مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

وقد تم التحقيق بشكل مكثف الجسيمات الشحمية وبمثابة واحدة من نظم لتقديم الأدوية الطبية الحيوية الأكثر حيويا لتطبيقات سريرية ^1،2. وهي تتألف أساسا من الدهون الفوسفاتية والكوليسترول، وكلاهما مركبات حيويا محاكاة أجزاء من أغشية الخلايا الطبيعية. في حين أن المواد المائية يمكن شرك في المناطق الداخلية مائي، يمكن إدراجها كلاء محبة للدهون داخل طبقة ثنائية فسفوليبيد liposomal ^3. تغليف المواد داخل الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية يمنح الحماية ضد تدهور في الجسم الحي، وكذلك يمنع النظام المضيف من التأثيرات السامة للأدوية السامة للخلايا المستخدمة في العلاج من الأمراض، لمبحث المعالجة الكيميائية المثال تهدف إلى تدمير الخلايا السرطانية. تعديل سطح liposomal مع البوليمرات مثل polyethylenglycol (من مضاد) يمتد مزيد من الوقت تداول liposomal الدم في الجسم الحي بسبب الاستقرار sterical ^4. Moreovإيه، يمكن أن الجسيمات الشحمية بتنحية تركيزات عالية من العديد من المواد مثل البروتينات ^{5،6، 7،8} المواد المائية والإنزيمات ^9. ولأنها تخدم الأدوات العلاجية والتشخيصية السريرية موثوق بها والتي تستحق موافقتهم على تسليم الأدوية السامة للخلايا مثل دوكسوروبيسين لعلاج السرطان ^4. نظرا لمرونتها، الجسيمات الشحمية يمكن أيضا أن تكون محملة fluorochromes لأغراض الجراحية التشخيصية وموجهة الصورة.

يوفر التصوير مضان فعالة من حيث التكلفة وغير الغازية في أداة تشخيصية الجسم الحي والتي مع ذلك، يطالب بعض المتطلبات الأساسية. يمكن أن ثبت أن fluorochromes التي تتناسب بشكل افضل للتصوير في الجسم الحي يكون امتصاص مميزة والحدود القصوى للانبعاثات في النطاق حيث تشتت الضوء ونثر وكذلك تألق ذاتي الأنسجة القادمة من المياه والهيموغلوبين منخفضة. وهكذا، هذه المجسات لها من ماكسيما ABS / م بين 650 و 900 نانومتر ^(10). وبالاضافة الى هذا، واستقرار fluorochromes سواء في التجارب المختبرية والحية أمر بالغ الأهمية، كما طهاية والتخليص السريع يمكن أن تحد كثيرا تطبيقها لفي الجسم الحي التصوير ^11. آثار أخرى مثل ضعف الاستقرار وانخفاض الحساسية أو آثار السامة للخلايا على الأعضاء المستهدفة كما رأينا مع الأخضر الإندوسيانين (ICG) ^12-16، وغير المرغوب فيها ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم تحقيقات للتصوير في الجسم الحي. وقد أدت هذه الملاحظات إلى التنمية النشطة العديد من fluorochromes NIR قبل السريرية، الجسيمات النانوية وكذلك تقنيات جديدة للتصوير في الجسم الحي من عمليات التهابات والسرطان وللصورة موجهة جراحة ^17-20. وعلى الرغم من استقرار معظم (مضان بالقرب من الأشعة تحت الحمراء) NIRF قبل السريرية الأصباغ في المختبر، نضح السريع والتخليص من خلال الكبد والكلى تعوق استخدامها في التصوير في الجسم الحي البصري للأمراض والعمليات الالتهابية.

