شريحة ساخنة: الكبار الدماغ الحاد في درجة الحرارة الفسيولوجية التقطيع

Summary

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Abstract

هنا نقدم بروتوكول لإعداد شرائح الدماغ الحادة. هذا الإجراء هو عنصر حاسم للتجارب الكهربية التصحيح، المشبك الذي يحدد إلى حد كبير على نوعية النتائج. وقد تبين أن إهمال خطوة التبريد أثناء إجراء خفض مفيد في الحصول على شرائح السليمة والخلايا، وخاصة عند التعامل مع الهياكل الدماغ مياليني للغاية من الحيوانات الناضجة. على الرغم من أن الآلية الدقيقة حيث تدعم درجة حرارة مرتفعة لا يمكن تكهن على الصحة العصبية، فإنه من المعقول أنه كلما أمكن، يجب أن تكون درجة الحرارة التي يتم فيها إجراء تشريح قريبة من الظروف الفسيولوجية لمنع التحف درجات الحرارة ذات الصلة. وثمة ميزة أخرى مهمة لهذه الطريقة هي بساطة الإجراء، وبالتالي فإن الوقت اللازم لإعداد قصيرة. في طريقة أثبتت تستخدم الفئران البالغين ولكن يمكن تطبيق نفس الإجراء مع الفئران الأصغر سنا وكذلك الفئران. أيضا، فإن البنود التالية التصحيحيتم تنفيذ التجربة أمبير على شرائح أفقية للدماغ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم نفس الإجراء في الطائرات الأخرى، وكذلك المناطق الخلفية أخرى من الدماغ.

Introduction

والهدف من هذه الطريقة هو الحصول على عرض ذات جودة عالية شرائح الدماغ الحادة في المختبر لتجارب الكهربية، خاصة عند استخدام البالغين أو حتى الحيوانات القديمة.

طريقة الحاد تشريح الدماغ، كما وصفها Skrede وWestgaard ¹ في جملتين أنيقة، وأصبحت واحدة من أسس علم الأعصاب الحديث الأبحاث ويعمل في الاختلافات التي لا حصر لها في جميع أنحاء العالم. وينعكس على نوعية الشرائح في عدد الخلايا العصبية في شريحة الحية، والفترة الزمنية التي تبقي الخلايا الكهربية وخصائصها المورفولوجية وكذلك في سلامة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإن المدة القصوى للتسجيلات مستقرة تعتمد على نوعية الشرائح. وبالتالي، على طول العقود، وطريقة التقطيع الأصلي تم تطويرها من قبل مجموعات بحثية فردية لتعزيز الانتعاش بعد قطع شريحة ^10/02، في كثير من الأحيان التعديلات المعقدة لتشكيل قطع سحلول التعافي ص (مثل إضافة أسكوربات، ثيوريا أو حتى H ₂ O ₂₎ وكذلك داخل القلب قبل نضح من الحيوان مع حلول تبريد الفسيولوجية.

كما ثبت مؤخرا ^11، ويبدو أن درجة حرارة الفسيولوجية أثناء التقطيع لتكون أكثر فائدة من التبريد لصحة الخلايا العصبية. التحسن هو الأكثر لفتا عند العمل مع الكبار (2-8 أشهر) القوارض. تجنب التغيرات في درجات الحرارة مثيرة يمنع القطع الأثرية بسبب العمليات التي تعتمد على درجة الحرارة في الخلايا، مثل اللدونة ¹³ و ايون قنوات حركية ^13،14. مثل هذه التغييرات يمكن أن تؤثر على غشاء الجهد وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا، عتبة السنبلة، وسنبلة الشكل.

و"الساخنة" طريقة إعداد شريحة الحادة المقدمة هنا هو إجراء عام للحصول على جودة عالية شرائح الدماغ الحادة من أي منطقة في الدماغ، بما في المخيخ والقشرة والحصين، الدماغ نوى ^{16 <}/ سوب> وكذلك البصلة الشمية، سواء في الجرذان والفئران.

خصوصا، يتطلب إجراء تشريح درجة حرارة الفسيولوجية التي شفرة قطع يهتز تقريبا تماما أفقيا وهي دون أي عيوب هيكلية. هذه الدقة قد لا يكون ممكن مع النماذج القديمة تقطيع اللحم. في مثل هذه الحالات، ونحن ننصح أداء إعداد شريحة في ظروف البرد القارص كما يبدو على درجة حرارة منخفضة لجعل النسيج أكثر مقاومة للأضرار الميكانيكية، حتى لو كان على حساب الانحرافات الأيضية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوان في الجامعة العبرية واللجنة الاستخدام.

