Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Özet

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Özet

Burada akut beyin dilimleri hazırlanması için bir protokol mevcut. Bu prosedür büyük ölçüde sonuçların kalitesini belirler elektrofizyolojik yama-kelepçe deneyler için kritik bir unsurdur. Bu prosedür kesme sırasında soğutma aşamasının atlanması yetişkin hayvanlarda yüksek ölçüde miyeline beyin yapıları ile ilgili, özellikle, sağlıklı dilimleri ve hücreler elde etmek yararlı olduğu gösterilmiştir. Yüksek sıcaklık sadece üzerine speküle edilebilir sinir sağlığını destekler bu sayede kesin mekanizması, bu nedenle duruyor olsa da, mümkün, dilimleme gerçekleştirildiği sıcaklık sıcaklık ilgili eserler önlemek için fizyolojik koşullara yakın olmalıdır. Bu yöntemin bir diğer önemli avantajı, işlemin basitlik ve dolayısıyla kısa hazırlık zamanı. Gösterilen yöntemde, yetişkin fareler kullanılmaktadır ancak aynı prosedür genç farelerde hem de sıçanlarda ile uygulanabilir. Ayrıca, aşağıdaki yama clCo. deney yatay serebellar dilimler üzerinde gerçekleştirilir, fakat aynı prosedür, aynı zamanda, başka düzlemlerde gibi beynin diğer arka alanlarda kullanılabilir.

Giriş

Yöntemin amacı, özellikle yetişkin hatta yaşlı hayvanları kullanarak, in vitro elektrofizyolojik deneyler için yüksek kaliteli akut beyin dilimleri elde etmektir.

İki şık cümle içinde Skrede ve Westgaard ¹ ile anlatıldığı gibi akut beyin dilimleme yöntemi, modern sinirbilim araştırma temellerinden biri haline gelmiştir ve dünya çapında sayısız varyasyonları kullanılmaktadır. Dilimlerinin kalitesi dilim başına canlı nöronlar arasında sayısı tarafından yansıtılır, zaman süresi sırasında, hücreler dokularının bütünlüğünün yanı sıra bunların elektrofizyolojik ve morfolojik özelliklerini korurlar. Ayrıca, sabit bir kayıt için maksimum süresi dilimlerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, on boyunca, orijinal dilimleme yöntem ayrıca kesme bileşimin kompleksi modifikasyonları ile, genellikle ^2-10, kesme sonrası bir dilim iyileşmeyi geliştirmek için tek tek grup tarafından geliştirilen O edilmiştirgibi soğutulmuş fizyolojik çözelti ile hayvanın kalp içi ön-perfüzyon (örneğin askorbat, thiourea ya da _{H2O 2} ekleme gibi) r-kurtarma çözümleri.

Son zamanlarda ¹¹ Görüldüğü gibi, dilimleme sırasında fizyolojik sıcaklık nöronal sağlığı için soğutma daha yararlı gibi görünüyor; yetişkin (2-8 ay) kemirgenler ile çalışırken gelişme en çarpıcı. Büyük ısı değişiklikleri kaçınma nedeni, plastiklik ¹³ ve iyon kanalları kinetiği ^13,14 gibi hücrelerde sıcaklığa bağlı süreçler, eserler önler. Bu tür değişiklikler membran voltaj ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon, başak eşiğini etkileyen ve şekil artabilir.

Burada sunulan "sıcak" akut dilim hazırlama yöntemi, herhangi bir beyin bölgesinden yüksek kaliteli akut beyin dilimleri elde beyincik, korteks ve hipokampus, beyin sapı ¹⁶ çekirdeklerin dahil olmak üzere genel bir prosedürdür ^</ Sup> yanı koku ampul gibi, hem sıçan ve farelerde.

Özellikle, fizyolojik sıcaklık dilimleme işlemi kesme bıçağı neredeyse mükemmel yatay titreşir ve herhangi bir yapısal kusurları olmaksızın olmasını gerektirir. Böyle hassas eski dilimleme makinesi modelleri ile ulaşılabilir olmayabilir; düşük sıcaklık metabolik sapmaları pahasına olsa bile, mekanik hasarlara karşı doku daha dirençli hale getirmek için görünüyor gibi durumlarda, biz Dondurucu soğuk koşullarda dilim hazırlık yapmak öneririz.

