Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur

Zusammenfassung

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung der akuten Hirnschnitten. Dieses Verfahren ist ein kritisches Element für elektrophysiologische Patch-Clamp-Experimenten, die weitgehend die Qualität der Ergebnisse bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass das Weglassen der Kühlschritt während des Schneidverfahrens ist vorteilhaft beim Erhalt gesunder Scheiben und Zellen, insbesondere beim Umgang mit hoch myelinisierten Hirnstrukturen aus reifen Tieren. Obwohl der genaue Mechanismus, durch erhöhte Temperatur unterstützt neuronalen Gesundheit kann nur spekuliert werden, liegt es nahe, daß, wenn möglich, die Temperatur in dem das Schneiden durchgeführt wird, sollte in der Nähe von physiologischen Bedingungen, um temperaturbedingte Artefakte zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit des Verfahrens und damit die kurzen Vorbereitungszeit. In der Methode nachgewiesen erwachsenen Mäusen werden verwendet, aber die gleiche Prozedur kann mit jüngeren Mäusen als auch Ratten angewendet werden. Auch die folgenden Patch clamp Experiment auf horizontalen Kleinhirnschnitten durchgeführt, aber die gleiche Prozedur kann auch in anderen Ebenen als auch andere hinteren Bereichen des Gehirns verwendet werden.

Einleitung

Das Ziel der vorgestellten Methode ist es, qualitativ hochwertige akuten Hirnschnitten für die in vitro elektrophysiologischen Experimenten bekommen, vor allem bei der Verwendung von Erwachsenen oder sogar alte Tiere.

Die akute Hirnschneidverfahren, wie von Skrede und Westgaard ¹ in zwei eleganten Sätzen beschrieben, hat sich zu einer der Grundlagen der modernen neurowissenschaftlichen Forschung und wird weltweit in unzähligen Variationen beschäftigt. Die Qualität der Schichten wird in der Anzahl der lebenden Neuronen pro Schicht reflektiert wird, die Zeitdauer, während welcher die Zellen behalten ihre elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften als auch die Integrität des Gewebes. Außerdem ist die maximale Dauer für einen stabilen Aufzeichnungen hängt von der Qualität der Schichten. Somit entlang der Jahrzehnte die ursprüngliche Schneidverfahren wurde weiter von einzelnen Forschungsgruppen entwickelt Scheibe Erholung nach dem Schneiden ^2-10, die durch komplexe Modifikationen der Zusammensetzung der Schneide erweitern or Recovery-Lösungen (wie Hinzufügen Ascorbat, Thioharnstoff oder auch H ₂ O ₂₎ als auch intrakardiale Perfusion vorge des Tieres mit gekühlten physiologischen Lösungen.

Wie kürzlich gezeigt, ¹¹ scheint physiologischer Temperatur während des Schneidens als vorteilhafter als Kühl neuronale Gesundheit; die Verbesserung ist auffälligsten bei der Arbeit mit Erwachsenen (2-8 Monate) Nagetiere. Vermeidung dramatische Temperaturänderungen verhindert Artefakte aufgrund von temperaturabhängigen Prozesse in den Zellen, wie Plastizität ¹³ und Ionenkanäle Kinetik ^13,14. Solche Änderungen können Membranspannung und der intrazellulären Calcium-Signalgebung, spitze Schwelle beeinflussen, und Spike Form.

Die "heiße" akute Schnittpräparat hier vorgestellte Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zur Gewinnung hochwertiger akuten Hirnschnitten von jeder Region des Gehirns, einschließlich des Kleinhirns, die Cortex und Hippocampus, Hirnstammkerne ^{16 <}/ Sup> und Riechkolben, die beide in Ratten und Mäusen.

Bemerkenswert ist, erfordert die physiologische Temperatur Slicing Verfahren, dass die Schneidklinge schwingt nahezu perfekt horizontal und ist ohne bauliche Mängel. Eine solche Präzision vielleicht nicht erreichbar mit älteren Slicer Modelle; In solchen Fällen empfehlen wir die Durchführung der Schnittpräparat in eiskalten Bedingungen wie die niedrige Temperatur scheint das Gewebe widerstandsfähiger gegen mechanische Beschädigungen, auch wenn auf Kosten der Stoffwechselfehler zu machen.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Hebräischen Universität Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Herstellung der Lösungen und Werkzeuge für Slicing