1. إعداد حلول وأدوات التقطيع

1. تحضير 1 لتر من محلول فسيولوجي القياسي (SPS) التي تحتوي على أيونات وصفها في الجدول 1.
   1. إعداد المحلول الذي يحتوي على الأملاح في 10 أضعاف التركيز النهائي مقدما في زجاجة مملوءة تخزين 1000 مل من الماء منزوع الأيونات (تصرف من 0.055 ميكرو ثانية / سم). إضافة الأملاح (كلوريد الصوديوم، بوكل، KH ₂ PO _4، وMgSO _4)، ويقلب حتى يذوب تماما. تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية.
   2. جعل الحل النهائي SPS يوم التجربة. إضافة 100 مل من المحلول الى 700 مل من الماء النقي، ويحل الجلوكوز (3.6 غرام) وNaHCO ₃ (2.18 ز) باستخدام شريط مغناطيسي ومن ثم إضافة الماء النقي يصل إلى 1 L.
   3. تتوازن solutiعلى طريق بالغاز مع 95٪ O _05/02٪ CO ₂ ل~ 20 دقيقة. بعد هذا، إضافة 2 مل من 1 M CaCl ₂ الحل.
2. تجميع الأدوات التالية (الشكل 1).
   1. اعداد كبيرة مقص أو أداة أخرى لقطع الرأس، مقص جراحي صغيرة لفتح الجمجمة، ملقط غيض غرامة لرفع الجمجمة لفضح الدماغ، مع شفرة مشرط لتشريح الجزء المطلوب من الدماغ إلى أن شرائح وملعقة صغيرة عن التلاعب أجزاء الدماغ تشريح.
   2. بالإضافة إلى ذلك، إعداد قطع صغيرة من ورق الترشيح لإزالة السوائل الزائدة من الدماغ، واثنين من أطباق بتري صغيرة للدماغ ليتم تشريح في اثنين من زجاج 500 مل الأكواب لاحتواء درجة حرارة المياه النقية والصحة والصحة النباتية، والغراء cyanoacrylate لعلامة الدماغ ل مرحلة التقطيع.
   3. إعداد فرشاة صغيرة للتعامل مع شرائح خلال تشريح واسعة الفم ماصة باستير الزجاج لتحريك شرائح من الحمام تشريح للتشا الانتعاشmber. تطهير الأدوات اللازمة لمنع نمو البكتيريا في الحمامات شريحة الدافئة. وعلاوة على ذلك، استخدم قفازات المختبر نظيفة.
3. إعداد المغمورة شريحة انتعاش هذه الغرفة كما وصفها جيب وادواردز ^15. الغاز باستمرار SPS في ذلك مع 95٪ O _2/5٪ CO ₂ والحفاظ على 36 درجة مئوية. تأكد من أن استخدام الاسلحة الكيماوية لا تؤدي إلى فقاعات صغيرة المحاصرين في الحمام التي يمكن أن تلحق الضرر شرائح.
4. دافئة ~ 300 مل من SPS إلى 36 درجة مئوية على طبق من سخان مع محرك مغناطيسي أو في حمام مائي. إذا تم استخدام لوحة سخان، ورعاية لمنع الحل من ارتفاع درجة الحرارة، مما قد يتسبب في هطول أيون. في حال حدوثه، SPS العذبة الدافئة بدلا من التبريد القديم.
5. جلب ~ 500 مل من الماء النقي لغلي باستخدام غلاية كهربائية و، في كوب، والجمع بين 300 مل من الماء البارد مع الحصول على المياه الدافئة قليلا من درجة حرارة تشريح. استخدام هذا ارتفعت درجة حرارة الماء النقي خلال قطع الرأس واستخدام remaiنينغ من الماء المغلي لاحقا للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية للحمام تشريح.
6. تخدير الماوس عن طريق حقن 0.1 مل من بنتوباربيتال (60 ملغ / مل) البريتونى. بعد بضع دقائق تحقق من أن الحيوان لا يستجيب إلى أخمص القدمين قوية أو القرصات الذيل للتأكد من عدم وجود الإحساس.

