Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Zusammenfassung

Fluoreszierende Nanopartikel (NPs) mit wünschenswerten chemischen, optischen und mechanischen Eigenschaften sind versprechendsten Mittel, um intrazelluläre Organellen zu beschriften. Hier stellen wir ein Verfahren unter Verwendung von Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel, die endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren und Manipulationen von Wirtszellwege zu überwachen, indem die intrazelluläre Pathogen Salmonella enterica. Die Nanopartikel wurden leicht durch HeLa-Zellen internalisiert und lokalisiert in späten Endosomen / Lysosomen. Salmonelleninfektion induzierte Umlagerung der Vesikel und Akkumulation von Nanopartikeln in Salmonella induzierten Membranstrukturen. Wir Einsatz der Imaris Softwarepaket für quantitative Analysen der konfokalen Mikroskopie Bilder. Die Anzahl der Objekte und ihre Größenverteilung in nicht-infizierten Zellen waren verschieden von denen in Salmonellen-infizierten Zellen, was eine überaus Umbau des endo-lysosomalen System WT Salmonellen.

Einleitung

Fluoreszierende Nanopartikel (NPs), einschließlich Metall-Nanopartikel, Quantenpunkte, Polymer-Nanopartikel, Silica-Nanopartikel, Carbon Punkte usw., haben in den vergangenen Jahrzehnten ^1,2 beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Im Vergleich zu herkömmlichen organischen Farbstoffen, fluoreszierenden Nanopartikeln zeigen wünschenswerte chemische, optische und mechanische Eigenschaften, wie starke Signalstärke, Resistenz gegen Ausbleichung und hohen Biokompatibilität ^3,4. Diese Vorteile machen sie die Methode der Wahl für die intrazelluläre Erkundung und Live Cell Imaging. Darüber hinaus sind eine Vielzahl von elektronendichte Nanopartikel durch Elektronenmikroskopie (EM) zu sehen, ihre Verwendung zur korrelierten mikroskopische Analyse, die Kombination von Live-Cell-Tracking mit Lichtmikroskopie (LM) und eine höhere Auflösung bei ultrastruktureller Ebene mit EM ⁵ ermöglicht die Erleichterung. So wurden beispielsweise Gold-Nanopartikel lange Zeit effizient als Biosensoren in lebenden Zellen für empfindliche Diagnose sowie auf dem Gebiet der Immunmarkierung ⁶ verwendet wurde. Neueste sTUDIEN zeigen, dass Gold-Nanopartikel mit unterschiedlicher Größe und Form kann leicht sein, die Aufnahme durch eine Vielzahl von Zelllinien und routinemäßig durch den endosomalen Weg zu transportieren, daher haben ein großes Potenzial für die intrazelluläre Vesikel Befinden Transportverfolgung und der endo-lysosomalen System Kennzeichnung angewandt ^7,8 .

Mikrobiellen Krankheitserregern wie Salmonella enterica, Shigella flexneri und Listeria monocytogenes, wurden verschiedene Mechanismen entwickelt, um nicht-phagozytischen Wirtszellen ⁹ einzudringen. Nachdem sie verinnerlicht, die Erreger entweder im Cytosol lokalisiert oder in membrangebundene Kompartimente abgesondert, interagieren intensiv mit ihrer Host-Umgebungen und moduliert diese auf ihr eigenes Überleben ¹⁰ begünstigen. Zum Beispiel befindet sich Salmonella enterica und repliziert in ein intrazelluläres phagosomalen Raum bezeichnet die Salmonellen-haltigen Vakuole (SCV) nach Infektion ^11. Die Reifung SCVVerkehre zu den Golgi-Apparat, das fortlaufend Wechselwirkungen mit dem endocytischen und induziert die Bildung von ausgedehnten röhrenförmige Strukturen, wie Salmon -induzierte Filamente (SIF), Sortierung nexin Tubuli, Salmon -induzierte sekretorischen Trägermembranprotein 3 (SCAMP3) Tubuli, usw. . ^12-14. Studium, wie diese bakterielle Erreger manipulieren Wirtszellsignalwege ist wesentlich für das Verständnis von Infektionskrankheiten.