ntent "> ونحن بالتالي تقديم بروتوكول للتغليف من fluorochromes مثل تتميز كذلك بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت DY-676-COOH، والمعروف عن ميلها إلى إخماد الذاتي بتركيزات عالية نسبيا ²¹ في الجسيمات الشحمية. بتركيزات عالية H- تشكيل ديمر و / أو التفاعلات بين الجزيئات fluorophore تقع ضمن فورستر نتيجة دائرة نصف قطرها بعضهم البعض في فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بين جزيئات تألقي. وفي تركيز منخفض الفضاء بين زيادات جزيئات fluorophore، وبالتالي منع التفاعل التراص PI-التراص بي و -H ديمر تشكيل ومما أدى إلى انبعاث مضان عالية، والتبديل بين تركيز عال ومنخفض والتبريد مضان المرافق وتفعيل هي استراتيجية واعدة التي يمكن استغلالها للتصوير الضوئي ^(22). وفي هذا الصدد، التغليف من تركيزات عالية من الصبغة NIRF DY-676-COOH في المناطق الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية هو أكثر كرة القدمvorable لفي الجسم الحي التصوير من الصبغة مجانا. التحدي المتمثل في طريقة يكمن أولا وقبل كل شيء في التغليف الصحيح وثانيا، في المصادقة على الفوائد الناتجة عن التغليف تركيزات عالية من الصبغة. وبمقارنة خصائص التصوير من الجسيمات الشحمية مروي مع أن من صبغ مجاني وأيضا مع صياغة غير مروي الحويصلية مع تركيزات منخفضة من الصبغة أمر لا غنى عنه. وتبين لنا من خلال ترطيب فيلم وقذف بروتوكول بسيط، ولكن فعالة للغاية جنبا إلى جنب مع بديلة تجميد والذوبان الدورات التي التغليف تركيزات التبريد من DY-676-COOH في الجسيمات الشحمية هو ممكن عمليا. أساليب أخرى تستخدم لإعداد الجسيمات الشحمية مثل الطور المعكوس طريقة التبخر ²³ فضلا عن طريقة حقن الإيثانول ²⁴ تمكن إعداد الحويصلية مع الكفاءة العالية التغليف لكثير من المواد المائية. ومع ذلك، فإن طبيعة المادة المراد مغلفة يمكن أن تؤثر على كفاءة التغليف. في الواقع،وترطيب الفيلم وقذف بروتوكول المقدمة هنا كشفت أعلى كفاءة لتغليف من DY-676-COOH. لتوضيح فوائد liposomal التغليف من DY-676-COOH، وهذا نموذج وذمة الناجم عن زيموزان، الذي يسمح دراسة عمليات التهابات في غضون ساعات قليلة، كانت تستخدم. هنا، ثبت أن الجسيمات الشحمية مع تركيزات عالية من مغلفة DY-676-COOH هي أكثر مناسبة للجسم كله في التصوير الضوئي الجسم الحي من العمليات الالتهابية من الصبغة مجانا أو صياغة غير مروي liposomal مع تركيزات صبغ منخفضة. وهكذا فإن البروتوكول الأساسي يوفر طريقة بسيطة وسريعة لإنتاج الجسيمات الشحمية الفلورسنت مروي والتحقق من التنشيط والتصوير إمكاناتهم سواء في التجارب المختبرية والحية.

Protocol

ملاحظة: يتم الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الحيوان الإقليمية وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية بشأن استخدام الأخلاقي للحيوانات.

