التدخل RNA اليرقات في الأحمر خنفساء الدقيق،<em&gt; كونفيوسم كاستانيم</em

Summary

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تقنيات الجينات ضربة قاضية المستندة هي في صميم البحث كونفيوسم. هنا، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في كونفيوسم كاستانيم. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية توفر الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة الظواهر، مما يسمح للباحثين لدراسة وظائف الجينات في سياقات متنوعة.

Abstract

خنفساء الطحين الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم، ويوفر ذخيرة من الأدوات التجريبية للدراسات الجينية والتنموية، بما في ذلك تسلسل الجينوم الكامل المشروح، نقل الجينات القائم على ينقول، والتدخل الفعال RNA (رني). ومن بين هذه المزايا والتقنيات القائمة على الجينات ضربة قاضية رني هي في صميم البحث كونفيوسم. T. كاستانيم تظهر استجابة قوية رني النظامية، مما يجعل من الممكن لأداء رني في أي مرحلة الحياة ببساطة عن طريق حقن RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) في تجويف جسم الخنفساء.

في هذا التقرير، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في T. كاستانيم. ويشمل البروتوكول (ط) عزلة المرحلة المناسبة من T. اليرقات كاستانيم للحقن، (ب) تمهيدا لإعداد الحقن، و (iii) حقن الرنا المزدوج الجديلة. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية التي توفر لنا الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة phenotypوفاق، بما في ذلك متعددة الجينات الظواهر ضربة قاضية فضلا عن سلسلة من الظواهر hypomorphic. منذ تقريبا كل T. الأنسجة كاستانيم عرضة للالرنا المزدوج الجديلة خارج الخلية، وتقنية رني اليرقات تسمح للباحثين لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة في سياقات متنوعة، بما في ذلك الأساس الجيني للاستجابات عضوي للبيئة الخارجية. بالإضافة إلى ذلك، بساطة هذه التقنية تحفز مزيدا من المشاركة الطلابية في مجال البحوث، مما يجعل T. كاستانيم نظام وراثي مثالية للاستخدام في الفصول الدراسية.

Introduction

خنفساء الطحين الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم، تكتسب شعبية في مختلف مجالات البيولوجيا ويرجع ذلك جزئيا إلى سهولة أداء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) ^1-3. الجينات ضربة قاضية التقنيات المستندة إلى رني تسمح للعلماء لإجراء تحليلات الخسارة من وظيفة دون اللجوء إلى استخدام الأساليب الوراثية المعقدة. T. كاستانيم تظهر استجابة قوية رني النظامية، مما يجعل من الممكن لأداء رني في أي مرحلة من خلال حقن بسيطة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) في الخنفساء تجويف الجسم ^4-6. ضربة قاضية للجينات متعددة في وقت واحد هي أيضا مجدية في T. كاستانيم عن طريق حقن اثنين أو أكثر من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة في نفس الوقت ^7،8. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتولد سلسلة من الظواهر hypomorphic عن طريق الحد من تركيز حقن الرنا المزدوج الجديلة ^8. هذه الميزات تجعل التقنيات الوراثية العكسية على أساس رني بدائل جذابة لعلم الوراثة إلى الأمام التقليدية في T. كاستانيم. منذ تقريباكل T. الأنسجة كاستانيم عرضة للخارج الخلية جزيئات الرنا المزدوج الجديلة ^9، وهذا الأسلوب يسمح للباحثين لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة في سياقات متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هذا التقرير يركز على أداء رني في T. كاستانيم، العديد من الإجراءات الموضحة هنا تنطبق على غيرها من الحشرات. لذلك، هذا البروتوكول هو مفيد لأولئك الذين يرغبون في إجراء تحليلات الخسارة من وظيفة في سياقاتها الاهتمام T. كاستانيم، وكذلك للباحثين الذين يرغبون في تطبيق تقنية رني استنادا إلى الحشرات الأخرى.

حقن الرنا المزدوج الجديلة إلى يرقات يسمح التحليل الوظيفي في مجموعة متنوعة من مراحل حياة الخنفساء، بما في ذلك اليرقات، العذراء، والكبار مراحل ^4،5،10. لقد ذكرت سابقا لدينا بروتوكول رني العام اليرقات بما في ذلك إجراءات البيولوجيا الجزيئية ^11. في التقرير الحالي، ونحن نركز على وصف الإجراءات حقن الرنا المزدوج الجديلة، والتي هي أفضل وأوضح البصري مع مساعديه. نحن نقدمإجراءات مفصلة خطوة بخطوة حقن فضلا عن أمثلة حقن الجيدة والسيئة. هذا البروتوكول يكمل البصرية البروتوكول السابق، وعند الجمع، وتقديم وجهة نظر أكثر شمولا من الإجراءات رني اليرقات في T. كاستانيم. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش المعلمات لجزيئات الرنا المزدوج الجديلة التي يمكن أن تؤثر على نجاح رني، وتطبيق المقايسات مقرها رني للبحوث الفسيولوجي، فضلا عن تطبيق البروتوكول رني اليرقات في المختبر التدريس.

