יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Summary

מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.

Abstract

חלקיקי ניאון (NPS) עם כימי רצוי, תכונות אופטיות ומכאניות הם כלים מבטיחים לתייג אברונים תוך-תאיים. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות זהב-BSA-rhodamine צירופים ולתייג את מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים ולעקוב אחר מניפולציות של מסלולים סלולריים מארח ידי enterica סלמונלה הפתוגן תאיים. הצירופים והופנמו בקלות על ידי תאי הלה ומקומיים בendosomes / lysosomes מאוחר. זיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש של שלפוחית ​​והצטברות של צירופים ובמבני קרום Salmonella- מושרה. אנחנו פרסנו את חבילת תוכנת Imaris לניתוחים כמותיים של תמונות מיקרוסקופיה confocal. מספר האובייקטים והתפלגות גודלם בתאים הנגועים שאינם היו שונים מאלה בתאי -infected סלמונלה, המציין מאוד שיפוץ של מערכת אנדו-lysosomal ידי WT סלמונלה.

Introduction

חלקיקי ניאון (NPS), כוללים צירופים ומתכת, נקודות קוונטיות, צירופים ופולימר, צירופים וסיליקה, נקודות פחמן, וכו ', משכו תשומת לב רבה במהלך העשורים האחרונים ^1,2. בהשוואה לצבעים אורגניים מסורתיים, צירופים וניאון להראות כימיים, תכונות אופטיות ומכאניות רצויות, כגון עוצמת אות חזקה, התנגדות לphotobleaching ^ו3,4 biocompatibility גבוה. יתרונות אלה הופכים אותם לשיטת בחירה של חישה תאית והדמיה תא חי. יתר על כן, מגוון רחב של צירופים ואלקטרון-צפוף גלוי על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), המאפשר את השימוש בם לניתוח מיקרוסקופי מתואם, המאפשר שילוב של תא חי מעקב עם מיקרוסקופ אור (LM) ורזולוציה גבוהה יותר ברמת ultrastructural עם EM ^5. לדוגמא, צירופים וזהב היו זמן רב ביעילות משמש כחיישנים ביולוגיים בתאים חיים לאבחון רגיש, כמו גם בתחום אימונו-תיוג ^6. ים האחרוןtudies עולה כי צירופים וזהב עם גודל וצורה שונים יכול להיות בקלות ספיגה על ידי מגוון גדול של שורות תאים ובאופן שיגרתי להעביר דרך מסלול endosomal, ולכן יש לי יצור פוטנציאל גדול הגיש בקשה למעקב תחבורה השלפוחית ​​תאית ותיוג מערכת אנדו-lysosomal ^7,8 .

פתוגנים חיידקים, כגון סלמונלה enterica, flexneri Shigella וחיידקים ליסטריה, פיתחו מנגנונים שונים כדי לפלוש תאי מארח שאינו phagocytic ^9. לאחר שהפנים, פתוגנים, מקומי או בcytosol או מוחרם בתאי קרום נכנסים, אינטראקציה נרחבת עם סביבות המארח שלהם ולווסת את אלה לטובת ההישרדות שלהם ^10. לדוגמא, enterica סלמונלה מתגורר ומשכפל בתוך תא phagosomal תאית המכונה vacuole המכיל סלמונלה (SCV) על זיהום ^11. SCV ההתבגרותtraffics כלפי מערכת גולג'י, עוברים אינטראקציות רציפות עם מסלול endocytic, וגורם להיווצרות של מבנים נרחבים צינורי, כגון חוטי -induced סלמונלה (SIF), מיון tubules nexin, 3 tubules סלמונלה מוביל הפרשת -induced חלבון קרום (SCAMP3), וכו ' . ^12-14. לומדים איך חיידקים פתוגנים אלה לתפעל מסלולי מארח תאים חיוני להבנת מחלה זיהומית.

