פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Summary

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Abstract

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה של פרוסות מוח חריפות. הליך זה הוא אלמנט קריטי עבור ניסויי תיקון- clamp אלקטרו שקובע במידה רבה את איכות תוצאות. הוכח כי השמטת צעד הקירור במהלך חיתוך הליך היא בהשגת פרוסות ותאים בריאים, במיוחד כאשר התמודדות עם מבנים מוחיים myelinated מאוד מבעלי חיים בוגרים. למרות שהמנגנון המדויק שבו טמפרטורה גבוהה תומכת בבריאות עצבית ניתן השקיעה רק על, זה מתקבל על הדעת כי, במידת האפשר, את הטמפרטורה שבה החיתוך מבוצע צריכה להיות קרובה למצבים פיסיולוגיים כדי למנוע חפצים הקשורים בטמפרטורה. יתרון חשוב נוסף של שיטה זו הוא הפשטות של ההליך ולכן זמן הכנה הקצר. בשיטה הוכיחה עכברים בוגרים משמשים אך את אותו ההליך יכול להיות מיושם עם עכברים צעירים כמו גם חולדות. כמו כן, CL התיקון הבאניסוי המגבר מתבצע על פרוסות המוח הקטן אופקיים, אלא גם באותו ההליך ניתן להשתמש במטוסים אחרים, כמו גם אזורים האחוריים אחרים של המוח.

Introduction

מטרת השיטה המוצגת היא להשיג פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה עבור בניסויים במבחנה אלקטרו, במיוחד בעת שימוש במבוגרים או אפילו בעלי חיים ישנים.

שיטת חיתוך המוח החריפה, כפי שתוארה על ידי Skrede ^ו1 Westgaard בשני משפטים אלגנטיים, הפכה לאחד מעמודי התווך של מחקר במדעי המוח מודרני ומועסקת בוריאציות אין ספור ברחבי העולם. האיכות של הפרוסות באו לידי ביטוי במספר של חיים נוירונים לכל פרוסה, פרק זמן שבמהלכו התאים ממשיך תכונות אלקטרו והצורניות שלהם, כמו גם בשלמות הרקמה. יתר על כן, משך הזמן המקסימאלי להקלטות יציבים תלוי באיכות של הפרוסות. כך, לאורך עשרות השנים, שיטת החיתוך המקורית פותחה עוד יותר על ידי קבוצות מחקר בודדות כדי לשפר את ההתאוששות פרוסה לאחר חיתוך ^2-10, לעתים קרובות על ידי שינויים מורכבים של הרכב חיתוך oפתרונות התאוששות r (כגון הוספת ascorbate, thiourea או אפילו H ₂ O _2), כמו גם מראש זלוף תוך לבו של בעל החיים עם פתרונות פיסיולוגיים מקוררים.

כפי שהראה ¹¹ לאחרונה, נראה טמפרטורה פיזיולוגית במהלך החיתוך להיות מועיל יותר מאשר קירור לבריאות עצבית; השיפור בולט ביותר בעבודה עם מבוגרים מכרסמים (2-8 חודש). הימנעות שינויי טמפרטורה דרמטיות מונעת חפצים בשל תהליכי טמפרטורה תלויה בתוך התאים, כגון קינטיקה פלסטיות ¹³ ויון-ערוצי ^13,14. שינויים כאלה יכולים להשפיע על מתח קרום ואיתות סידן תוך תאי, סף ספייק, וספייק צורה.

השיטה "החמה" פרוסה חריפה ההכנה שהוצגה כאן היא נוהל כללי לקבלת פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה מכל אזור במוח, כולל המוח הקטן, קליפת המוח וההיפוקמפוס, גזע המוח גרעיני ^{16 <}/ Sup> כמו גם את הנורה חוש הריח, הן בחולדות ועכברים.

יש לציין, הליך חיתוך הטמפרטורה הפיזיולוגי דורש כי להב החיתוך רוטט כמעט בצורה מושלמת בצורה אופקית, והוא ללא כל פגמים מבניים. הדיוק הזה לא יכול להיות בר-השגה עם מודלים מבצעה מבוגרים; במקרים כאלה, אנו ממליצים על ביצוע הכנת פרוסה בתנאים קר כקרח כנראית בטמפרטורה הנמוכה על מנת להפוך את הרקמה עמידה יותר בפני נזק מכאני, גם אם במחיר של סטיות מטבולים.