1. إعداد المواد والأدوات

1. إعداد تشكلت عفويا تشتت الحويصلة (SFV)
   1. حل وإعداد حلول المخزون من الدهون الفوسفاتية التالية: 214 ملغ / مل فسفاتيديل البيض (EPC)، 134 ملغ / مل الكولسترول، 122 ملغ / مل 1،2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [ميثوكسي (البولي ايثيلين جليكول) -2000] (ملح النشادر) (MPEG ₂₀₀₀ -DSPE) و 2 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazol-4 -yl) (ملح النشادر) (NBD-مخدر) في الكلوروفورم وتخزينها في قارورة زجاجية.
   2. تقديم حوالي 3 مل الكلوروفورم في قاع القارورة المستديرة ونقل حجم مناسب من حل الأسهم فوسفورية في الجزء السفلي قارورة مستديرة لإعداد الجسيمات الشحمية مكونة من EPC: تشول: MPEG ₂₀₀₀ -DSPE في نسبة المولي 6.5: 3: 0.5. لوضع العلامات مضان مزدوج من الجسيمات الشحمية إضافة 0.3٪ مول دبي الوطني-مخدر إلى حل الدهون.
   3. تتبخر الكلوروفورم من الحل فسفوليبيد العضوية تحت ضغط منخفض (300 م بار) عند 55 درجة مئوية باستخدام المبخر الدوار.
   4. بعد تشكيل لفيلم فوسفورية متجانسة، والحد من الضغط إلى 10 م بار لمدة 1-2 ساعة لإزالة إيداع الكلوروفورم المتبقية.
   5. في حين أن الكلوروفورم تتبخر، ويحل DY-676-COOH (6.181 ميكرومتر) في 10 ملي تريس العازلة الرقم الهيدروجيني 7.4 وملء وعاء ديوار مع النيتروجين السائل. التبديل على حمام بالموجات فوق الصوتية وضعت في 50 ° C.
   6. نقل حجم مناسب (0.5-1 مل) من DY-676-COOH (6.181 ميكرومتر) حل لأسفل القارورة المستديرة لترطيب الفيلم فوسفورية الجاف ودوامة بقوة حتى حويصلة تشكلت عفويا (SFV) أشكال التشتت. تأكد من أن كل من الدهون الفوسفاتية وفرقت لتجنب فقدان الدهون.
   7. هيئة تنظيم الاتصالات بعنايةnsfer أسفل القارورة المستديرة التي تحتوي على تشتت SFV في النيتروجين السائل وتجميد تشتت لمدة 3-5 دقيقة. ضع أسفل القارورة المستديرة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 50 درجة مئوية لذوبان الجليد تشتت ثم دوامة تشتت بقوة لمدة 1-2 دقيقة. كرر هذا الإجراء ست مرات، مما يجعل ما مجموعه سبعة تجميد والذوبان دورات.
2. قذف SFV لتشكيل الحويصلات الحويصلية متجانسة
   1. نقل تشتت SFV إلى 1 مل حقنة (حقنة-أ) وقذف تشتت عبر غشاء البولي 100 نانومتر باستخدام الطارد-LiposoFast الأساسية إلى حقنة-ب.
   2. قذف تشتت من حقنة-ب، والعودة إلى حقنة واحد، ثم كرر دورة عشر مرات. بسبب قذف، والحل في التغييرات حقنة من مظهر ضبابي إلى تشتت واضح مع الوقت. بعد عشر دورات (عشرون الخطوات قذف واحدة) إزالة حقنة-ب من الجهاز وقذف تشتت للمرة الأخيرة من حقنة واحد مباشرة في عقيمة1.5 مل أنبوب رد فعل.
3. تنقية liposomal مغلفة DY-676-COOH من الصبغة مجانا
   1. إعداد عمود هلام اللوني باستخدام الخرز G25 غارقة في 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 (العمود طول 28 سم، وقطره 0.8 سم).
   2. نقل 0.5 مل من مقذوف حويصلة التشتت على السرير جل والسماح للعينة هجرة في مصفوفة هلام.
   3. أزل الليبوزومات مع 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 (الشكل 1A) ويغسل العمود حتى المصارف صبغة خالية تماما من العمود. إذا لزم الأمر، جمع وإعادة تدوير الصبغة المجاني من تحلية والجفاف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   4. تركيز الجسيمات الشحمية مزال من قبل تنبيذ فائق (200،000 x ج، 2 ساعة على 8 ° C) ثم انطلاقها فى حجم كاف من معقمة 10 ملي تريس درجة الحموضة العازلة، 7.4.
4. الكمي لتركيز مغلفة DY-676-COOH
   1. إعداد منحنى المعايرة عن طريق إذابة DY-676-COOH (0، 82، 124،247، 494، 988 نانومتر) في 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4 تحتوي على 0.1٪ تريتون X100.
   2. حل 2 ميكرولتر (100 نانومول الدهون النهائي من 50 مليمول / لتر الأسهم) من الجسيمات الشحمية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر تريس العازلة التي تحتوي على 1٪ تريتون X100 لتدمير الحويصلات والافراج عن صبغ مغلفة. ثم تمييع العينات مع 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4 إلى تركيز تريتون-X100 النهائي من 0.1٪ (ت / ت) مما يجعل إجمالي حجم 1 مل. إعداد جميع العينات في مكررة.
   3. قياس امتصاص وانبعاث جميع العينات (مجانا DY-676-COOH وتريتون-X100 تعامل الجسيمات الشحمية) في الإثارة λ = 645 نانومتر، وانبعاث λ = 700 نانومتر. إنشاء واستخدام منحنى معايرة الصبغة حرية تحديد تركيز الصبغة مغلفة.
5. توصيف الحويصلية
   1. تحديد الأحجام وزيتا إمكانات الجسيمات الشحمية التي تشتت الضوء الديناميكي. تمييع عينات liposomal مع فلتر المعقمة (0.2 ميكرون) 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 إلى ميلانoncentration 100-300 ميكرومتر (الدهن). نقل العينات المخفف إلى انخفاض حجم كوفيت القابل للتصرف وقياس العينة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   2. توصيف الجسيمات الشحمية بواسطة المجهر الإلكتروني لإثبات حجم والنزاهة وتجانس الحويصلات liposomal وفقا لبروتوكولات القياسية.

