Milli-Q, или дважды дистиллированной, водой.
3. Разминка Раствор А и B до 60 ° С и смешивают их при перемешивании. Сразу Соблюдайте темно-синий цвет. Заметим, красным цветом, после примерно 15 мин. Затем нагревают до 95 ° С, сохранить 5 мин и охлаждают раствор до комнатной температуры.
4. Добавить каплю суспензии НП на углеродную покрытием сетки и дайте высохнуть на воздухе. Проверьте размер и морфологию наночастиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

2. Покрытие Gold Соседства с BSA и маркировки с Rhodamine N-гидроксисукцинимидным эфир (NHS) ¹⁶

1. Добавить 900 мкл золотых NPS в 1,5 мл пробирку Эппендорфа, центрифуге при 15000 х г в течение 30 мин. Opнально, подготовить несколько трубок может сразу.
2. Жидкость над осадком сливают, вновь приостановить осадок в 900 мкл стерилизованной Milli-Q воды и добавить 100 мкл 2 мг / мл BSA / PBS, смешивают в вихревом при 800 оборотах в минуту в течение 30 мин.
3. Для удаления избытка BSA, центрифугировать подготовку при 15000 х г в течение 60 мин.
4. Удалите супернатант и вновь приостановить золото-BSA ИГ 125 мкл PBS, добавить 12,5 мкл 1 М бикарбоната.
5. Непосредственно перед использованием, подготовить 10 мг / мл раствора родамина NHS / ДМСО, добавляют 30 мкл родамина NHS / ДМСО раствора к 1 мл суспензии золото-БСА NPS. Инкубируют реакционную смесь в течение 2 ч (или O / N) при комнатной температуре в течение 800 оборотов в минуту перемешивания, избегая воздействия света.
6. Очищают золото-BSA-родамин NPS через диализа против PBS при 4 ° С с 5 буферных изменений за период 36 - 48 часов.
7. Для стабилизации NPS, добавить 10 мкл 200 мг / мл BSA / PBS в каждой 1 мл золото-BSA-родаминовых НП. Для удаления свободного или отпущена BSA-родамин, центрифуги на 15,000 мкг в течение 60 мин. Ресуспендируют осадок в 2 мг / мл BSA / PBS, измерения OD _520, и хранят при температуре 4 ° С, во избежание воздействия света.
8. Развести НП 10 раз с Milli-Q или дважды дистиллированной воды, добавить каплю на покрытую углеродом, сетки, и дайте высохнуть на воздухе. Проверьте размер и морфологию наночастиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
   Примечание: Все материалы, используемые для приготовления НП были стерилизованы и операция была проведена в капот культуре клеток или на скамейке рядом пламени.

3. Культура клеток HeLa

1. HeLa клетки, экспрессирующие постоянно ЛАМПА1-GFP культивируют в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и выращивали при 37 ° С в атмосфере, содержащей 5% СО _2.
2. Семенной клеток при плотности 50000 на лунку в камере слайд 8-а (Ibidi) и инкубируют O / N.

4. Культура бактерий

1. Использование Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium НКТЦ 12023 Wild-типа (WT) штамм. Для сравнения, использовать мутантные штаммы, Δ ssaV дефектные в SPI2-T3SS и Δ SIFA недостающие ключевым эффекторной Сифа для SIF. Использование Штаммы, содержащие плазмиды pFPV25.1 для конститутивной экспрессии GFP повышенной.
   Примечание: Бактериальные штаммы обычно выращивают в Лурии-Бертани бульона (LB) с добавлением 50 мкг / мл карбенициллина (WT) и LB с добавлением 50 мкг / мл карбенициллина и / или 50 мкг / мл канамицина (Δ ssaV, Δ SIFA ) необходимых для поддержания плазмид.
2. Посев одну колонию бактерий в 3 мл LB с соответствующими антибиотиками и расти O / N при 37 ° С при встряхивании условий аэрации, затем разбавленным 1:31 в свежей LB и продолжают рост в течение 3,5 ч. В этом момент времени, культуры достигают поздней лог-фазы и бактерий очень агрессивным. "Валец 'удобно для инкубации культур пробирку с аэрацией.

5. Заражение HeLa клетокSalmonella и золото-BSA-RHODAMINE НП Пульс Chase-маркировки (рис 1 для схемы)

1. Измерить OD ₆₀₀ из суб-культивировали бактерий и разбавьте до OD ₆₀₀ = 0,2 в 1 мл PBS (~ 3 × 10 ⁸ КОЕ / мл), добавляют соответствующие количества бактерий к клеткам HeLa в 8-луночных слайдов камеры, чтобы достичь множество инфекции (МВД) 100.
2. Выдержите в течение 30 мин в клеточной инкубатора, вымыть 3 раза с PBS для удаления не усвоенные бактерии (на этот раз точка была установлена, как 0 ч после заражения, или 0 ч PI). Добавить 300 мкл свежей культуральной средой, содержащей 100 мкг / мл гентамицина и поддерживать в течение 1 часа. Затем заменить среду свежей средой, содержащей 10 мкг / мл гентамицина для остальной части времени инкубации.
3. После инкубации с культуральной среде, содержащей 100 мкг / мл гентамицина в течение 1 ч, среду заменяют на среду визуализации (Орлов MEM без FCS, L-глутамина, фенол красный и бикарбонат натрия, 30 мМ HEPES, рН 7,4) COntaining 10 мкг / мл гентамицина. Золото-БСА-родамин НЧ добавляют к HeLa клеток, чтобы получить конечную концентрацию OD ₅₂₀ = 0,1.
   Примечание: золото-БСА-родамина НЧ также могут быть добавлены к клеткам перед заражением, либо при различных временных точках пи
4. После 1 ч инкубации удалить среды, промыть 3 раза PBS, и добавить 300 мкл свежей среды визуализации, содержащей 10% FCS и 10 мкг / мл гентамицина для остальной части времени инкубации.
   Примечание: Длительность инкубации может варьировать в зависимости от концентрации наночастиц и клеточных линий, используемых. Для RAW264.7 макрофагов, мы наблюдали, что 30-минутной инкубации с НЧ при концентрации OD ₅₂₀ = 0,05 позволило достаточно интернализации.