Protocol

כל הליכי הניסוי שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה בעברית ובועדת השימוש.

1. הכנת הפתרונות וכלים לחיתוך

1. הכן 1 ליטר של פתרון פיסיולוגי סטנדרטי (SPS) המכיל את היונים שמתוארים בטבלה 1.
   1. הכן פתרון מניות המכיל מלחים בשעה 10 פעמים את הריכוז הסופי מראש בבקבוק זכוכית אחסון מלא 1,000 מיליליטר של מים ללא יונים (מוליכות של 0.055 מייקרו-שני / סנטימטר). להוסיף מלח (NaCl, KCl, KH ₂ PO _4, וMgSO _4), ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. להפוך את פתרון SPS הסופי ביום של הניסוי. הוספה של פתרון המניות 100 מיליליטר ל -700 מיליליטר של מים מטוהרים, לפזר את גלוקוז (3.6 גר ') וNaHCO ₃ (ז 2.18) באמצעות סרגל מערבבים מגנטי ולאחר מכן להוסיף מים מזוקקים עד 1 ל
   3. לאזן solutiבגז אותו עם 95% O _2/5% CO ₂ ~ 20 דקות. אחרי זה, להוסיף 2 מיליליטר של M CaCl פתרון ₂ 1.
2. להרכיב את הכלים הבאים (איור 1).
   1. הכינו מספריים גדולים או כלי אחר לעריפת הראש, מספריים כירורגיות קטנים לפתיחת הגולגולת, מלקחיים טיפ נאה להרמת הגולגולת לחשוף את המוח, באזמל עם להב ללנתח את החלק הרצוי של המוח להיות פרוס ומרית קטנה לטיפול ב חלקי מוח גזורים.
   2. בנוסף, להכין חתיכות קטנות של נייר סינון להסרת נוזלי עודפים מהמוח, שתי צלחות פטרי קטנות למוח להיות גזורים בשתי זכוכית 500 מיליליטר כוסות לחממו מים המכילים מטוהרים וSPS, ודבק cyanoacrylate הדבקת המוח שלב חיתוך.
   3. הכן מברשת קטנה לטיפול בפרוסות במהלך החיתוך ופיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחב להעברת פרוסות מאמבטית החיתוך לצ'ה ההתאוששותmber. לחטא את הכלים כדי למנוע צמיחת חיידקים באמבטיות פרוסה החמה. יתר על כן, להשתמש בכפפות מעבדה נקיות.
3. הכן חדר התאוששות הפרוסה שקוע כזה כפי שתואר על ידי גיב ו ^-15 אדוארדס. ברציפות בגז SPS בו עם 95% O _2/5% CO ₂ ולשמור על 36 מעלות צלזיוס. ודא כי להמתה בגז אינו מביא לבועות קטנות שנלכדו באמבטיה שיכולה לגרום נזק לפרוסות.
4. חם ~ 300 מיליליטר של SPS 36 ° C על צלחת חימום עם בוחש מגנטי או באמבט מים. אם נעשה שימוש בצלחת חימום, לטפל כדי למנוע את הפתרון מהתחממות יתר, שעלול לגרום למשקעי יון. במקרה זה קורה, SPS חם וטרי במקום הקירור הישן.
5. להביא ~ 500 מיליליטר של מים מטוהרים לרתיחה תוך שימוש בקומקום חשמלי ו, בכוס, לשלב 300 מיליליטר שלו במים קרירים כדי לקבל מים מעט חמים יותר מטמפרטורת החיתוך. השתמש בזה חימם מים מטוהרים בעריפת הראש ולהשתמש במאהלרנינג של המים רתוחים מאוחר יותר לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של האמבטיה החיתוך.
6. לטשטש את העכבר על ידי הזרקת 0.1 מיליליטר של pentobarbital (60 מ"ג / מיליליטר) intraperitoneally. אחרי כמה דקות לבדוק שבעלי החיים אינם מגיבים לצובט הבוהן או זנב חזק כדי לברר את חוסר התחושה.