Protocol

1. T. الأسهم كاستانيم والتثقيف

1. اتخاذ قرار بشأن T. سلالة كاستانيم لاستخدامها في التجربة.
   ملاحظة: العديد من T. تأسست المختبر هي سلالات كاستانيم المتاحة. جا 1 (جورجيا-1) هو سلالة الأبوية من الجا-2 الذي تم استخدامه لتسلسل الجينوم ^3. منذ جا 1 أسهم معظم الأشكال الحمض النووي (مثل تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد، تعدد الأشكال) مع الجا-2، وهو أكثر صحة من جا 2 بسبب زواج الأقارب أقل، وهو مثالي للتجارب رني. بو-11 غير مريحة سلالة أخرى لاستخدام ، كما في تعزيز الأصفر بروتين فلوري (EYFP) التعبير الفريد في الجناح براعم المستقبل يتيح لنا التمييز بين الطور اليرقي الأخير من الأعمار الأخرى (انظر الشكل S4-Hachtel كلارك وآخرون 2013 ^12). من المهم توثيق الذي خنفساء سلالة استخدمت في التجربة، كما تظهر خلفيات وراثية إلى حد كبير قسم الشؤون الماليةإلخ من الظواهر رني ^13.
2. إعداد T. كاستانيم ثقافة الدقيق بإضافة 5٪ (بالوزن) من الخميرة منخول قبل البيرة لعضوي دقيق القمح الكامل (بعد الاختلاط، تخزين الدقيق الثقافة في -20 درجة مئوية). قسامة الدقيق الثقافة (في درجة حرارة الغرفة) إلى 6 زجاجات البلاستيك أوقية الأسهم ذبابة الفاكهة (حوالي 40 جم / زجاجة).
3. ثقافة T. كاستانيم عند 30 درجة مئوية مع رطوبة 70٪. استخدام حاضنة الرطوبة التي تسيطر عليها إن أمكن. إضافة 30-40 البالغين في زجاجة الثقافة (الذكور: نسبة الإناث 1: 1) لبدء الثقافة.
   ملاحظة: على الرغم من العفن ونادرا ما قضية عند 30 درجة مئوية، وانخفاض درجات الحرارة (مثل 25 ° C) مع 70٪ الرطوبة يمكن أن يسبب نمو العفن في الدقيق الثقافة. انخفاض الرطوبة إذا حدث هذا.
4. نقل البالغين إلى زجاجة ثقافة جديدة كل أسبوعين لsubculturing (راجع الخطوة 5،2-5،5 عن كيفية عزل البالغين من الطحين الثقافة).
   ملاحظة: يستغرق حوالي ثلاثة أسابيع للحصول على يرقات الطور الماضية. Alternatively، T. يمكن أن تظل الثقافات كاستانيم في انخفاض درجة الحرارة (20-25 درجة مئوية)، ولكن مع فترة أطول زراعة (الوقت التنموي في 25 ° C هو تقريبا ضعف هذا عند 30 درجة مئوية).

2. إعداد حلول وأدوات لحقن الرنا المزدوج الجديلة اليرقية

1. تجميع جزيئات الرنا المزدوج الجديلة متماثلة إلى الجين المستهدف من قبل في المختبر النسخ. تخزين في -80 درجة مئوية. ويرى فيليب توموياسو 2011 ¹¹ وللإجراءات البيولوجيا الجزيئية تفصيلا. انظر أيضا مناقشة لعدد من المعلمات التي تحتاج إلى أخذها في الاعتبار عند تصميم جزيئات الرنا المزدوج الجديلة.
2. جعل 10 مل من 0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة (درجة الحموضة 7.6 عند 25 ° C) عن طريق خلط 8.5 مل من 1 M نا ₂ هبو ₄ مع 1.5 مل من 1 M ناه ₂ ص _4. تحقق الرقم الهيدروجيني مع متر الرقم الهيدروجيني وضبط وفقا لذلك.
3. جعل 1 مل من 10X حقن عازلة عن طريق خلط 10 ميكرولتر من 0.1 M عازلة فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية)، و 100 _6؛ ل 0.5 M بوكل، 100 ميكرولتر من صبغة الطعام الخضراء، و 790 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج (DDH ₂ O). تمييع عازلة 10X حقن لجعل 2X حقن العازلة (200 ميكرولتر 10X حقن عازلة + 800 ميكرولتر DDH ₂ O). تخزين كل 10X وحقن 2X مخازن في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
4. إعداد مثبت الزجاج الشرائح.
   1. تغطية شريحة زجاجية بالكامل مع شكل من أشكال repositionable الغراء لحقن اليرقات. للبالغين العذراء أو الحقن، وجعل اثنين من شرائح رقيقة من الغراء على طول الحواف أطول من الشريحة.
   2. السماح للالغراء لتجف لعدة أيام، والتي تضمن أن يبقى الغراء مبتذل بما فيه الكفاية على الالتزام الخنافس إلى الشريحة، في حين تبقى أيضا مطواعة بما فيه الكفاية لتسهيل إزالتها بعد الحقن.
      ملاحظة: إذا كان الغراء يبقى لزجة جدا، واستخدام إصبع والاستفادة على الغراء، والتي سوف تقلل من الابتذال. كل شريحة يمكن أن تعقد ما يصل إلى 40 أو 50 الخنافس، ويمكن إعادة استخدامها حتى يفشل في عقد آمن الحيوانات. Alternatively، ويمكن أيضا الشريط على الوجهين استخدامها، على الرغم من أن الشريط هو في بعض الأحيان لا يكفي اصقة لعقد اليرقات.
5. تقديم سلة التخدير بالأثير.
   1. إزالة المكبس من 10 مل حقنة واحدة، وقطع في نصف حقنة حول خط 6 مل.
   2. تجاهل النصف السفلي من حقنة. لفترة وجيزة تسخين سطح قطع من الجزء العلوي من الحقنة مع الموقد الغازي، ودفع بسرعة البلاستيك ذاب على قطعة من شبكة من النايلون لالغراء على شبكة الحقنة. تقليم بعيدا أي شبكة الزائدة مرة واحدة يصلب البلاستيك.
6. تحضير زجاجة الأثير. إضافة 30 مل من الأثير إلى ضيق الفم 100 أو 250 مل زجاجة الزجاج. إضافة عدة قطع من المناديل الورقية لتعزيز تبخر الأثير.
   ملاحظة: يعرض الأثير خطرا على النار وأيضا ضارة. التعامل مع الأثير دائما تحت غطاء الدخان. إغلاق الغطاء بإحكام في حين لا تكون قيد الاستعمال.
   ملاحظة: الآيس يمكن استخدامها كبديل أكثر أمانا (مثل في إعداد الفصول الدراسية)، على الرغم من أن sedatioن أقل فعالية.