Hier wurden Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel als Flüssigkeit Tracer verwendet, um die Wirtszellen endo-lysosomalen System kennzeichnen, und der menschlichen Magen-Erreger Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Salmonella) wurde als Modellbakterium verwendet, um die Wechselwirkungen des Erregers mit dem Studium Gastgeber endocytischen. Intrazellulären Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel in nichtinfizierten Zellen und Zellen, die mit WT oder Mutante Salmonella-Stämmen infiziert wurden mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop (CLSM) abgebildet.Dann wurde Imaris Software verwendet, um die Verteilung von Nanopartikeln zu quantifizieren, was anzeigt, daß Salmonella-Infektion induzierten extreme Umlagerung der Endosomen / Lysosomen. Nach der Beschreibung dieser Methode kann analoge Experimente entwickelt, um langfristige Schicksal der internalisierten NPs zu verfolgen und um den Einfluss der verschiedenen exogenen Substanzen oder endogenen Faktoren auf die endocytischen von eukaryontischen Zellen zu untersuchen.

Protokoll

1. Synthese von 10 nm Goldnanopartikel (Gold-Nanopartikel) ¹⁵

1. Bereiten Lösung A: 2 ml 1% ige wässrige Goldchlorid in 160 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser.
2. Bereiten Lösung B: 8 ml 1% Trinatriumcitrat x 2 H ₂ O und 160 ul 1% Gerbsäure in 32 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser.
3. Warm up-Lösung A und B auf 60 ° C und mischen sie unter Rühren. Beachten Sie eine dunkelblaue Farbe sofort. Beachten rot nach ca. 15 min. Dann heizen bis zu 95 ° C, 5 Minuten zu halten und die Lösung auf RT.
4. Fügen Sie einen Tropfen des NP Suspension auf eine kohlenstoffbeschichteten Netz und lassen an der Luft trocknen. Überprüfen Sie die Größe und Morphologie der NPs durch Transmissionselektronenmikroskopie.

2. Beschichtung von Gold-Nanopartikel, die mit BSA und Markierung mit Rhodamin N-Hydroxysuccinimidylester (NHS) ¹⁶

1. Hinzufügen 900 ul NPs in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Zentrifuge bei 15.000 × g für 30 min. Opnational, bereiten mehrere Rohre auf einmal.
2. Überstand verwerfen, resuspendieren Sie das Pellet in 900 ul sterilisiert Milli-Q-Wasser und fügen Sie 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, Mischen auf einem Vortex bei 800 Upm für 30 min.
3. So entfernen Sie überschüssiges BSA, zentrifugieren Sie das Präparat bei 15.000 · g für 60 min.
4. Überstand verwerfen und neu zu suspendieren die Gold-BSA-Nanopartikel in 125 ul PBS, fügen 12,5 ul 1 M Bicarbonat.
5. Unmittelbar vor der Anwendung bereiten eine 10 mg / ml-Lösung von Rhodamin NHS / DMSO, fügen Sie 30 ul Rhodamin NHS / DMSO-Lösung des Gold-BSA-Nanopartikel-Suspension 1 ml. Inkubieren Sie die Reaktion für 2 Stunden (oder O / N) bei RT bei 800 Umdrehungen pro Minute Misch, vermeiden Belichtung.
6. Reinigung der Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel durch Dialyse gegen PBS bei 4 ° C mit 5 Pufferänderungen über den Zeitraum von 36 bis 48 h.
7. Zur Stabilisierung NPs, fügen Sie 10 ul der 200 mg / ml BSA / PBS in jeden 1 ml Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Um die freien oder frei BSA-Rhodamin, Zentrifuge bei 15 zu entfernen,000 × g für 60 min. Das Pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, messen OD _520, und bei 4 ° C, vermeiden Belichtung.
8. Verdünnen Sie die NPs 10 mal mit Milli-Q bzw. doppelt destilliertes Wasser, einen Tropfen auf ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter, und lassen Sie sie an der Luft trocknen lassen. Prüfen Größe und Morphologie der Nanopartikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
   Hinweis: alle für NP Herstellung verwendeten Materialien wurden sterilisiert und der Vorgang wurde in einem Zellkulturhaube oder auf einer Bank neben einer Flamme durchgeführt.

3. Kultur von HeLa-Zellen

1. HeLa Zellen LAMP1-GFP exprimieren, sind dauerhaft in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert und bei 37 ° C in einer Atmosphäre mit 5% CO ₂ gezüchtet.
2. Samen, die Zellen in einer Dichte von 50.000 pro Vertiefung in einem 8-Well-Kammerobjektträger (Ibidi) und Inkubation O / N.