2. ביתור המוח

1. לערוף את העכבר במהירות על ידי חיתוך הצוואר עם המספריים הגדולים ליד החלק האחורי של הגולגולת, ולתת לראש ליפול לתוך הכוס עם מים מטוהרים חיממו כדי לשטוף את הדם עודף.
2. לחשוף את מגנום foramen בגולגולת מתחת לשרירי הצוואר והעור, אולי הסרת יותר של הצוואר עם המספריים הקטנים.
3. משוך את העור בחלק העליון של הגולגולת כדי להיות מסוגל לראות בבירור את תפרי גולגולת על מנת להנחות את הפתיחה של הגולגולת.
4. חותך את הגולגולת הפתוחה על ידי החדרת הקצה התחתון של המספריים הקטנים דרך מגנום foramen ומייד להפוך אותם לכיווןהצד לרוחב. לחתוך בעדינות לאורך הקצה הלטרלי של העצם הקודקודית עד מיקום מאחורי העיניים ותפר frontoparietal; אז, פונה לכיוון מרכז הגולגולת וחצתה את קו האמצע לצד השני של הגולגולת האחר (ראה קו מקווקו ירוק באיור 2 א).
5. בעזרת מלקחיים טיפ נאה, להרים את הגולגולת מפינת frontoparietal ולמשוך באלכסון אותו וsidewards לחשוף את המוח (ראה חץ מקווקו צהוב באיור 2 א). ודא כי הגולגולת אינה מחוברת לשום עצם או עור של הראש, כדי שהמוח יישאר במקום שבו הגולגולת היא הרימה. במקרה שהמוח נע בגולגולת, להשתמש במספריים הקטנים כדי להסיר את כל רקמת חיבור בין הגולגולת והמוח.
6. כאשר המוח חשוף, לא מאפשר למוח להיות יבש. כך, בצע את השלבים הבאים תוך שמירה על הגולגולת והמוח בצלחת פטרי מלאה חימם, הומתו בגז SPS.
7. לנתק את חלק במוח המשמש לדוארxperiment משאר המוח באמצעות אזמל ומרית. במקרה של שימוש במוח הקטן, להתנתק מהמוח הקדמי על ידי חתך אחד דרך המוח התיכון וגשר המוח (קווים אדומים באיורים 2B-D) ולהעביר אותה לצלחת פטרי קטנה המכילה טרי, הומתו בגז SPS.
8. הסר את גזע המוח כדי ליצור בסיס ישר ורחב להדבקת המוח לחיתוך שלב שבו חותך את המוח הקטן במישור אופקי. בקצרה למקם המוח הקטן על פיסת נייר סינון רטובה כל כך שהצד שנחתך מהמוח הקדמי פונה כלפי מטה.
   1. חותך את גזע המוח עם אזמל כדי ליצור את הבסיס (כפי שצוין בקו הכחול בתרשים 2B), ולהחזיר את המוח הקטן לSPS. כאשר מטוסים אחרים של חיתוך יש צורך, לקצץ את בלוק המוח הקטן בהתאם (קווים כחולים בתרשימים 2C & D).