2. التحقق من الإسفار، التبريد وتفعيل الليبوزومات محضرة

1. تحليل فيزيائية للتبريد مضان وتفعيل
   1. إعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب لالشفاه-Q و 2 أنابيب للالمجاني DY-676-COOH. نقل 100 نانومول الدهون الكلية (2.38 ميكرولتر من محلول المخزون / L الشفاه-Q 42 مليمول، التي تحتوي على 138 ميكروغرام / مل من مغلفة DY-676-COOH) في أنابيب المقابلة. انتقال حر DY-676-COOH ما يعادل محتوى صبغ الشفاه-Q (0.38 ميكروغرام مما يؤدي على سبيل المثال من 138 ميكروغرام / ميكرولتر 1،000 X 2.38 ميكرولتر الشفاه-Q المستخدمة). احتضان حوض واحد(ه) من كل مسبار في 4 درجات مئوية، وتجميد الأنبوب الثاني في -80 درجة مئوية خلال الليل (16 ساعة).
   2. تسخين كتلة التدفئة إلى 30 درجة مئوية. ملء مربع التبريد مع الثلج المجروش وتتوازن قسامة من 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 إلى درجة حرارة الغرفة.
   3. إزالة تحقيقات من 4 ° C وتتوازن في درجة حرارة الغرفة (ملفوفة في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء) وبسرعة ذوبان الجليد تحقيقات من -80 ° C إلى 30 ° C لمدة 5 دقائق. هدئ تحقيقات إذابة على الجليد لمدة 1 دقيقة قبل نقلهم إلى درجة حرارة الغرفة (ملفوفة أيضا في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء).
   4. إضافة 10 ملي تريس العازلة (درجة الحموضة 7.4) إلى كل من تحقيقات إلى 100 الحجم النهائي ميكرولتر وتتوازن جميع تحقيقات في RT لمدة 10 دقيقة.
   5. ماصة 80 ميكرولتر من كل مسبار في كوب انخفاض حجم كفيت وقياس امتصاص كل مسبار 400-900 نانومتر على مطياف. إعادة التحقيق لأنابيب يناظرها.
   6. نقل 80 ميكرولتر من كل مسبار إلى كوفيت الزجاج مناسبةوقياس الانبعاثات مضان على الطيفي بواسطة مثيرة تحقيقات في 674 نانومتر وقياس مضان 694-800 نانومتر.
2. امتصاص الخلايا وتنشيط مضان
   1. الحصول على وثقافة خطوط الخلايا التالية في وسائل الإعلام ثقافة المقابلة وفقا لظروف قياسية (37 ° C، 5٪ CO ₂ والجو مرطب 95٪). هنا، استخدم J774A.1 الفئران البلاعم خط الخلية (Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل العجل الجنين)، وورم أرومي دبقي خط الخلية البشرية، U-118MG (MEM تحتوي على الفيتامينات الأساسية و 10٪ (ت / ت) مصل الجنين العجل) ويفية خط الخلية البشرية، HT-1080 (RPMI مع 5٪ FCS).
   2. معطف 8 جيدا الشرائح غرفة مع بولي-L-ليسين (إضافة 100 ميكرولتر 0.001٪ بولي-L-ليسين إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. حل نضح والسماح للالشرائح غرفة لتجف لمدة 4 على الأقل ساعة على RT على طاولة العمل العقيمة. شطف الشرائح غرفة 3مرات مع محلول ملحي مخزنة 200 ميكرولتر هانك ثم ختم لهم البارافين ورقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 ° C حتى الحاجة.
   3. في حين أن الشرائح غرفة تجف، فلتر تعقيم الجسيمات الشحمية ومحلول الصبغة وتخزينها في 4 ° C حتى الحاجة.
   4. لتحليل التحقيق مع امتصاص الجسم كله في الجسم الحي NIR نظام التصوير مضان، وإعداد 5 قوارير الثقافة صغيرة لكل من خطوط الخلايا 3 اختبار (15 قوارير في المجموع). البذور 2 × 10 ⁶ J774A.1، U-118MG والخلايا-HT 1080 في قارورة الثقافة مع 5 مل من مستنبت المعني (في quintuples) وتنمو ل16-24 ساعة. موازية لقوارير الثقافة والبذور 30،000 خلايا كل خلية خط (J774A.1 وHT-1080) أو 20،000 الخلايا (U-118MG) إلى 2 الآبار من الشريحة الغرفة على التوالي وتنمو في 500 ميكرولتر مستنبت لل16-24 ساعة .