Protokol

Bu protokol açıklanan tüm deneysel prosedürleri İbrani Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Dilimle için Çözümler ve Araçlar hazırlama

1. Tablo 1 'de tarif edilen iyonu içeren standart bir fizyolojik çözelti (SPS) 1 L hazırlayın.
   1. Iyonu giderilmiş su (0.055 uS / cm'lik iletkenlik) 1000 ml ile dolu bir depolama cam şişe içinde önceden 10 kat nihai konsantrasyonda tuzlarını ihtiva eden bir stok çözelti hazırlayın. Tuzlar (NaCI, KCI, KH ₂ PO ₄ ve MgSO ₄₎ ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın. 4 ° C 'de stok solüsyonu saklayın.
   2. Deney gününde, nihai SPS çözeltisi olun. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanılarak glikoz (3.6 g) ve _NaHCO3 (2.18 g) çözülür, saflaştınlmış su, 700 ml stok çözeltisi, 100 ml ilave edilir ve daha sonra 1 L üzere saflaştırılmış kadar su ekle
   3. Soluti dengeleyin~ üzerinde 20 dakika süreyle% 95 O ₂ /% 5 CO _{2 ile} bunu soluyarak. Bundan sonra, 1 M _CaCI2 çözeltisi 2 ml ilave ediniz.
2. Aşağıdaki araçları (Şekil 1) birleştirin.
   1. Kafatasını açmak için büyük makas veya başları kesilerek başka bir araç, küçük cerrahi makas hazırlayın, beyin maruz beynin istenilen bölümünü diseksiyon için bıçak ile neşter kafatası kaldırılması için ince uçlu forseps dilimlenmiş ve işlenmesi için küçük bir spatula edilecek disseke beyin parçaları.
   2. Buna ek olarak, beyin fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı küçük parçalar halinde hazırlanması, beyin için iki küçük Petri kapları için beyne yapıştırma ihtiva eden ısıtılmış saf su ve SPS ve siyanoakrilat yapıştırıcı için iki cam, 500 ml'lik çanaklar içinde disseke dilimleme sahne.
   3. Dilimleme ve kurtarma cha için dilimleme banyodan dilimleri hareket için geniş ağızlı cam Pasteur pipet sırasında dilimleri işlemek için küçük bir fırça hazırlayınmber. Sıcak dilim banyolarında bakteri üremesini engellemek için araçlarını dezenfekte edin. Ayrıca, temiz laboratuvar eldiven kullanın.
3. Gibbs ve Edwards ¹⁵ tarafından tarif edildiği gibi bir yarı-kesit geri bölmesini hazırlayın. Sürekli% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile o SPS gaz ve 36 ° C'de tutmak. Gazlaştırma dilimleri zarar verebilir banyosu içinde sıkışıp küçük kabarcıklar ile sonuçlanmaz emin olun.
4. Sıcak ~ Manyetik karıştırıcı ile ya da bir su banyosu içinde bir ısıtıcı plaka üzerinde 36 ° C'ye kadar, SPS ve 300 mi. Bir ısıtıcı plaka kullanılırsa, iyon tortulaşması neden olabilir aşırı ısınmaya karşı çözüm önlemek için dikkat edin. Durumda, yerine eski bir soğutma sıcak taze SPS olur.
5. Bir elektrikli su ısıtıcısı ile kaynatmak için saflaştırılmış su yaklaşık 500 ml getirmek ve bir beher içinde, dilimleme sıcaklığından biraz daha sıcak su elde etmek için soğuk suyla, 300 ml birleştirir. Bu, başı kesilerek sırasında saf su ısıtıldı kullanın remai kullanımıDaha sonra dilimleme banyonun fizyolojik sıcaklığı korumak için kaynamış su vaziyette.
6. Intraperitoneal pentobarbital 0.1 ml (60 mg / ml) enjekte edilerek fare anestezi uygulayın. Birkaç dakika sonra hayvan duyu eksikliği tespit etmek için güçlü parmak veya kuyruk tutam yanıt vermez emin olun.