3. إعداد اليرقية جهاز حقن

1. وضع المرحلة الميكانيكية XY على مجهر تشريح.
   ملاحظة: هي مراحل XY الميكانيكية المتاحة من الشركات الكبرى المجهر. بدلا من ذلك، يمكن أيضا مراحل المجهر رخيصة يمكن استخدامها لمعظم المجاهر تشريح مع بعض التعديلات (انظر الجدول المواد على سبيل المثال).
2. وضع مناور الإبرة الميكانيكية بالقرب المرحلة الميكانيكية XY.
3. تجميع حقنة الحقن. استخدام محبس رباعية (مع وصلات يور) لتوصيل 30 مل الحقنة لحامل الزجاج إبرة، مما يتيح التلاعب في حقن حقنة دون التأثير على الضغط في إبرة الحقن (انظر فيليب وتوموياسو 2011 ¹¹ وللحقن حقنة مفصلة التجمع).

4. سحب إبر الحقن

1. سحب الإبر الزجاج البورسليكات (B100-50-15، OD: 1 مم، ID: 0.5 مم، 15 سم طول) من قبلمجتذب الإبرة.
   ملاحظة: للحصول على سوتر P-87 أو P-97، استخدم الإعداد "الحرارة = 70، سحب = 45، فيل = 75، الزمن = 90" أو اتبع الفصل 2 من كتاب الطبخ الماصة: خلية ملتصقة، C. ايليجانس، ذبابة الفاكهة، والزرد - أوصى البرامج. الإعدادات المثلى تختلف اعتمادا على نموذج من مجتذب الإبرة. الإعداد لعامة ذبابة الفاكهة حقن الإبرة هو نقطة انطلاق جيدة.
2. متجر سحب الإبر في حالة من البلاستيك (على سبيل المثال، قضية CD البلاستيك) وآمنة مع القابلة للإزالة المعجون المتزايدة.

5. عزل واختيار يرقات

1. وضع منخل رقم 25 على جهاز استقبال غربال.
2. وضع محتويات زجاجة الثقافة (الخنافس والدقيق الثقافة) على غربال، وتدقيق محتويات الفور. لا تترك المحتويات على غربال دون غربلة، كما سيحاول اليرقات بسرعة لتحفر من خلال غربال وتتعثر. تدقيق بقوة المحتويات إلى تسقطوا الطحينمن خلال وترك يرقات القديمة (عادة ^ال 6 و 7 ^تشرين يرقات الطور)، الشرانق، والكبار (جنبا إلى جنب مع البشرة من الصب قبالة، سلخ) خلف على رأس غربال.
3. نقل المواد المتبقية على منخل (الخنافس وسلخ) لعموم البذور. إبقاء التنصت عموم لمنع الخنافس من الهرب.
4. إزالة سلخ والجسيمات الدقيق المتبقية على سطح الخنافس التي تهب بلطف على عموم البذور.
5. الاستفادة من عموم البذور لنقل المحتويات إلى الجزء السفلي من المقلاة. ثم، وترك مقلاة غير مستغل لعدة ثوان. انتظر من البالغين و التي هي أكثر قدرة على الحركة من المراحل الأخرى، للخروج من كومة. إزالة البالغين باستخدام الفرشاة الفنية (على سبيل المثال، 1 سم عرض).
6. الشرانق منفصل يطرق بلطف عموم البذور مع الحفاظ على فم عموم قليلا إلى الأسفل، كما الشرانق تميل إلى لفة أسرع نحو الفم. استخدام الفرشاة لإزالة الشرانق، ولم يتبق سوى اليرقات على عموم البذور.
7. ررالآس اليرقات معزولة في طبق بيتري نظيفة. تحديد مرحلة مناسبة من اليرقات للحقن ووضعها في طبق بيتري منفصل.
   ملاحظة: في وقت مبكر مشاركة يرقات الطور (1-2 اليوم بعد تساقط اليرقات النهائي) وغالبا ما تكون مناسبة عند تحليل تأثير رني على الأشكال التضاريسية الكبار فضلا عن التحول. انها، مع ذلك، من الضروري أحيانا لأداء رني في قبل الأخيرة (أو حتى قبل) مرحلة لتقييم وظائف الجينات في وقت مبكر (على سبيل المثال، أرقام 3E-3H. انظر أيضا كلارك Hachtel وآخرون 2013 ^12). استخدام الشرانق كمرجع لتحديد حجم الطور من اليرقات. ومشاركة الطور اليرقات هي أطول قليلا من الشرانق. بدلا من ذلك، بو-11 يمكن استخدامها لتحديد الطور اليرقات مشاركة وكذلك لتحديد مسار الوقت لتطور يرقات الطور مشاركة (الشكل S4-Hachtel من كلارك وآخرون 2013 ^12).
8. الحفاظ على يرقات المختارة في طبق بتري حتى التخدير بالأثير. وضع بقيةمن اليرقات والمراحل الأخرى من الخنافس (مثل الشرانق والكبار) مرة أخرى في زجاجة الثقافة مع الطحين وإعادته إلى الحاضنة.