1. Herstellung von 1 l physiologischen Standardlösung (SPS) mit den in Tabelle 1 beschriebenen Ionen.
   1. Vorbereitung einer Stammlösung, die die Salze von 10-fachen der Endkonzentration im Voraus in einem Speicherglasflasche mit 1000 ml entionisiertem Wasser (Leitfähigkeit von 0,055 & mgr; S / cm) gefüllt. Hinzufügen Salze (NaCl, KCl, KH ₂ PO ₄ und MgSO _4), und Rühren, bis es vollständig gelöst ist. Bewahren Sie die Stammlösung in 4 ° C.
   2. Die endgültige SPS-Lösung am Tag des Experiments. 100 ml der Stammlösung zu 700 ml gereinigtem Wasser unter Verwendung magnetischer Rührstab lösen das Glucose (3,6 g) und NaHCO ₃ (2,18 g) und dann Hinzufügen von gereinigtem Wasser bis zu 1 l
   3. Gleichgewicht kommen die solutiauf durch Begasung mit 95% O _2/5% CO ₂ für ~ 20 min. Danach fügen Sie 2 ml 1 M CaCl _{2 -Lösung.}
2. Montieren Sie folgende Werkzeuge (Abbildung 1).
   1. Bereiten Sie große Schere oder einem anderen Werkzeug für Enthauptung, kleine chirurgische Scheren zum Öffnen des Schädels, um feine Spitze Pinzette zum Anheben des Schädels, um das Gehirn freizulegen, Skalpell mit Klinge zum Sezieren den gewünschten Teil des Gehirns in Scheiben geschnitten werden und eine kleine Spachtel zur Manipulation der seziert Hirnteile.
   2. Außerdem bereiten kleine Stücke von Filterpapier zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus dem Gehirn, zwei kleine Petrischalen für das Gehirn in zwei 500 ml Becherglas zur Aufnahme erwärmt gereinigtes Wasser und SPS, und Cyanacrylat-Klebstoff zum Verkleben des Gehirns, die zerlegt werden Slicing Bühne.
   3. Bereiten Sie eine kleine Bürste für die Handhabung der Scheiben während der Schneiden und einem breiten Mund Glas Pasteurpipette zur Bewegung der Scheiben von der Schneide Bad zur Erholung chamber. Desinfizieren Sie die Werkzeuge, um das Wachstum von Bakterien in den warmen Scheibe Bäder verhindern. Darüber hinaus verwenden saubere Laborhandschuhe.
3. Bereiten Sie einen untergetauchten Slice Rückgewinnungskammer wie von Gibb und Edwards ¹⁵ beschrieben. Kontinuierlich Gas die SPS in ihm mit 95% O _2/5% CO ₂ und halten bei 36 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Begasung nicht in kleinen Blasen in der Badewanne, die Scheiben beschädigen könnten gefangen führen.
4. Warm ~ 300 ml der SPS bis 36 ° C auf einer Heizplatte mit Magnetrührer oder in einem Wasserbad. Wenn eine Heizplatte verwendet wird, kümmern sich um die Lösung von Überhitzung, die in Ionen Fällung führen kann. Im Falle kommt es vor, warme Frisch SPS statt Kühl die alte.
5. Bringen ~ 500 ml gereinigtem Wasser zum Kochen mit einem elektrischen Wasserkocher und in ein Becherglas, kombiniert 300 ml davon mit kaltem Wasser, um etwas wärmer Wasser als der Slicing Temperatur zu erhalten. Verwenden Sie diese erwärmt gereinigtes Wasser während der Enthauptung und verwenden Sie die Leistungsbezogenening des abgekochtes Wasser später für die Aufrechterhaltung der physiologischen Temperatur des Slicing-Bad.
6. Betäuben die Maus durch Injektion von 0,1 ml von Pentobarbital (60 mg / ml) intraperitoneal verabreicht. Nach ein paar Minuten kontrollieren, ob das Tier nicht zu stark Zehe oder Schwanz drückt reagieren, um den Mangel der Empfindung zu ermitteln.