4. Kultur von Bakterien

1. Verwenden Salmonella enterica Serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-Typ (WT) Belastung. Zum Vergleich verwenden Mutantenstämmen Δ ssaV im SPI2-T3SS und Δ SIFA defekt fehlt Schlüssel Effektor SIFA für SIF. Verwenden Stämme Plasmid pFPV25.1 für konstitutive Expression verstärkt GFP.
   HINWEIS: Die Bakterienstämme sind routinemßig gezüchtet in Luria-Bertani-Brühe (LB), mit Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin (WT) und LB unter Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin und / oder 50 & mgr; g / ml Kanamycin (Δ ssaV, Δ Şifa ) der erforderlich ist, um Plasmide zu erhalten.
2. Impfen Sie eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB mit geeigneten Antibiotika und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen für die Belüftung, dann verdünnen 01.31 in frischem LB und das Wachstum weiterhin 3,5 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt, erreichen die Kulturen der späten log-Phase und Bakterien sehr invasiv. A 'Bandage "ist bequem, Reagenzglas Kulturen mit Belüftung inkubiert.

5. Die Infektion von HeLa-Zellen durchSalmonellen and Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel Pulse Chase-Kennzeichnung (siehe Abbildung 1 für Schema)

1. Messen OD ₆₀₀ der Unter kultivierten Bakterien und verdünnt in 1 ml PBS (~ 3 × 10 ⁸ cfu / ml) OD ₆₀₀ = 0,2, fügen geeignete Mengen von Bakterien an HeLa-Zellen in 8-Well-Kammerobjektträgern, eine Vielzahl von zu erzielen Infektion (MOI) von 100.
2. Inkubieren für 30 Minuten in der Zelle Inkubator, waschen 3 Mal mit PBS, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen (dieser Zeitpunkt wurde als 0 Stunden nach der Infektion oder 0 h pi festgelegt). Werden 300 ml frisches Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin und aufrechtzuerhalten für 1 h. Dann ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit.
3. Nach Inkubation mit Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin für 1 h wird das Medium durch Abbilden Medium ersetzt (Eagles MEM ohne FCS, L-Glutamin, Phenolrot und Natriumbicarbonat, mit 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml Gentamicin. Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel werden in HeLa-Zellen gegeben, um eine Endkonzentration von OD ₅₂₀ = 0,1 erhalten.
   HINWEIS: Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel können auch auf Zellen vor der Infektion, oder zu verschiedenen Zeitpunkten zugegeben werden pi
4. Nach 1 h Inkubation Entfernen des Mediums, Waschen 3x mit PBS, und 300 ml frisches Bilderzeugungsmedium, enthaltend 10% FCS und 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit.
   HINWEIS: Dauer der Inkubationszeit kann je nach Konzentration von Nanopartikeln und Zelllinien variieren. Für Makrophagen RAW264.7 beobachteten wir, dass 30 min Inkubation mit Nanopartikeln in einer Konzentration von OD ₅₂₀ = 0,05 erhalten ausreichend Internalisierung.

6. Imaging

1. Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems, wie einem konfokalen Laser-Scanning (CLSM) oder Spinnscheibe (SD) Mikroskop mit einer feuchten Umgebung Kammer hochauflösende Abbildung zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
2. Schalten Sie den Temperatur control System und warten, bis er stabil ist. Optimieren Sie die Bildeinstellungen, wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stapel usw. Verwenden Sie geeignete Anregungs- / Emissions Einstellungen für GFP und Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Aus diesem Protokoll, mit einem 400 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 512 x 512 Bildpunkten und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Erregt GFP und Gold-BSA-Rhodamin Verwendung eines Ar-Lasers (488 nm) und einen HeNe-Laser (543 nm) sind. Fügen Sie eine Hellfeld (BF) Kanal für die Beobachtung der Form der Zellen. Bei anderen Mikroskopsystemen und Infektionsbedingungen die Einstellung muss entsprechend angepasst werden.
   HINWEIS: Die gleichen Ar-Laser als die Lichtquelle der BF Kanal und Signal wurde mit einem Photomultiplier (PMT) Detektor erfaßt.
3. Bei der angegebenen Zeitpunkten pi, montieren Sie die 8-Well-Kammer-Objektträgern, die infizierten Zellen auf dem Mikroskoptisch und speichern.