6. إعداد إبر الحقن

1. وضع إبرة الزجاج سحبت سابقا على شريحة المجهر والزجاج باستخدام إما تك لزجة أو الشريط على الوجهين. باستخدام ملقط، واختبار نهاية سحبت من الإبرة بينما يبحث من خلال مجهر تشريح لنرى أين الانحناءات طرف. الاستيلاء على المنطقة قليلا نحو الجانب غيض من حيث الانحناءات إبرة مع ملقط وتطور لكسر.
2. إبقاء الإبر جيدة وتجاهل الآخرين. النظر إبرة جيدة كما أن وجود فتح ليست كبيرة جدا ولا صغيرة جدا (حوالي 0.05 مم. أرقام 1A و 1B)، والزاوية لجعل اختراق للبشرة اليرقات أسهل (الأرقام 1B و 2B-2A). النظر إبرة بالسوء (ط) صغيرة جدا، مما يجعل الإقبال على حل الرنا المزدوج الجديلة في إبرة diffiعبادة (الخطوة 7) (أرقام 1D و 2D)، (ب) كبير جدا، مما تسبب في إصابة اليرقات والفتك المحتملة على حقن (1C أرقام و2F)، (ج) حادة، مما يجعل الاختراق للبشرة وزيادة الإصابة الصعبة.
3. إدراج إبرة في حامل إبرة.
   1. أولا، فك غيض من حامل الإبرة ووضع نهاية الجزء الخلفي من الإبرة في طرف حامل. ثم، ضع طوقا المطاط تحت طرف حامل (1 سم على الأقل من نهاية الجزء الخلفي من الإبرة الزجاج).
   2. إدراج الجزء الخلفي من الإبرة في حامل، مع المطاط طوقا إدراجها بالكامل في افتتاح حامل الإبرة. المسمار غيض مرة أخرى على حامل.
4. وضع حامل إبرة تجميعها على مناور الإبرة. الحفاظ على حامل الإبرة بالقرب الأفقي. ضبط الموقف من مناور، لذلك يقع على رأس الإبرة في مركز العرض عند النظر من خلال ميكرoscope.

7. الحل التخصيص المبكر الرنا المزدوج الجديلة في إبرة

1. إعداد الحل حقن الرنا المزدوج الجديلة فقط قبل الحقن عن طريق ضبط التركيز مع DDH ₂ O وخلط الحل الرنا المزدوج الجديلة مع كميات متساوية من 2X عازلة حقن (الخطوة 2.3). يبقي الحل مختلطة على الجليد. انظر المناقشة بشأن تركيز الرنا المزدوج الجديلة.
2. قطع غيض من 20 ميكرولتر المتاح غيض ماصة. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في تلميح ماصة قلصت. إزالة بعناية من طرف ماصة ماصة مع الحفاظ على السوائل في غيض من خلال توفير احداهما. بدلا من ذلك، إزالة بعناية غيض ثم حرك حل لنهاية غيض من خلال توفير الضغط باستخدام إصبع.
3. مكان غيض ماصة مع الحل الرنا المزدوج الجديلة على المسرح المجهر باستخدام تك لزجة مع فتح التي تواجه رأس الإبرة.
4. يبحث من خلال المجهر، والتحرك ببطء غيض تحميل نحو الإبرة حتى غيض منالإبرة فقط داخل غيض ماصة تحميل وإلى الحل.
5. بينما يبحث من خلال المجهر، وسحب بلطف مرة أخرى على المكبس من حقن حقنة لسحب ببطء الحل الرنا المزدوج الجديلة في الإبرة.
   ملاحظة: لا تفرط في الإبرة. ونهاية حل الرنا المزدوج الجديلة تقترب رأس الإبرة، وبطء معدل سحب ووقف تحميل حل قبل غيض من الإبرة سيصل إلى الهواء. إذا وصل الهواء غيض، وسيتم اختيار الحل بسرعة في حامل إبرة، مما أدى إلى قضايا تلوث خطيرة. ووصف إجراءات التنظيف مفصلة للحامل إبرة في فيليب وتوموياسو 2011 ¹¹ و.
6. إزالة الضغط من حقن حقنة وحامل إبرة عن طريق فتح محبس. ثم، تحرك غيض ماصة بعيدا عن رأس الإبرة. رفع الإبرة حتى من مرحلة إلى منع الإضرار بطريق الخطأ الإبرة في حين وضع اليرقات على المسرح. إزالة غيض ماصة أفرغت من المرحلة.