   5. في اليوم التالي، إضافة 100 نانومول (مبلغ الدهون النهائي) من الشفاه-Q إلى 2 قوارير في خط الخلية وكذلك واحد من كل خط الخلية على الشريحة الغرفة.نقل على الفور 1 قارورة في كل سطر الخلية إلى 4 درجات مئوية، والقارورة الثانية إلى الحاضنة.
      ملاحظة: حجم تحقيقات تضاف إلى قوارير والشرائح الغرفة هي نفسها، مما يجعل التركيز على الشرائح غرفة 10 أضعاف أعلى (5 مل هو 500 ميكرولتر مستنبت). وهذا أمر ضروري لأن الكشف المجهري هو أقل حساسية من نظام التصوير NIR مضان حيث يتم تصوير الكريات خلية من قوارير.
   6. إضافة المجاني DY-676-COOH في يعادل تركيز على المحتوى صبغ الشفاه-Q إلى الخلايا في 2 قوارير في خط الخلية وكذلك واحد من كل خط الخلية على الشريحة الغرفة، ثم نقل على الفور 1 قارورة في خط الخلية إلى 4 ° C (نضوب الطاقة) وقارورة أخرى جنبا إلى جنب مع الشريحة الغرفة إلى الحاضنة. احتضان كل الخلايا لمدة 24 ساعة في الظروف المماثلة. الخلايا في قارورة دون تحقيق تخدم السيطرة غير المعالجة كما.
3. NIRF التصوير والتحليل شبه الكمي
   1. بعد 24 ساعة مدة الحضانة، وحصاد الخلايا في قوارير عن طريق غسل الخلايا 2 مرات مع هانكس مخزنة محلول ملحي (HBSS) ثم تتخلص من الخلايا في 500 ميكرولتر HBSS وبيليه بواسطة الطرد المركزي (5 دقائق في 200 x ج) في 500 ميكرولتر أنابيب.
   2. وضع أنابيب مع الكريات الخلية (وHBSS) في تصوير NIRF والصورة باستخدام المرشحات للالإثارة (615-665 نانومتر) والانبعاثات (قطع في> 700 نانومتر).
   3. خصم تألق ذاتي وتقييم شدة هدف مقابل تألق ذاتي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وهذا يعطي مستويات شبه الكمية للكثافة مضان كما متوسط ​​إشارة (التهم تحجيم / ثانية)، التي تمثل مستويات العد بعد التوسع لمدة التعرض، وزيادة الكاميرا، binning وعمق البت، بحيث قياسات قابلة للمقارنة بين بعضها البعض.
4. التحليل المجهري متحد البؤر
   1. بعد 24 ساعة الحضانة، وحصاد الخلايا على شرائح الغرفة عن طريق غسل 2 مرات مع 500 ميكرولتر HBSS.
   2. إصلاح مLLS مع 200 ميكرولتر HBSS تحتوي على 3.7٪ (ت / ت) الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. في حين تثبيت يجري، يخفف من وصمة عار DNA، هويشت-33258 01:50 بمحلول المتزايدة.
   4. بعد التثبيت، وغسل الخلايا 2 مرات مع HBSS ثم فصل الدوائر من الشرائح الزجاجية. إضافة 50 ميكرولتر تصاعد محلول يحتوي على الحمض النووي وصمة عار على كل بقعة المقابلة لآبار الشرائح الغرفة. تغطية الخلايا مع coverslips الزجاج، وختم حواف مع طلاء الأظافر الشفاف والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة في RT (الظلام).
   5. خلايا صورة على مضان المجهر مناسبة أو المجهر متحد البؤر. استخدام الإعدادات الإثارة وانبعاث التالية لرؤية مكونات المقابلة: نوى (هويشت-33258: الإثارة 405 نانومتر، والانبعاثات 420-480 نانومتر). NBD-مخدر (liposomal الدهون: الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر). DY-676-COOH (NIR صبغة الفلورسنت: الإثارة 633-645 نانومتر، والانبعاثات 650-700 نانومتر).
      ملاحظة: تأكد من أن مضان المجهرتم تجهيز توفرة مع المرشحات المناسبة التي تسمح الإثارة وانبعاث موجات أعلى من 630 نانومتر.