2. Präparieren des Gehirns

1. Enthaupten Sie die Maus schnell durch Schneiden der Hals mit den großen Schere in der Nähe der Rückseite des Schädels, und lassen Sie den Kopf in den Becher mit erwärmtem gereinigtem Wasser abzuspülen überschüssiges Blut sinken.
2. Setzen Sie das Foramen magnum in den Schädel unter der Nackenmuskulatur und der Haut, möglicherweise das Entfernen des Hals mit dem kleinen Schere.
3. Ziehen Sie die Haut auf der Oberseite des Schädels in der Lage sein, um die Schädelnähte deutlich sehen, um das Öffnen des Schädels Führer sein.
4. Schneiden Sie den Schädel öffnen, indem Sie die untere Spitze der kleinen Schere durch das Foramen magnum und sofort wandeln sie in Richtungdie laterale Seite. Vorsichtig entlang der Seitenkante des Scheitelbeins bis zu einer Stelle hinter den Augen und dem frontoparietal Naht abgeschnitten; dann biegen Sie in Richtung der Mitte des Schädels und über die Mittellinie auf die andere Seite des Schädels geschnitten (siehe grüne gestrichelte Linie in Abbildung 2a).
5. Mit feiner Spitze Pinzette, heben Sie den Schädel von der frontoparietal Ecke und ziehen Sie sie schräg nach oben und zur Seite, um das Gehirn ausgesetzt werden (siehe gelben gestrichelten Pfeil in Abbildung 2a). Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist nicht auf einen Knochen oder Haut des Kopfes angebracht ist, so dass das Gehirn wird an Ort und Stelle bleiben, wenn der Schädel wird angehoben. Im Falle, dass das Gehirn mit dem Schädel bewegen, verwenden Sie die kleine Schere, jede Bindegewebe zwischen dem Schädel und dem Gehirn zu entfernen.
6. Wenn das Gehirn ausgesetzt ist, nicht zulassen das Gehirn trocken sein. So führen Sie die nächsten Schritte, während die Schädel und das Gehirn in einer Petrischale mit erwärmt gefüllt, vergast SPS.
7. Nehmen Sie den Teil des Gehirns für e verwendetXperiment vom Rest des Gehirns mit einem Skalpell und einem Spatel. Im Falle der Verwendung des Kleinhirns, lösen sich von der Vorderhirn durch einen einzigen Schnitt durch das Mittelhirn und Pons (entlang der roten Linien in den 2B-D) und verschieben Sie sie in eine kleine Petrischale, die frisch enthält, vergast SPS.
8. Entfernen Sie den Hirnstamm, eine gerade und breite Basis für die Verklebung das Gehirn Schneidstufe beim Schneiden das Kleinhirn in horizontaler Ebene zu bilden. Kurz legen Sie das Kleinhirn auf einem nassen Stück Filterpapier, so dass die Seite, die aus dem Vorderhirn geschnitten wurde nach unten zeigt.
   1. Schneiden Sie den Hirnstamm mit einem Skalpell, um die Basis zu bilden (wie bei der blauen Linie in 2B angegeben) und schicken Sie das Kleinhirn an die SPS. Wenn andere Ebenen der Schneid nötig sind, schneiden Sie die Kleinhirn-Block entsprechend (blaue Linien in den 2C & D).

3. Schneiden des Gehirns

1. Bereiten Sie den Schneidstufe durch die Ermittlung, dass es dry, bevor ein kleiner Tropfen Superkleber in der Mitte der Bühne.
2. Heben Sie das Gehirn Block von der SPS mit einem Spatel mit der richtigen Seite nach oben, und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Gehirn mit kleinen Stücken von Filterpapier. Dann, mit einem einzigen Bewegung, schieben das Gehirn vor dem Spatel auf die Tropfen Kleber auf der Bühne.
3. Um das Gehirn vor dem Trocknen und den Kleber vom Laufen auf den Seiten des Gewebes zu verhindern, ein paar Tropfen von SPS mit einer Pasteurpipette und platzieren Sie den Schneidstufe in der Schneidekammer. Ausrichten des Gehirns blockieren, so dass die Bereiche von Interesse (zB Kleinhirnrinde) sind gegenüber der Klinge und somit zur geringsten mechanischen Druck, bevor es geschnitten unterworfen werden.
4. Schneiden Sie jede Scheibe nach den Anweisungen des Herstellers, während er ständig Begasung des SPS in der Schneidkammer sowie die Temperatur bei 34 bis 37 ° C. Halten Sie die Temperatur der Schneidkammer in diesem Bereich durch Befüllen des external Kammer der Slicer mit erwärmtem gereinigtem Wasser und Ersetzen des Wassers, wenn die Temperatur zu niedrig fällt.
   HINWEIS: Die Slicing Parameter müssen experimentell für jede Art von Gewebe und Nervenzellen, die untersucht werden gefunden werden. Im Falle des Campden SMZ 700 Schneider mit Keramikschaufeln und zerebelläre Golgi-Zellen verwenden 0,75 mm Schwingungsamplitude bei 65 Hz und die Vorschubgeschwindigkeit von 0,05 mm / sec; für Kleinhirnkern Neuronen höherer Amplitude und Frequenz (1 mm und 90 Hz, jeweils) und langsamer Vorschubgeschwindigkeit (0,01-0,02 mm / sec) empfohlen. Für beide Golgi und Kleinhirnkernneuronen sollte Schichtdicke 300 & mgr; m.
5. Während der Schneiden, erlauben nicht die Scheiben an sich selbst zu falten. Verhindern Sie dies, indem Sie vorsichtig unterstützt sie mit einer weichen Bürste, vorzugsweise nur in Bereichen, die nicht von Interesse für das Experiment sind Berühren der Scheibe. Achten Sie darauf, den Pinsel vom Berühren der Vibratom Klinge zu verhindern; insbesondere im Falle der keramischen Blätter, sogar ein leichter Kontaktkann die Klinge beschädigen.
6. Bewegen Sie jede Scheibe von der Schneidekammer zu einer Erholung / Haltekammer mit einem breiten Mund, feuerpolierte Glaspasteurpipette.
7. Lassen Sie die Scheiben ruhen in der Kammer für mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments. Dies ermöglicht den Abbau geschädigter oder sterbende Zellen und Gewebe und führt zu einer saubereren Scheibenoberfläche bei. Während der ersten Stunde, Halten der Temperatur des SPS in der Kammer im Bereich von 34-36 ° C; sicherzustellen, dass die Scheiben nicht durch Luftblasen, die die Scheiben beschädigen oder sie schwimmen kann berührt.