2. تشريح الدماغ

1. قطع رأس الماوس بسرعة عن طريق قطع الرقبة مع مقص كبير بالقرب من الجزء الخلفي من الجمجمة، والسماح للرئيس الوقوع في الكأس مع درجة حرارة الماء النقي لشطف قبالة الدم الزائد.
2. فضح ماغنوم الثقبة في الجمجمة تحت الجلد وعضلات الرقبة، وربما إزالة أكثر من الرقبة مع مقص صغير.
3. سحب الجلد في الجزء العلوي من الجمجمة ليكون قادرا على رؤية واضحة الغرز الجمجمة من أجل توجيه فتح الجمجمة.
4. قطع الجمجمة مفتوحة عن طريق إدخال طرف السفلي من مقص صغير خلال الثقبة ماغنوم وعلى الفور تحويلها نحوالجانب الوحشي. خفض بلطف على طول الحافة الجانبية للعظم الجداري تصل إلى موقع خلف العينين وخياطة الجبهي الجداري. بعد ذلك، تتجه نحو وسط الجمجمة وتتقاطع مع خط الوسط إلى الجانب الآخر من الجمجمة (انظر خط متقطع الأخضر في الشكل 2A).
5. باستخدام ملقط غيض غرامة، ورفع الجمجمة من الزاوية الجبهي الجداري وتسحبه قطريا يصل وللجوانب لفضح الدماغ (انظر السهم الأصفر متقطع في الشكل 2A). تأكد من أن لا يتم إرفاق الجمجمة إلى أي عظم أو جلد الرأس، حتى أن الدماغ ستبقى في مكانها عندما يتم رفع الجمجمة. في حالة أن الدماغ تتحرك مع الجمجمة، استخدم مقص صغير لإزالة أي نوع من الأنسجة الضامة بين الجمجمة والدماغ.
6. عندما يتعرض الدماغ، لا تسمح للدماغ لتكون جافة. وبالتالي، تنفيذ الخطوات القادمة مع الحفاظ على الجمجمة والدماغ في طبق بيتري مليئة تحسنت، بالغاز الصحة والصحة النباتية.
7. فصل جزء من الدماغ يستخدم للبريدxperiment عن بقية الدماغ باستخدام مشرط وملعقة. في حالة استخدام المخيخ، فصل من الدماغ الأمامي عن طريق قطع واحد من خلال المخ الأوسط والقنطرة (على طول الخطوط الحمراء في أرقام 2B-D) ونقلها إلى طبق بتري صغيرة تحتوي طازجة، بالغاز الصحة والصحة النباتية.
8. إزالة الدماغ لتشكيل قاعدة واسعة ومستقيمة لعلامة الدماغ لقطع مرحلة عند تشريح المخيخ في المستوى الأفقي. وضع لفترة وجيزة المخيخ على قطعة مبللة من ورق الترشيح بحيث الجانب التي قطعت من الدماغ الأمامي لأسفل.
   1. قطع جذع الدماغ مع مشرط لتشكيل قاعدة (كما هو مبين مع الخط الأزرق في الشكل 2B)، والمخيخ العودة إلى الصحة والصحة النباتية. عندما تكون هناك حاجة طائرات أخرى من قطع، وتقليم كتلة المخيخ وفقا لذلك (الخطوط الزرقاء في الشكلين 2C & D).