כאן, צירופים וזהב-BSA-rhodamine שמשו כקליעים נותבים נוזל לתייג מערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח, והפתוגן עיכול Typhimurium serovar enterica אדם סלמונלה (Salmonella) שימש כחיידק מודל ללמוד את יחסי הגומלין של הפתוגן עם לארח מסלול endocytic. צירופים וזהב-BSA-rhodamine תאיים בתאים הנגועים באי ותאים נגועים בסלמונלה WT או זנים מוטנטים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה (CLSM).אז תוכנת Imaris שימשה לכמת את ההפצה של צירופים ו, מצביע על כך שזיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש קיצוני של endosomes / lysosomes. לאחר התיאור של שיטה זו, יכולים להיות מתוכנן ניסויים מקבילים כדי לעקוב אחר גורל לטווח הארוך של צירופים והמופנמים ולחקור את ההשפעה של חומרים אקסוגניים שונים או גורמים במשק על מסלול endocytic של תאים האיקריוטים.

Protocol

1. סינתזה של 10 ננומטר זהב חלקיקים (זהב NPS) ¹⁵

1. הכן פתרון: להוסיף 2 מיליליטר 1% כלוריד זהב המימי ל160 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים.
2. הכן הפתרון B: להוסיף 8 מיליליטר 1% ציטראט x 2 H תלת-נתרן ₂ O ו -160% μl 1 חומצה טאנית ל -32 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים.
3. לחמם את הפתרון A ו- B ל- 60 ° C ומערבבים אותם תוך ערבוב. שים לב בצבע כחול כהה באופן מיידי. שים לב צבע אדום לאחר כ -15 דקות. לאחר מכן לחמם עד 95 מעלות צלזיוס, לשמור על 5 דקות ולקרר את הפתרון לRT.
4. הוסף טיפה של ההשעיה NP על פחמן רשת מצופה ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר.

2. ציפוי של צירופים וזהב עם BSA ותיוג עם Rhodamine N-hydroxysuccinimidyl אסתר (NHS) ¹⁶

1. להוסיף 900 ​​μl צירופים וזהב לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב 15,000 XG למשך 30 דקות. אופtionally, להכין צינורות מרובים עשויים בבת אחת.
2. בטל supernatant, מחדש להשעות את גלולה ב900 μl מעוקר המים מילי- Q ולהוסיף 100 μl 2 מ"ג / מיליליטר BSA / PBS, לערבב במערבולת ב 800 סל"ד במשך 30 דקות.
3. כדי להסיר BSA העודף, צנטריפוגות ההכנה ב15,000 XG במשך 60 דקות.
4. בטל supernatant, מחדש להשעות הצירופים והזהב-BSA ב125 μl PBS, להוסיף 12.5 μl של יקרבונט 1 M.
5. מייד לפני השימוש, להכין פתרון 10 מ"ג / מיליליטר של rhodamine NHS / DMSO, להוסיף 30 μl של פתרון / DMSO rhodamine NHS ל1ml של ההשעיה זהב-BSA הצירופים. דגירה התגובה לשעה 2 (או O / N) ב RT במהלך 800 ערבוב סל"ד, הימנעות מחשיפה לאור.
6. לטהר את הצירופים וזהב-BSA-rhodamine באמצעות דיאליזה נגד PBS בºC 4 עם 5 חיץ שינויים על פני תקופת 36-48 שעות.
7. כדי לייצב צירופים ו, ​​להוסיף 10 μl של 200 מ"ג / BSA / PBS מיליליטר לכל 1 מיליליטר צירופים וזהב-BSA-rhodamine. כדי להסיר את צנטריפוגות בחינם או שוחררה BSA-rhodamine, בגיל 15,000 XG במשך 60 דקות. Resuspend גלולה ב 2 מ"ג / מיליליטר BSA / PBS, למדוד OD _520, ולאחסן ב 4 ° C, הימנעות מחשיפה לאור.
8. לדלל את הפעמים הצירופים 10 עם מילי- Q או מים מזוקקים פעמיים, להוסיף טיפה על רשת מצופה פחמן, ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר (TEM).
   הערה: כל החומרים המשמשים להכנת NP עוקרו והמבצע שנערך במכסת מנוע תרבית תאים או על ספסל ליד להבה.

3. תרבות של תאי הלה

1. תאי הלה באופן קבוע להביע LAMP1-GFP בתרבית DMEM עם סרום 10% עגל עוברי (FCS) וגדלתי על 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO _2.
2. זרעי התאים בצפיפות של 50,000 לכל גם בתא שקופית 8 היטב (Ibidi) ודגירת O / N.