4. Experiment

1. Nach 1 Stunde, lassen die Erholung Kammertemperatur abkühlen auf RT (17-25 ° C).
   Anmerkung: Dies kann die Zeitdauer, während der die Scheiben durch die Verlangsamung des Wachstums von Bakterien und Zellstoffwechsels verwendet werden, zu verlängern. Dieser Zeitraum ist abhängig von der Gehirnregion und Zelltyp. Beispielsweise können bestimmte Arten von Golgi-Zellen gefunden werden gesund in Scheiben zu sein8 Stunden nach dem Schneiden während andere Arten dauern nur 6 Stunden.
2. Nach 1 Stunde wurde aus dem Slicing geben, verwenden Sie die Scheiben für die verschiedenen elektrophysiologischen Experimenten.

Ergebnisse

Scheiben in der beschriebenen Weise hergestellt wurden, können für verschiedene elektrophysiologische und optogenetische Experimente eingesetzt werden. In 3A und 3C zeigen wir ein repräsentatives Beispiel eines horizontalen Kleinhirnscheibe und einem koronalen Gehirnrindenscheibe jeweils unter Differentialinterferenz (DIC) Optik angesehen. In der Klein Scheibe, können verschiedene Arten von Kleinhirn-Neuronen leicht durch ihre Lage und Zellkörperform erkannt werden, so dass gezielt...

Diskussion

Wir zeigen ein Verfahren zur Herstellung von akuten Gehirnschnitten von Mäusen in physiologischer statt eiskalter Temperatur.

Es wurde gezeigt, dass ¹¹ die Qualität der Scheiben in warmen Bedingungen erhaltenen überlegen ist, wenn sie mit denen mit kalten Bedingungen hergestellt verglichen, vorausgesetzt, daß die Schneidklinge eine minimale vertikale Vibration. Slicing in physiologischer Temperatur können physiologische Artefakte durch die niedrige Temperatur verursacht werde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentobarbital	CTS	170066	Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.
Big scissors	FST	14001-16	Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation
Iris scissors	Prestige medical	48,148	Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm
Fine tip forceps	FST	11254-20
Scalpel	FST	91003-12
Scalpel blade #11	FST	10011-00
Small spatula	Fisher	2350
Filter paper			Any laboratory brand can be used.
Petri dishes	Duroplan	Z231509-1
Glass beakers	SCHOT	10022846
Pasteur pipette	Maple Leaf Brand	14672-029
Super glue	LOCTITE	4091361/1
Slicer	Campden	7000-smz
Ceramic slicing blade	Campden	7550-1-C
Magnetic heater/stirrer			For heating up the SPS for the procedure
Electric kettle			For heating up water for temperature control
Slice recovery chamber + heating unit	Warner instruments	BSC-HT +  BSC-BUW	Home-built models may also be used.
Thermometer			For monitoring SPS temperature during dissection and slicing