8. حقن الرنا المزدوج الجديلة

1. وضع اليرقات في سلة التخدير بالأثير. استخدام أقل من 10 يرقات إذا تعلم هذه التقنية. 30-40 استخدام اليرقات في جولة واحدة مريحة مرة واحدة مع هذه التقنية.
2. وضع سلة مع يرقات في زجاجة الأثير وإغلاق الغطاء.
   ملاحظة: يعرض الأثير خطرا على النار وأيضا ضارة. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء الدخان.
3. يخدر بالأثير اليرقات لمدة 3 دقائق. تحقق اليرقات للحركة بعد 3 دقائق. وضعها مرة أخرى في زجاجة الأثير لمدة 30 ثانية أخرى إذا كانت لا تزال تتحرك. لا يخدر بالأثير لأكثر من 5 دقائق لأن ذلك قد يزيد الفتك.
   ملاحظة: قد تختلف وقت التخدير بالأثير الأمثل اعتمادا على درجة الحرارة والرطوبة.
4. نقل اليرقات etherized من السلة إلى حافة غير لاصقة من شريحة زجاجية لزجة. باستخدام ملقط وبينما يبحث من خلال المجهر، والتقاط اليرقات كل واحد تلو الآخر ووضعها على الشريحة. وضع عليها أفقيا وبلطف نزولا أجسادهم ورئيس ROM الى الذيل مع ملقط، وتمتد قليلا منهم كما تذهب، للتأكد من أنها مضمونة على الشريحة.
5. وضع الشريحة لزجة مع اليرقات على المسرح المجهر.
6. ادخال الإبرة تحميل الرنا المزدوج الجديلة بلطف إلى الجانب الظهري من اليرقات لتجنب إتلاف الجهاز العصبي المركزي. تجنب أيضا خط الوسط الظهرية، حيث يقع القلب اليرقات هنا. في هذا المجال والخطوات اللاحقة، استخدم دائما في مرحلة لنقل اليرقات إلى إبرة (بدلا من استخدام مناور إبرة لتحريك الإبرة).
   ملاحظة: لا يهم موقع الحقن محدد كما رني في T. كاستانيم يبدو النظامية. ومع ذلك، فإنه عادة ما يكون أسهل لحقن في الجانب الظهري من شرائح الصدر أو البطن.
7. بعد إدخال الإبرة في اليرقات، وسحب الإبرة إلى الخلف قليلا للسماح للغرفة الرنا المزدوج الجديلة لدخول تجويف الجسم اليرقات.
8. دفع بلطف على حقن حقنة حتى الأخضر اليرقات بدورها (أو لون عازلة حقن) وننظر قtretched والكامل.
   ملاحظة: إذا تعلم هذه التقنية، في محاولة لحقن قدر الإمكان إلى تحديد مقدار الحل التي يمكن حقنها في يرقة دون الفتك كبيرة. ومن المسلم به عموما حوالي 0.5-0.7 ميكرولتر.
9. إزالة الإبرة من اليرقات. أثناء إزالة الإبرة، وسحب قليلا مرة أخرى على حقن حقنة لتجنب فقدان الرنا المزدوج الجديلة (كما يجب الحرص على عدم سحب في الهواء).
10. حقن جميع اليرقات على الشريحة. تأكد من إزالة اليرقات التي لم تحقن بنجاح. حقن كاملة قبل اليرقات يستيقظ (في حوالي 10 دقيقة).
11. إزالة الشريحة مع يرقات حقن من حقن المجهر وترك الشريحة لمدة 5 دقائق أكثر حتى جميع اليرقات التعافي من التخدير بالأثير.
12. مع ملقط وتشريح تحت المجهر، ورفع بلطف اليرقات من الرأس إلى الذيل للافراج عنهم من الشريحة لزجة. وضع اليرقات صدر حديثا في طبق بيتري نظيفة. مغادرة اليرقات على طبق بيتري لمدة 10-15 دقيقة للسماح للحقن ثound لجلطة.
13. وضع اليرقات في زجاجة جديدة مع الطحين نظيف ومناسب بما في ذلك تسمية اسم السلالة، ونوع من الرنا المزدوج الجديلة حقن، وتركيز الرنا المزدوج الجديلة، وعدد اليرقات حقن، والتاريخ.
14. ثقافة اليرقات حقنه في 30 درجة مئوية مع رطوبة 70٪. مراقبة اليرقات عن الظواهر رني بانتظام.
    ملاحظة: الطور الأخير تخدر تصبح خادرة اليرقات خلال 7 أيام. ثم، فإن الشرانق eclose في البالغين بعد 7 أيام (إذا لم يكن هناك خلل في توقيت الناجمة عن رني).

9. تأكيد ضربة قاضية والمظهري تحليلات

1. النظر في تقييم كفاءة رني بهدم عدة تقنيات البيولوجيا الجزيئية مختلفة، مثل النسخ العكسي الكمي-PCR (QRT-PCR) والغربية التنشيف. رؤية ميلر وآخرون 2012 ⁽⁷⁾ وفيليب وتوموياسو 2011 ¹¹ وللQPCR مفصل والبقعة الغربية البروتوكول، على التوالي.
2. رني تحليل الظواهر ذات الصلة.
   ملاحظة: رني ذات الصلةويمكن ملاحظة الظواهر في عدة مراحل مختلفة وتحت ظروف ثقافة مختلفة، اعتمادا على الجينات التي تم استهدافها. رني يمكن أن تؤثر على خنفساء التشكل والتحول، علم وظائف الأعضاء والسلوك. كيف وغالبا ما يتم التحقق من وجود النمط الظاهري وتحت أي ظروف وتربية الخنافس يجب أن تصمم على الأسئلة المحددة التي يجري التحقيق فيها من خلال رني.

النتائج

واحدة من الخطوات الرئيسية للحقن الناجح هو جعل إبرة جيدة. كما هو موضح في الخطوة 6، ورأس الإبرة يجب أن تكون مكسورة قبل حقن T. كاستانيم. وترد أمثلة من الإبر جيدة وسيئة في الشكل 1. إبرة جيدة لها طرف حاد وقاسية، والتي يبلغ قطرها حوالي 0.05 مم افتتاح (الشكل 1B).