2. Beyin Diseksiyon

1. Kafatasının arka yanında büyük makas ile boyun kesme hızlı bir şekilde fare başını kesmek ve kafa aşırı kan durulayın ısıtıldı saflaştırılmış su ile beher içine akmasına izin verdi.
2. Belki küçük bir makas ile boyun daha kaldırarak, boyun kasları ve cilt altında kafatasında foramen magnum Açığa.
3. Açıkça kafatasının açılmasına rehberlik etmek amacıyla kafatası sütür görmek mümkün kafatasının üstündeki deriyi çekin.
4. Foramen magnum içerisinden küçük makas alt ucu takarak ve hemen yönünde çevirerek açık kafatası kestilateral yan. Yavaşça gözleri ve frontoparyetal sütür arkasında bir yere parietal kemik yukarı lateral kenarı boyunca kesilir; Daha sonra, (Şekil 2A yeşil kesikli çizgi bakınız) kafatasının merkezine doğru çevirin ve kafatasının diğer tarafına orta hat boyunca kesilir.
5. Ince uçlu forseps kullanarak, (Şekil 2A sarı kesikli oka bakınız) beyin maruz yana frontoparie- köşesinden kafatasını kaldırın ve çapraz yukarı çekin ve. Kafatası kaldırıldığında beyin yerinde kalacak şekilde kafatası baş herhangi bir kemik veya deriye bağlı olmadığından emin olun. Beyin kafatası ile hareket halinde, kafatası ve beyin arasında herhangi bir bağ dokusunu kaldırmak için küçük bir makas kullanın.
6. Beyin maruz kaldığı zaman, beyin kuru olması için izin yoktur. Kafatası ve ısındı ile dolu bir Petri kabındaki beyin tutarken Böylece, bir sonraki adımları uygulayın, SPS gazlandı.
7. E için kullanılan beyin parçası ayırınbir neşter ve bir ıspatula kullanılarak beynin geri kalanından Xperiment. Beyincik kullanılması durumunda, (Şekil 2B-D kırmızı çizgilerde) midbrain ve pons aracılığıyla tek bir kesim tarafından ön beyin ayırmak ve taze içeren küçük bir petri taşımak, SPS gazlandı.
8. Yatay düzlemde beyincik dilimleme sahne kesme beyin yapıştırma için geniş ve düz bir taban oluşturmak için beyin sapı çıkarın. Önbeyinden kesildi tarafı aşağıya bakacak şekilde kısaca filtre kağıdı ıslak parçasının üzerine beyincik yerleştirin.
   1. (Şekil 2B mavi çizgi ile belirtildiği gibi) bazı oluşturmak için bir neşter ile beyin sapı kesilmiş ve SPS beyincik dönün. Kesme diğer uçaklar gerektiğinde, buna göre beyincik bloğu (Şekil 2C-D mavi çizgiler) kırpın.

3. Beyin dilimleme

1. O gün olduğu araştırarak kesme aşamasında hazırlayınry, sahnenin ortasında superglue küçük bir damla uygulamadan önce.
2. Doğru tarafı yukarıya gelecek şekilde bir spatula ile SPS'den beyin blok kaldırın ve filtre küçük kâğıt parçaları kullanarak beynin herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak. Sonra, tek bir hareketle, sahnede tutkal damla üzerine spatula beyni kaydırın.
3. Kurutmadan beyin ve doku yüzüne kadar çalışan tutkal önlemek için, bir Pasteur pipeti ile SPS birkaç damla uygulamak ve dilimleme odası içindeki kesme aşamasını yerleştirin. Çevrede bulunan bölgeler (örneğin, serebral korteks) bıçak bakacak şekilde beyin blok hizalama ve böylece dilimlenmeden önce, mekanik basınç, en az miktarda maruz kalacaktır.
4. Sürekli kesme odası içindeki SPS gazlanması olarak 34-37 ° C sıcaklık muhafaza edilirken, üreticinin talimatlarına göre her dilim. Extern doldurarak bu mesafeden kesme bölmenin sıcaklığını tutmakısındı saf su ve sıcaklığı çok düşük düştüğünde su değiştirme ile dilicisinin al odası.
   NOT: dilimleme parametreleri deneysel olarak incelenmiştir ediliyor doku ve nöronların her türü için bulunması gerekir. Seramik bıçaklar ve serebellar Golgi hücreleri ile Campden SMZ 700 dilicisinin durumunda, 0.75 mm titreşim genliği 65 Hz ve 0,05 mm / sn hıza ilerleyen kullanın; serebellar çekirdek nöronlar daha yüksek genlik ve frekans (1 mm ile 90 Hz, sırasıyla), ve daha yavaş ilerleme hızı (0,01-0,02 mm / sn) için tavsiye edilir. Golgi ve serebellar nükleer nöronlar hem de, dilim kalınlığı 300 mikron olmalıdır.
5. Dilimleme sırasında dilimler kendi üzerine katlanmasına izin vermez. Yavaşça tercihen sadece deney için ilgi bölgelerinde dilim dokunmadan, yumuşak bir fırça ile destekleyerek bu önleyin. Vibratome bıçak dokunmadan gelen fırça önlemek için özen; Özellikle seramik bıçakları durumunda, hatta hafif bir temasbıçak zarar verebilir.
6. Geniş ağızlı, yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak bölmeyi tutan / bir toparlanma dilimleme odasından her dilim taşıyın.
7. Dilimler, deney başlamadan önce en az 1 saat boyunca oda içinde bekletin. Bu, hasar görmüş veya ölmekte doku ve hücrelerinin bozulması sağlar ve böylece temiz bir dilim yüzeyinin sonuçlanır. İlk saat boyunca, 34-36 ° C aralığı içinde oda içindeki SPS sıcaklığını tutmak; dilimleri dilimleri zarar ya da onları yüzer yapabilirsiniz hava kabarcıkları tarafından dokunulmaz değildir emin olun.