3. تشريح الدماغ

1. إعداد مرحلة قطع طريق التأكد من أنه هو Dراي، قبل تطبيق قطرة صغيرة من superglue في منتصف المرحلة.
2. رفع كتلة الدماغ من SPS باستخدام ملعقة مع الجانب الصحيح حتى، وإزالة أي السائل الزائد من المخ باستخدام قطع صغيرة من ورق الترشيح. ثم، مع حركة واحدة، مرر الدماغ من ملعقة على قطرة من الغراء على المسرح.
3. لمنع الدماغ من الجفاف والغراء من الترشح حتى على الجانبين من الأنسجة، وتطبيق بضع قطرات من SPS مع ماصة باستور ووضع مرحلة القطع في غرفة تشريح. محاذاة كتلة الدماغ بحيث المناطق ذات الاهتمام (مثل قشرة المخيخ) تواجه النصل وبالتالي سيتعرض لأقل قدر من الضغوط الميكانيكية قبل شرائح.
4. تقطع كل شريحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حين بالغاز باستمرار SPS في غرفة القطع وكذلك الحفاظ على درجة حرارة 34-37 درجة مئوية. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة القطع في هذا النطاق عن طريق ملء خارجيآل غرفة من تقطيع اللحم مع درجة حرارة المياه النقية واستبدال الماء كلما تنخفض درجة الحرارة منخفضة جدا.
   ملاحظة: المعلمات تشريح يجب التوصل تجريبيا لكل نوع من الأنسجة والخلايا العصبية التي يجري بحثها. في حالة كامبدين SMZ 700 تقطيع اللحم مع شفرات السيراميك وخلايا المخيخ جولجي، استخدم 0.75 ملم سعة الاهتزاز عند 65 هرتز وتقدم سرعة 0.05 ملم / ثانية؛ عن الخلايا العصبية للدماغ أعلى النووية السعة والتردد (1 ملم و 90 هرتز، على التوالي)، وأبطأ سرعة مقدما (0،01-0،02 مم / ثانية) والموصى بها. لكل من جولجي والخلايا العصبية للدماغ النووية، يجب أن يكون سمك شريحة 300 ميكرون.
5. أثناء تشريح، لا تسمح لشرائح أضعاف على أنفسهم. منع هذا من خلال دعم لهم بلطف مع فرشاة ناعمة، ويفضل لمس شريحة فقط في المناطق التي ليست من مصلحة للتجربة. الحرص على منع الفرشاة من لمس النصل vibratome. خصوصا في حالة من ريش السيراميك، وحتى الاتصال خفيفةيمكن أن يتلف النصل.
6. نقل كل شريحة من غرفة التشريح إلى انتعاش / عقد الغرفة باستخدام واسعة الفم، الزجاج المصقول النار ماصة باستير.
7. السماح للشرائح الراحة في غرفة لا يقل عن 1 ساعة قبل بدء التجربة. وهذا يسمح لتدهور تلف أو موت الأنسجة والخلايا ويؤدي إلى سطح شريحة أنظف الآن. خلال الساعة الأولى، والحفاظ على درجة حرارة SPS في غرفة في حدود 34-36 درجة مئوية. تأكد من أن الشرائح التي لم تطرق من قبل فقاعات الهواء التي يمكن أن تلحق الضرر شرائح أو جعلها تطفو.

4. تجربة

1. بعد 1 ساعة، والسماح للحرارة غرفة الإنعاش يبرد لRT (17-25 درجة مئوية).
   ملاحظة: هذا قد يطيل الفترة الزمنية التي شرائح يمكن استخدامها من قبل تباطؤ نمو البكتيريا وكذلك الأيض الخلوي. هذه الفترة تعتمد على منطقة الدماغ ونوع الخلية. على سبيل المثال، وأنواع معينة من الخلايا جولجي يمكن العثور عليها لتكون صحية في شرائح8 ساعة بعد قطع أنواع أخرى في حين تستمر سوى 6 ساعة.
2. بعد 1 ساعة مرت من التقطيع، واستخدام شرائح لمختلف التجارب الكهربية.

النتائج

شرائح أعدت على النحو المبين يمكن استخدامها لمختلف التجارب الكهربية وoptogenetic. في الشكل 3A و 3C، وتبين لنا نموذجا تمثيليا من شريحة المخيخ الأفقية وشريحة القشرية الدماغية الاكليلية، على التوالي، ينظر تحت تدخل الفرق (DIC) البصريات. في شريحة المخيخ، عدة ?...

Discussion

نحن لشرح طريقة لإعداد شرائح الدماغ الحادة من الفئران في الفسيولوجية بدلا من درجة حرارة الجليد الباردة.

فقد تبين أن ¹¹ نوعية الشرائح التي تم الحصول عليها في الظروف الحارة متفوقة بالمقارنة مع تلك التي أعدت مع الظروف الباردة، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentobarbital	CTS	170066	Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.
Big scissors	FST	14001-16	Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation
Iris scissors	Prestige medical	48,148	Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm
Fine tip forceps	FST	11254-20
Scalpel	FST	91003-12
Scalpel blade #11	FST	10011-00
Small spatula	Fisher	2350
Filter paper			Any laboratory brand can be used.
Petri dishes	Duroplan	Z231509-1
Glass beakers	SCHOT	10022846
Pasteur pipette	Maple Leaf Brand	14672-029
Super glue	LOCTITE	4091361/1
Slicer	Campden	7000-smz
Ceramic slicing blade	Campden	7550-1-C
Magnetic heater/stirrer			For heating up the SPS for the procedure
Electric kettle			For heating up water for temperature control
Slice recovery chamber + heating unit	Warner instruments	BSC-HT +  BSC-BUW	Home-built models may also be used.
Thermometer			For monitoring SPS temperature during dissection and slicing