ويعرض الشكل 2 حقن ناجحة (أرقام 2A و 2B)، فضلا عن العديد من حالات الحقن الفاشلة (أرقام 2C-2F). مع حقن إبرة الحجم بشكل صحيح، طرف الإبرة تخترق بشرة اليرقات مع الحد الأدنى من المقاومة (الشكل 2A)، والحل الرنا المزدوج الجديلة (الأخضر) يصب في اليرقات دون أي تسرب (الشكل 2B). لا الإفراط حقن، لأنه سوف يؤدي فيضان الحل الرنا المزدوج الجديلة حتى مع وجود الحجم بشكل صحيح حقن إبرة (الشكل2C). إذا كان رأس الإبرة رقيقة جدا، وغالبا ما يفشل طرف الإبرة لاختراق إهاب اليرقات والانحناءات، مما يجعل من الصعب حقن (الشكل 2D). إذا حدث هذا، وتقليم طرف الإبرة يساعد في بعض الأحيان. الإبر الكبيرة وغالبا ما تكون لا تزال قابلة للاستخدام، ولكن مع بعض الصعوبات في اختراق اليرقات إهاب (الشكل 2E). ومع ذلك، يتم دفع مبلغ كبير من الحل الرنا المزدوج الجديلة بسهولة من الإبرة حتى مع ضغط طفيف على حقن حقنة، مما أدى إلى فيضان الحل الرنا المزدوج الجديلة (الشكل 2F) في كثير من الأحيان.

عند تنفيذ رني، فمن المهم أن يكون هناك مراقبة إيجابية لتقييم رني أن تعمل بشكل صحيح، وسيطرة سلبية للتحقق من أن لوحظ تأثير ليس له تأثير غير محدد من الرنا المزدوج الجديلة أو نتيجة لإجراءات الحقن (مثل الضرر الناجم عن طريق الحقن، أو شذوذ من التخدير بالأثير). حقن الرنا المزدوج الجديلة استهداف EYFP يمكن أن تكون بمثابةمراقبة إيجابية جيدة عند استخدام سلالة ^5،7 بو-11. عندما يتم حقن الرنا المزدوج الجديلة EYFP في مرحلة اليرقات الماضية، انخفاضا كبيرا في إشارة EYFP في الجناح براعم المستقبل يمكن ملاحظتها في وقت مبكر من يوم واحد حقن آخر (الشكل 3A). ضربة قاضية من EYFP كاملة بعد يومين من الحقن EYFP الرنا المزدوج الجديلة (الشكل 3B) واستمرت هذه ضربة قاضية من خلال (3C أرقام و 3D) طور العذراء وطوال حياة خنفساء إذا كان تركيز الرنا المزدوج الجديلة مرتفع بما يكفي (مثل 1 ميكروغرام / ميكرولتر) ^7. يمكن أيضا EYFP الرنا المزدوج الجديلة استخدامها كعنصر تحكم السلبية كما هو تسلسل الجينات غير الذاتية، وينبغي ألا تسبب اضطرابات المورفولوجية والفسيولوجية (أرقام 3A-3D).

قدمنا ​​الصور من اليرقات رني لرمزي (VG)، جين الجناح النقدي ^12، ومثال آخر على كيفية EFfective هذه التقنية رني القائم على الحقن هي في T. كاستانيم. عندما يتم حقن الرنا المزدوج الجديلة لVG قبل الأخيرة في مرحلة اليرقات (مرحلة واحدة قبل مرحلة اليرقات مشاركة)، وفقدان كامل للهياكل الجناح يمكن ملاحظتها في طور العذراء (أرقام 3E و3F). الكبار مما أدى أيضا يفتقر تماما الهياكل الجناح (الأرقام الجيل الثالث 3G و3H). نتيجة رني لVG تجسد كلا متانة وطبيعة نظامية من رني في T. كاستانيم.

الشكل 1: (A) أمثلة على الإبر متواصلة، جيدة، وأخرى سيئة (B) غيض من إبرة مكسورة جيدة جيدا (C) غيض من إبرة مكسورة كبير جدا وصريحا (D) غيض.. لكسر ن هذا هو إبرة رقيقة جدا. أشرطة النطاق (الأحمر) هي 0.05 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:. (A) والحجم بشكل صحيح حقن إبرة إدراجها في الطور مشاركة يرقة (B) اليرقة حقن مناسب مع الحل الرنا المزدوج الجديلة الأخضر (C) تجاوز من الحل الرنا المزدوج الجديلة عند نقطة الحقن التي يسببها الإفراط في الحقن (D ) إبرة رقيقة فشله في اختراق إهاب اليرقات. (E) إبرة حقن كبيرة إدراجها في الطور مشاركة يرقة. (F) اليرقة حقن بإبرة كبيرة، مما أدى إلى فيضان وتسرب من الحل الرنا المزدوج الجديلة. تبين الأسهم الإبر.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: أمثلة من رني ناجحة في T. كاستانيم. (AD) حقن اليرقات آخر نتائج EYFP الرنا المزدوج الجديلة في الحد من EYFP التعبير. (A) يرقات يوم واحد بعد الحقن. (B) اليرقات بعد يومين من الحقن. (C) مراقبة الشرانق. (D) شرانق الناتجة عن اليرقات EYFP حقن الرنا المزدوج الجديلة. الضوابط السلبية هي عازلة حقن (A، B) وdsRed حقن الرنا المزدوج الجديلة (C، D). النصال والسهام تشير EYFP التعبير أو عدم وجودها في براعم الجناح والعينين، على التوالي. (EH) القلمفي نهاية المطاف اليرقات رني لVG. (E) من نوع البرية خادرة. (F) VG رني خادرة. عدم وجود هياكل الجناح مرئيا بالفعل في مرحلة العذراء (السهم). G) من نوع البرية الكبار. (H) VG رني الكبار. الجناح الهياكل ذات الصلة مفقودة تماما (السهم). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هناك عدد من القضايا الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار لضمان نجاح رني، بما في ذلك طول وتركيز جزيئات الرنا المزدوج الجديلة، والمنافسة بين جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة (عند محاولة متعددة نهدم)، وإمكانية خارج الهدف آثار (OTE).