4. תרבות של חיידקים

1. serovar enterica השימוש סלמונלה Typhimurium NCTC 12,023 wild-סוג מתח (WT). לשם השוואה, להשתמש זנים מוטנטים Δ ssaV פגומים בSPI2-T3SS וΔ SIFA חסר מפעיל מפתח SIFA לSIF. השתמש בזני חסת פלסמיד pFPV25.1 לביטוי מכונן של ה- GFP המשופר.
   הערה: זני חיידקים באופן שיגרתי בתרבית במרק לוריא-Bertani (LB) עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin (WT) וLB עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו / או 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin (Δ ssaV, Δ SIFA ) של הנדרש כדי לשמור על פלסמידים.
2. לחסן מושבה אחת של חיידקים ב 3 מיליליטר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים לאוורור, ואז לדלל 01:31 בLB הטרי ולהמשיך את הצמיחה תמורת 3.5 שעות. בנקודה זמן זו, התרבויות להגיע השלב מאוחר יומן וחיידקים הם פולשני מאוד. "תוף הרים 'הוא נוח לדגירת תרבויות מבחנה עם אוורור.

5. זיהום של תאי הלה על ידיסלמונלה וזהב-BSA-Rhodamine צירופים וPulse צ'ייס תיוג (ראה תרשים 1 לערכה)

1. למדוד OD ₆₀₀ של החיידקים תת תרבות ולדלל את OD ₆₀₀ = 0.2 ב 1 מיליליטר PBS (~ 3 CFU × 10 ⁸ / מיליליטר), להוסיף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי הלה בשקופיות קאמריות 8 היטב כדי להשיג ריבוי זיהום (משרד הפנים) של 100.
2. דגירה למשך 30 דקות בחממת התא, לשטוף 3 פעמים עם PBS להסיר חיידקים שאינם מופנמים (זמן נקודה זו נקבעה כלאחר זיהום 0 שעה, או 0 pi hr). להוסיף 300 μl של מדיום תרבות הטרי המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין ולשמור עבור שעה 1. לאחר מכן להחליף בינוני עם בינוני טרי המכיל גנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה.
3. לאחר הדגרה עם מדיום תרבות המכיל גנטמיצין / מיליליטר 100 מיקרוגרם לשעה 1, הבינוני הוא הוחלף על ידי הדמיה בינונית (הנשרים MEM ללא FCS, L-גלוטמין, ביקרבונט האדום ונתרן פנול, עם 30 מ"מ HEPES, pH 7.4) במשותףntaining 10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. צירופים וזהב-BSA-rhodamine מתווספים לתאי הלה להשיג ריכוז סופי של OD ₅₂₀ = 0.1.
   הערה: צירופים וזהב-BSA-rhodamine יכול להיות גם הוסיפו לתאים לפני ההדבקה, או בpi נקודות הזמן השונים
4. לאחר הדגירה 1 שעה, להסיר את המדיום, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 300 μl של מדיום הדמיה טרי המכיל 10% FCS וגנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה.
   הערה: משך הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז של צירופים ושורות תאים בשימוש. למקרופאגים RAW264.7, שמה לב שדגירת דקות 30 עם צירופים ובריכוז של OD ₅₂₀ = 0.05 אפשר הפנמה מספקת.

6. הדמיה

1. השתמש במערכת הדמיה confocal כגון לייזר סריקת confocal (CLSM) או מיקרוסקופ דיסק מסתובב (SD) עם תא סביבת humidified להדמיה ברזולוציה גבוהה בזמן נקודות שונות.
2. לעבור על ג הטמפרטורהontrol מערכת ולחכות עד שהוא יציב. למטב את הגדרות ההדמיה כגון הגדלה, מהירות סריקה, רזולוציה, Z-ערימה וכו 'השתמש בהגדרות עירור / פליטה מתאימות לGFP וצירופים וזהב-BSA-rhodamine. לפרוטוקול זה, השתמש 400 הרץ מהירות סריקה, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים וגודל Z-צעד של 0.25 מיקרומטר. Excite GFP וזהב-BSA-rhodamine באמצעות לייזר Ar (488 ננומטר) וליזר HeNe (543 ננומטר), בהתאמה. כולל בהיר שדה ערוץ (BF) להתבוננות בדמותם של התאים. למערכות אחרות במיקרוסקופ ותנאי זיהום, ההגדרה צריכה להיות בהתאם.
   הערה: השתמש באותה הלייזר Ar כמקור האור של ערוץ BF ואות זוהה עם גלאי מכפיל תמונה (PMT).
3. בpi נקודות הזמן שצוין, הר השקופיות קאמריות 8-היטב המכילות תאים נגועים על הבמה מיקרוסקופ ותמונות שיא.