3. חותך את המוח

1. הכן את שלב הגזירה על ידי בירור שהוא הייתר"י, לפני יישום טיפה קטנה של דבק מגע באמצע השלב.
2. הרם את בלוק המוח מSPS בעזרת מרית עם צד עד נכון, ולהסיר את נוזלי עודפים מהמוח באמצעות חתיכות קטנות של נייר סינון. ואז, בתנועה אחת, חלק את המוח מהמרית על טיפת הדבק על הבמה.
3. כדי למנוע את המוח מייבוש והדבק בריצה בצידי הרקמות, להחיל כמה טיפות של SPS עם פיפטה פסטר והנח את שלב החיתוך בתא החיתוך. יישר את בלוק המוח כך שהאזורים של עניין (למשל, קליפת מוח) מתמודדים עם הלהב ובכך יהיה כפוף לכמות מינימאלית של לחץ מכאני לפני שנחתכה.
4. חותך כל פרוסה על פי הוראות היצרן ואילו בגז כל הזמן SPS בתא החיתוך, כמו גם שמירה על הטמפרטורה ב34-37 מעלות צלזיוס. שמור על הטמפרטורה של חדר החיתוך בטווח זה על ידי מילוי externתא אל של מבצעה עם חיממו מים מטוהרים והחלפת המים בכל פעם שהטמפרטורה יורדת נמוכה מדי.
   הערה: הפרמטרים החיתוך יש למצוא באופן ניסיוני עבור כל סוג של רקמה ותאי עצב שנבחנים. במקרה של מבצעה קמפדן SMZ 700 עם להבי קרמיקה ותאי Golgi המוח הקטן, להשתמש במשרעת תנודה 0.75 מ"מ על 65 הרץ וקידום מהיר של 0.05 מ"מ / שנייה; למשרעת נוירונים גרעיניים המוח הקטן יותר ותדירות (1 מ"מ ו -90 הרץ, בהתאמה), ומהירות איטית יותר מראש (.01-0.02 מ"מ / שנייה) מומלצים. עבור שני Golgi ונוירונים גרעיניים המוח הקטן, עובי פרוסה צריך להיות 300 מיקרומטר.
5. במהלך החיתוך, אינו מאפשר את הפרוסות לקפל על עצמם. למנוע את זה בעדינות על ידי תמיכתם במברשת רכה, רצוי לגעת בפרוסה רק באזורים שאינם בעלי עניין לניסוי. לטפל כדי למנוע את המברשת מלגעת בלהב vibratome; במיוחד במקרה של להבי הקרמיקה אפילו מגע, אורעלול לגרום נזק ללהב.
6. העבר כל פרוסה מתא החיתוך להתאוששות / מחזיק תא באמצעות פיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחבה, אש מלוטשת.
7. בואו פרוסות לנוח בחדר במשך שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. זה מאפשר פירוק של רקמות ותאים פגומים או למות ובכך גורם למשטח פרוסה נקי. במהלך השעה הראשונה, לשמור על הטמפרטורה של SPS בתא בטווח של 34-36 C °; להבטיח שהפרוסות אינן נוגעות בבועות אוויר שעלול לגרום נזק לפרוסות או לגרום להם לצוף.

ניסוי 4.

1. אחרי שעה 1, תן טמפרטורת חדר ההתאוששות להתקרר לRT (C ° 17-25).
   הערה: פעולה זו עשויה להאריך את משך הזמן שבמהלכו את הפרוסות ניתן להשתמש על ידי האטה של ​​הצמיחה של חיידקים, כמו גם חילוף חומרים בתאים. תקופה זו תלויה באזור במוח וסוג התא. לדוגמא, ניתן למצוא סוגים מסוימים של תאי Golgi להיות בריאים בפרוסות8 שעות לאחר החיתוך ואילו סוגים אחרים יימשכו רק 6 שעות.
2. אחרי שעה 1 עברה מהחיתוך, להשתמש בפרוסות לניסויי אלקטרו שונים.

תוצאות

פרוסות מוכנות באופן המתואר יכולות לשמש לניסויי אלקטרו וoptogenetic שונים. באיור 3 א ו3C, אנחנו מראים דוגמא מייצגת של חתך אופקי המוח הקטן ופרוסה בקליפת המוח מוח העטרה, בהתאמה, שנצפה תחת התערבות ההפרש (DIC) אופטיקה. בפרוסת המוח הקטן, מספר סוגים של תאי עצב של המוח קטן ?...

Discussion

אנו מדגימים שיטה להכנת פרוסות מוח חריפות מעכברים בפיסיולוגיים במקום טמפרטורה קרה כקרח.

הוכח ¹¹ שאיכות פרוסות שהושגו בתנאים חמים היא מעולה כאשר בהשוואה לאלו שהוכנו בתנאים קרים, ובלבד שיש לו את להב מבצע רטט אנכי מינימאלי. חית?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentobarbital	CTS	170066	Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.
Big scissors	FST	14001-16	Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation
Iris scissors	Prestige medical	48,148	Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm
Fine tip forceps	FST	11254-20
Scalpel	FST	91003-12
Scalpel blade #11	FST	10011-00
Small spatula	Fisher	2350
Filter paper			Any laboratory brand can be used.
Petri dishes	Duroplan	Z231509-1
Glass beakers	SCHOT	10022846
Pasteur pipette	Maple Leaf Brand	14672-029
Super glue	LOCTITE	4091361/1
Slicer	Campden	7000-smz
Ceramic slicing blade	Campden	7550-1-C
Magnetic heater/stirrer			For heating up the SPS for the procedure
Electric kettle			For heating up water for temperature control
Slice recovery chamber + heating unit	Warner instruments	BSC-HT +  BSC-BUW	Home-built models may also be used.
Thermometer			For monitoring SPS temperature during dissection and slicing