7. Analyse der Bilder

1. Verwenden Mikroskopie Bildanalyse-Software (siehe Materialien und Geräte der Tabelle), um den Umbau des Endo-lysosomalen System durch intrazelluläre Salmonellen zu untersuchen. Öffnen Sie die Daten, indem Sie auf "Öffnen" und wählen Sie die Datei.
   HINWEIS: Alternativ können Open-Source-Softwarepakete wie ImageJ oder FIJI quantitative Bildanalysen verwendet werden.
2. In der Symbolleiste Objekte des auf das Icon Surpass Sicht um eine neue Oberfläche Artikel hinzuzufügen. Klicken Sie auf (Nächster).
3. So analysieren Sie eine Region of Interest (ROI), wählen Sie Segment ein ROI. In einer Bildfläche wird ein Rechteck umrandeten Abschnitt Bild überlagert, die den ROI. Geben Sie die Werte in der entsprechenden x-, y- und z-Felder, oder klicken Sie direkt auf die Pfeile in der Vorschau Rechteck, um Größe und Position der ROI ändern. Klicken Sie dann auf = "/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg" /> (Next).
4. Als Quellkanal, wählen Sie Kanal 3 (Signal for Gold-BSA-Rhodamin NPs). Überprüfen Sie die glatte Option zum Einrichten der Glätte der resultierenden Fläche. Wert manuell festlegen oder den automatisch generierten Wert zu übernehmen. Für Threshold, wählen Sie die Option Absolute Intensität.
5. Für die Schwelleneinstellung, wählen Sie die manuelle Option wählen und Wert. Im Anzeigebereich wird eine Oberflächengrenze Vorschau grau dargestellt.
6. Auf der Registerkarte Classify Oberflächen können die resultierende Oberfläche nach verschiedenen Kriterien gefiltert werden. Ein Standardfilter ist "Anzahl der Voxel> 10 'und andere Filter können auch durch Klicken auf" Hinzufügen "aufgenommen werden. Wenn eine Filterung nicht notwendig ist, dann alle Filter zu löschen, indem Sie auf die Schaltfläche Löschen. Klicken (Nächster).
7. Um Oberflächen Erstellung abzuschließen, klicken Sie auf/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Fertig stellen). In der Liste Objekt jetzt deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Element Volume und erstellt neue Oberfläche in Sichtbereich angezeigt.
8. Exportieren Sie die Statistiken. Jetzt, in der Surpass Ansicht die Farbe der Themen variieren von violett bis rot nach ihrem Bereich. Und die "Plot Zahlen Raums" Tabelle zeigt die Statistikinformationen (zB ID-Nummer und Fläche von Objekten). Exportieren Sie alle Statistiken der Oberfläche 1 in eine Excel-Datei durch Klick (Speichern).

Ergebnisse

Gold-Nanopartikel wurden durch ein gut etabliertes Verfahren durch Reduktion von Chlorwasserstoffsäure von Citrat und Gerbsäure erzeugt. Wie in 2A gezeigt, waren die synthetisierten NPs quasi-kugelförmiger Gestalt mit einer Größe von etwa 10 nm. BSA-Beschichtung und Rhodamin-Markierung nicht beeinflussen die Morphologie und Größe (2B).

Es wurde berichtet, dass die Gold-Nanopartikel können leicht von verschiedenen Säugerzellen aufgenommen und am Ende...

Diskussion

Die endo-lysosomalen System von Säugerzellen steuert wichtige physiologische Prozesse, einschließlich der Nahrungsaufnahme, Hormon-vermittelten Signaltransduktion, Immunüberwachung und Antigen-Präsentation ^17. Bisher wurde eine Vielzahl von Markern für die Kennzeichnung von endocytischen und Tracking-Studien verwendet. Beispielsweise Lysotracker Sonden fluoreszierend acidotropic Sonden von Molecular Probes (Life Technologies, USA) zum Lysosom Kennzeichnung entwickelt, das sich selektiv anreichernde in ze...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold chloride	Sigma-Aldrich	520918
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Tri-sodium citrate	Sigma	C8532
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicin	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-well chamber slides	Ibidi	80826	tissue culture treated, sterile
Imaris Software	Bitplane	version 7.6	various configurations available