7. ניתוח של תמונות

1. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה מיקרוסקופית (ראה חומרים ולוח של הציוד) כדי לנתח את העיצוב מחדש של מערכת אנדו-lysosomal ידי סלמונלה תאית. פתח את הנתונים על-ידי לחיצה על 'פתח' ובחירת הקובץ.
   הערה: לחלופין, חבילות תוכנת קוד פתוחות כגון ImageJ או פיג'י עשויות לשמש לתמונת ניתוחים כמותיים.
2. בסרגל הכלים האובייקטים של קליק לעלות מבט על הסמל כדי להוסיף פריט שטח חדש. לחץ על (הבא).
3. כדי לנתח אזור של העניין (ROI), מגזר בחר ROI. באזור תצוגה, סעיף-גובל מלבן מעולף על תמונה המייצג את ההחזר על ההשקעה. הזן את הערכים בקואורדינטות x המקבילות, y-, ושדות Z-, או ישירות לחץ על החצים במלבן התצוגה המקדימה לגודל ומיקום של ההחזר על ההשקעה לשנות. לאחר מכן לחץ על = "/ קבצים / ftp_upload / 52,058 / 52058icon2.jpg" /> (הבא).
4. כערוץ מקור, ערוץ בחר 3 (אות לזהב-BSA-Rhodamine NPS). בדוק את האפשרות החלקה להגדיר את החלקות באזור וכתוצאה מכך. להגדיר ערך באופן ידני או לקבל את הערך שנוצר באופן אוטומטי. לסף, בחר באפשרות העוצמה מוחלטת.
5. להתאמת הסף, בחר באפשרות הידנית ולהגדיר ערך. באזור התצוגה, תצוגה מקדימה סף משטח מוצגת באפור.
6. על המשטחים לסווג כרטיסיית פני השטח וכתוצאה ניתן לסנן לפי קריטריונים שונים. מסנן ברירת מחדל הוא 'מספר voxels> 10', ומסננים אחרים יכול להיכלל גם על ידי לחיצה על "הוספה". אם סינון אין צורך, ולאחר מכן למחוק את כל המסננים על ידי לחיצה על כפתור המחיקה. לחץ (הבא).
7. כדי להשלים את יצירת Surface, לחץ על/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). ברשימת האובייקט, עכשיו את הסימון בתיבה לVolume הפריט והמשטח שנוצר חדש מוצג בשטח צפייה.
8. לייצא את הנתונים הסטטיסטיים. עכשיו, בתצוגה לעלות את הצבע של הנושאים משתנים מסגול לאדום בהתאם לאזור שלהם. והשולחן 'פינת מספרי מגרש' מציג את המידע הסטטיסטי (למשל, מספר תעודת זהות ושטח של אובייקטים). לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים של משטח 1 לקובץ Excel על ידי לחיצה (שמור).

תוצאות

צירופים וזהב שהופקו באמצעות שיטה מבוססת היטב באמצעות הפחתה של חומצת chloroauric ידי ציטראט וחומצה טאני. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הצירופים והזהב מסונתזים היו מעין-כדוריים בצורה בגודל של כ -10 ננומטר. BSA-הציפוי וrhodamine תיוג לא השפיעו המורפולוגיה שלהם או גודל (איו?...

Discussion

מערכת אנדו-lysosomal של תאי יונקים שולטת בתהליכים פיסיולוגיים חשובים, כוללים מזין קליטה, הולכים אותות בתיווך הורמון, מעקב חיסוני, והצגת אנטיגן ^17. עד עכשיו, מגוון רחב של סמנים שימש במשך תיוג של לימודי מסלול ומעקב endocytic. לדוגמא, בדיקות Lysotracker הן בדיקות ניאון acidotropic שפות?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold chloride	Sigma-Aldrich	520918
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Tri-sodium citrate	Sigma	C8532
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicin	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carbenicillin	Roth	6344
8-well chamber slides	Ibidi	80826	tissue culture treated, sterile
Imaris Software	Bitplane	version 7.6	various configurations available