طول الرنا المزدوج الجديلة

طول جزيئات الرنا المزدوج الجديلة يؤثر على كفاءة الاستجابة النظامية رني، مع الرنا المزدوج الجديلة أطول كونها أكثر كفاءة لتحريك رني ^7،14،15 (على الرغم من أن الحد أطول من الرنا المزدوج الجديلة غير معروف حاليا). طول الرنا المزدوج الجديلة يجب أن يكون أطول من 50 نقطة للحث على فعالية رني في T. كاستانيم ^7. الرنا المزدوج الجديلة بين 150 نقطة أساس و 500 نقطة أساس على ما يبدو مثاليا للتجارب رني. على الرغم من أن جزيئات الرنا المزدوج الجديلة أطول يمكن أن تستخدم أيضا، سيكون لديهم فرصة زيادة OTE وخطوة استنساخ الجين سوف يصبح من الصعب على نحو متزايد.

الرنا المزدوج الجديلة تركيز

ve_content "> درجات مختلفة من ضربة قاضية الجينات يمكن أن يتحقق اعتمادا على تركيز الرنا المزدوج الجديلة. 1 ميكروغرام / ميكرولتر يبدو أن تركيز انطلاق معقولة، والتي غالبا ما تنتج النمط الظاهري شبه فارغة (قد تختلف اعتمادا على الجينات (ق) من الفائدة ). رني لا يمكن أن يؤديها مع تركيز أعلى (على سبيل المثال، 7-8 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على النمط الظاهري رني أقوى. رني مع التخفيف التسلسلي الرنا المزدوج الجديلة يمكن أن تكون أحيانا مفيدة لإنتاج سلسلة من الظواهر hypomorphic (التكميلي بيانات توموياسو وآخرون 2009 ^8، وبوراس-كاستلز بيانات غير منشورة).

رني المنافسة

ضربة قاضية متعددة الجينات يمكن أن يتحقق في T. كاستانيم عن طريق حقن جزيئات الرنا المزدوج الجديلة عدة مختلفة في نفس الوقت. ومع ذلك، فمن المعروف أيضا أن وجود عدة جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة موجودة داخل الكائن الحي غالبا ما يؤدي إلى المنافسة بين dsRNAs للوصول إلى مكونات رني 7،14. من المهم استخدام نفس الطول ونفس التركيز لجميع الرنا المزدوج الجديلة عند محاولة متعددة الجينات لتجنب ضربة قاضية الرنا المزدوج الجديلة واحد خارج المنافسة الآخرين (على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة لإجراء مزيد من التعديلات على طول الرنا المزدوج الجديلة والتركيز عند مستويات التعبير تختلف بشكل كبير بين الجينات المستهدفة). نحن، فضلا عن غيرهم، أجرت بنجاح ضربة قاضية مزدوجة وثلاثية (على سبيل المثال، توموياسو وآخرون 2005 ^16، توموياسو وآخرون 2009 ^17، ويانغ وآخرون 2009 ^18). على الرغم من ذلك ممكنا، الرباعي رني (أو أكثر) قد تكون صعبة، لأنه من المحتمل أن يسبب انخفاض كبير في كفاءة رني لجميع الجينات الأربعة المستهدفة.

حالا تستهدف

OTE هو القلق المتأصل للنهج القائم رني. طريقة واحدة للحد من OTE في تحديد المناطق المستهدفة في الجينات التي تشترك تسلسل مماثلة مع جينات أخرى وتجنب هذه المناطق عند تصميم الرنا المزدوج الجديلة. تحليل بسيط BLAST ضد T. كاستانيم توقع مجموعة الجينات يمكن التعرف على هذه المناطق. العديد من الأدوات على الانترنت تسمح أيضا تقييم OTE المحتملين (مثل E-رني ^19). أداء رني لمنطقتين غير متداخلة من الجين المستهدف هو وسيلة سهلة وفعالة للقضاء على احتمال تلك التي لوحظت هي سبب الظواهر التي OTE. يتم التقليل من إمكانية OTE إذا رني لمنطقتين غير متداخلة تنتج نفس الظواهر (ما لم تشترك في المنطقتين غير متداخلة تسلسل مماثل).