4. Deney

1. 1 saat sonra, kurtarma bölmesi sıcaklığı RT (17-25 ° C) kadar soğumasını bekleyin.
   Not: Bu dilimler bakteri büyümesini hem de hücresel metabolizmayı yavaşlatarak kullanılabilecek sırasında süreyi uzatabilir. Bu süre, beyin bölgesi ve hücre tipine bağlıdır. Örneğin, golgi yer alan bazı hücre türleri dilimleri sağlıklı olduğu bulunabilir8 saat diğer türleri ise kesim sonrası sadece 6 saat sürer.
2. 1 saat dilimleme geçtikten sonra çeşitli elektrofizyolojik deneyler için dilimleri kullanarak.

Sonuçlar

Tarif edilen şekilde hazırlandı dilimleri çeşitli elektrofizyolojik ve Optogenetic deneyleri için de kullanılabilir. Şekil 3A ve 3C olarak, sırası ile, diferansiyel girişim (DIC), optik altında kullanıldığında, yatay serebellar dilimi ve koronal beyin korteks dilim, temsili bir örneğini gösterir. Serebellar dilim, serebellar nöronların çeşitli türleri kolayca, kendi konum ve hücre vücut şekli kabul edilebilir elektrofizyolojik kayıtları hedefe yönelik.

Tartışmalar

Bu fizyolojik yerine buz soğukluğunda sıcaklık farelerden akut beyin dilimleri hazırlamak için bir yöntem göstermektedir.

Bu, soğuk koşullar ile hazırlananlar ile karşılaştırıldığında, sıcak koşullarda elde edilen dilimlerin kalitesi yüksek olduğu ¹¹ gösterilen dilimleyici bıçak düşük dikey titreşimi sahip olması koşuluyla edilmiştir. Fizyolojik sıcaklık dilimleme gibi tek hücreli anormalliklerin yanı sıra ağ davranış tezahür edebilir meta...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentobarbital	CTS	170066	Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.
Big scissors	FST	14001-16	Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation
Iris scissors	Prestige medical	48,148	Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm
Fine tip forceps	FST	11254-20
Scalpel	FST	91003-12
Scalpel blade #11	FST	10011-00
Small spatula	Fisher	2350
Filter paper			Any laboratory brand can be used.
Petri dishes	Duroplan	Z231509-1
Glass beakers	SCHOT	10022846
Pasteur pipette	Maple Leaf Brand	14672-029
Super glue	LOCTITE	4091361/1
Slicer	Campden	7000-smz
Ceramic slicing blade	Campden	7550-1-C
Magnetic heater/stirrer			For heating up the SPS for the procedure
Electric kettle			For heating up water for temperature control
Slice recovery chamber + heating unit	Warner instruments	BSC-HT +  BSC-BUW	Home-built models may also be used.
Thermometer			For monitoring SPS temperature during dissection and slicing