6. изображений

1. Используйте конфокальной системы визуализации, таких как конфокальной лазерной сканирования (CLSM) или вращающийся диск (SD) микроскопа с влажной камере Окружающая среда для изображения с высоким разрешением на различных временных точках.
2. Включите C Температураontrol систему и подождите, пока он не стабилен. Оптимизация параметров визуализации, таких как увеличение, скорость сканирования, разрешение, Z-Stack и т.д. Используйте соответствующие параметры возбуждения / эмиссии для GFP и золото-BSA-родаминовых НП. Для этого протокола, используйте 400 Гц скорость сканирования, разрешение 512 х 512 пикселей и Z-размер шага 0,25 мкм. Excite GFP и золото-BSA-родамин, используя лазер AR (488 нм) и He-Ne лазер (543 нм), соответственно. Включить светлого поля (BF) канал для наблюдения формы клеток. Для других микроскопия системы и условия инфекция, установка, должны быть соответствующим образом скорректированы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же Ar лазер в качестве источника BF канала и светового сигнала был обнаружен с фото множитель (ФЭУ) детектор.
3. В указанное время-точек П., монтировать камеры слайды 8-а, содержащие инфицированные клетки на предметном столике микроскопа и запись изображений.

7. Анализ изображений

1. Использование программного обеспечения для анализа изображений микроскопии (см Материалы и настольные принадлежности), чтобы проанализировать реконструкцию эндо-лизосомальных системы внутриклеточной сальмонеллы. Откройте файл, нажав «Открыть» и выбрать файл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, программное обеспечение с открытым исходным кодом пакетов, таких как ImageJ или ФИДЖИ могут быть использованы для количественного анализ изображения.
2. На панели инструментов Объекты превзойти вид щелчком по иконке чтобы добавить новый элемент поверхности. Нажмите на (Следующий).
3. Для анализа интересующей нас области (ROI), выберите сегмент ROI. В области просмотра, прямоугольного сечения, граничит накладывается на изображения, представляющий ROI. Введите значения в соответствующем направлении x, y, и z-поля, или непосредственно нажмите на стрелки в окне предварительного просмотра прямоугольника, чтобы изменить размер и положение ROI. Тогда нажмите = "/ Файлы / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Next).
4. Как канала источника, выберите канал 3 (сигнал для Gold-BSA-родамина NPS). Проверьте гладкий вариант для настройки плавности результирующей области. Определить значение вручную или принять автоматически сгенерированное значение. Для порога, выберите опцию абсолютная интенсивность.
5. Для регулировки порога, выберите вариант ручной и установите значение. В области просмотра, порог поверхность предварительный просмотр, отображаются серым цветом.
6. На вкладке классифицировать поверхностей Полученная поверхность могут быть отфильтрованы по различным критериям. Фильтр по умолчанию 'число вокселей> 10 "и другие фильтры также могут быть включены, нажав кнопку" Добавить ". Если фильтрация не нужна, а затем удалить все фильтры, нажав на кнопку Удалить. Нажмите (Следующий).
7. Для завершения создания поверхностей, нажмите на/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). В списке объектов, теперь снимите флажок в поле для элемента объема и вновь созданной поверхности отображается в области просмотра.
8. Экспорт статистики. Теперь, в превзойти зрения цвет предметов варьируется от фиолетового до красного в зависимости от их площади. И "земля Числа Area 'таблица показывает статистическую информацию (например, ID номер и прочих объектов). Экспорт всех статистику поверхности 1 в файл Excel, нажав на кнопку (Сохранить).

Результаты

Золотые наночастицы были получены с помощью хорошо разработанным способом путем снижения золотохлористоводородной кислоты цитрата и дубильной кислоты. Как показано на фиг.2А, синтезированные наночастицы золота были квази-сферическую форму с размерами приблизительно 10 нм. BS...

Обсуждение

Эндо-лизосомальных система клетках млекопитающих контролирует важные физиологические процессы, в том числе поглощения питательных веществ, гормонов опосредуется сигнальной трансдукции, иммунного надзора и презентации антигена ^17. До сих пор, множество маркеров были использова...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold chloride	Sigma-Aldrich	520918
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Tri-sodium citrate	Sigma	C8532
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicin	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-well chamber slides	Ibidi	80826	tissue culture treated, sterile
Imaris Software	Bitplane	version 7.6	various configurations available