تقييم الجينات ضربة قاضية بوسائل غير المظهرية يحلل غالبا ما يكون حاسما في البيانات المتعلقة رني الحالية بشكل فعال. بطريقتين رئيسيتين لتقييم ضربة قاضية الجينات هي QRT-PCR وتحليل لطخة الغربي. QRT-PCR هو وسيلة مريحة لقياس مستوى مرنا الهدف، واستخدمت في العديد من الدراسات المتعلقة رني بما في ذلك تلك الموجودة في T. كاستانيم (انظر ميلر وآخرون 2012 ⁷ على سبيل المثال). Howevإيه، ويجب اتخاذ الحذر، كما رأينا مؤخرا بعض الحالات التي يكون فيها مستوى مرنا الهدف بواسطة رني التنظيم حتى (على الرغم من أن المنتج هو بروتين ينظم أسفل) (بوراس-كاستلز بيانات غير منشورة). ومن غير المعروف حاليا ما إذا كان هذا مرنا رني الناجم عن التنظيم يمكن أن يكون واسع النطاق أو فريدة من نوعها لجينات معينة. تحليل لطخة الغربي هو طريقة أخرى لتأكيد ضربة قاضية الجين. هذه الطريقة غير موثوق بها تماما كما أنه يقيس كمية من البروتين المنتج النهائي. اشتراط وجود الأجسام المضادة المحددة ضد البروتين المنتج من الجين المستهدف هو الجانب السلبي لهذا النهج. وباستخدام قياسات مستقلة متعددة بالإضافة إلى تحليل المظهري زيادة ثقة البيانات المظهرية التي حصل عليها التحليل القائم رني.

منذ بدايته في T. كاستانيم، وقد استخدمت في المقام الأول رني لدراسة وظيفة الجين في التنمية وتشكيل نمط. هذه T. وكانت دراسات التنموية كاستانيم ناجحة للغاية في characterizing الوظائف المحفوظة تطويريا وتباعدت من الجينات (مراجعة في دينيل 2008 ¹ وKlingler و2004 ^2). دراسات ومع ذلك، استنادا رني في T. كاستانيم لا تقتصر على البيولوجيا التطورية. على سبيل المثال، رني يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجين في مجموعة واسعة من الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية، بما في ذلك التسامح الإجهاد، والافتراس والعدوان، واختيار رفيقة، وأنماط النشاط، وآليات الدفاع.

واحد صعوبة تطبيق رني إلى هذه السياقات هي احتمالات الآثار عديد المظاهر. في كثير من الأحيان، فإن جينات الفائدة لديها مجموعة متنوعة من الأدوار في جميع أنحاء T. كاستانيم دورة الحياة، مما يجعل إزالة الجينات من دون آثار المظهري غير مقصودة الصعبة. ومع ذلك، فإن القدرة على أداء بسهولة رني في مجموعة متنوعة من المراحل يمكن أن يكون في كثير من الأحيان استراتيجية فعالة لتجنب هذه الآثار عديد المظاهر. على سبيل المثال، وأداء رني في البالغين بدلا من اليرقات أو العذارى قد تسمح لنا بالتغلب على عزيزمالت الفتك الناجمة عن ضربة قاضية الجين خلال النمو المبكر. المرونة للاستجابة رني في T. كاستانيم مما يجعل هذا الطراز خيارا جذابا للتكيف رني إلى تجارب من وظيفة الجين في الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية.

ت. نظام كاستانيم هو أيضا مثالية للاستخدام في مختبر التدريس. T. كاستانيم يمكن تربيتها بسهولة على الدقيق / خليط الخميرة في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) دون subculturing المتكرر، وتقنيات رني في T. كاستانيم بسيطة بما فيه الكفاية لأن تتكيف مع مختبر مع الشباب والعلماء التعلم. كما رني أصبح تقنية أساسية في مجموعة متنوعة من المجالات البيولوجية، فمن الأهمية بمكان أن يتعرض الطلاب لهذه التقنية. طبيعة مستقيم الى الامام لتقنية رني اليرقات في T. يشجع كاستانيم أيضا المزيد من الطلاب للمشاركة في البحوث، مما يجعل T. كاستانيم مرشح رئيس لالفصول الدراسية الموجهة للنظام وراثي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Organic whole wheat flour	Heartland Mill Inc. Kansas	G1
Brewer’s yeast	MP Biomedicals	2903312	Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles	Fisher Scientific	11-888
Sieve	Fisher Scientific	04-881N	8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults.
Sieve	Fisher Scientific	04 881 10P	8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver	Fisher Scientific	04-866B	8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan	Seedburo Equipment Co.	Model 33	collection pan
Incubator	BioCold Environmental Inc	BC26-IN	Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374500
NaH2PO4	Fisher Scientific	S397-500
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Food dye	Kroger		green, blue, or red preferable
Microscope glass slide	Fisher Scientific	22-038-103
Tack-It Over&Over	Aleene's		Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case	Amazon
Boroslilicate glass capillary	Sutter Instrument	BF100-50-15	O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller	Sutter Instrument	P-87 or P-97
Removable mounting putty	Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster	OfficeMax	OM96091
Forceps	Fine Science Tool	11231-30	Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps	Fine Science Tool	11252-20	INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous	Fisher Scientific	E138-500
Nylon mesh	Flystuff/Genessee Scientific	57-102	120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml	VWR	89000-926
Stereomicroscope	Zeiss		SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope	Fisher/Zeiss	12-070-513	Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage	Zeiss	4354600000000000
X-Y mechanical stage	Microscopenet.com	A512	Inexpensive alternative
Manipulator	Narishige	M-152
Magnetic stand	Narishige	GJ-1
Glass capillary holder	Narishige	IM-H1
30 ml Disposable syringe	BD syringe	309650	BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock	Cole-Parmer Instrument Co.	EW-30600-03	Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush	Amazon	Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece	Any general paint brush will work.