استنادا الحويصلية-3. في فيفو الإسفار التصوير من التهاب

1. إعداد الحيوانات والمواد
   1. البيت القديم الأسبوع 8-12 الفئران NMRI الذكور تزن حوالي 36 غرام تحت ظروف قياسية مع بالمال وبالشهرة أيضا الطعام والماء الإعلانية.
   2. سبعة أيام قبل بداية التجارب، وإعطاء كل الفئران لنظام غذائي منخفض pheophorbide من أجل الحد من تألق ذاتي الأنسجة.
   3. قبل أربع وعشرين ساعة من بداية كل تجربة، يحلق الفئران في المنطقة المرغوبة (مثل منطقة الظهر كاملة إذا هو المطلوب التصوير وذمة هند الساق).
   4. وزن الحيوانات وحساب كمية التحقيق ليتم حقنه في الماوس (الشفاه-Q والشفاه-DQ في 10 مكرومول (تركيز الدهن) لكل كيلوغرام من وزن وخالية DY-676-COOH (أي ما يعادل صبغ محتوى الشفاه-Q تستخدم) .
   5. صورة الحيوانات فيعلى الجسم كله NIR الإسفار تصوير مع نفس الإعدادات المستخدمة في الكريات الخلية. يوفر هذا القياس تألق ذاتي من الحيوانات.
   6. حل 10 ملغ زيموزان-A في 1 مل من محلول ملحي متساوي التوتر وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. تحريض التهاب في الجسم الحي وNIRF التصوير
   1. إعداد 3 الحقن في الماوس التي تحتوي على الحلول التالية. ملء حقنة واحدة مع 50 ميكرولتر زيموزان-A حل (10 ملغ / مل)، والحقنة الثانية مع 50 ميكرولتر محلول ملحي متساوي التوتر. ملء الحقنة الثالثة مع تحقيقات، يتم فيه تحديد الشفاه-Q والشفاه-DQ (10 ميكرومول / كجم من وزن (الدهن)) للحيوانات الاختبار وخالية DY-676-COOH (تركيز كما هو الحال في الشفاه-Q) للحيوانات السيطرة. تأكد من أن يتم تخفيفه تحقيقات مع معقم HBSS إلى 150 الحجم النهائي ميكرولتر.
   2. تطبيق كريم العين على عيون الحيوانات لتجنب جفاف وتخدير الحيوانات مع 2٪ الأيزوفلورين حتى أنهم نائما بعمق ولا تتفاعل عند لمسها على الكفوف (وهذا يستغرق حوالي 2 دقيقة).
   3. ضع الماوس على حصيرة دافئة (لا يزال تحت التخدير) وحقن-A زيموزان تحت الجلد حل على الساق الخلفية اليمنى ومحلول ملحي على الساق الخلفية اليسرى. حقن مباشرة التحقيق عن طريق الوريد وصورة الحيوان بعد ذلك ثم وقت قياسي من حقن / قياس (كما ر = 0 ساعة). حفظ الصور الناتجة كما مكعبات الصورة وكرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع الحيوانات الأخرى وتحقيقات منها.
   4. صورة الحيوانات كل 2 ساعة لمدة 10 ساعة حقن آخر، ثم في 24 ساعة حقن آخر، والتأكد من أن مرحلة من غرفة القياس دافئة (على سبيل المثال، عن طريق وضع حصيرة الدافئة تحت)، وذلك لتجنب انخفاض حرارة الجسم. بعد كل قياس، ووضع الحيوانات في قفص مع الغذاء والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا ووضع القفص في غرفة الحيوان المعتدلة. الموت ببطء الحيوانات عن طريق التخدير الأول مع 2٪ الأيزوفلورين حتى الحيوانات لم تعد تستجيب للمس، ثم الموت ببطء مع ثاني أكسيد الكربون لمدة 5-10 دقيقة، مما يجعلتأكد من أن الحيوانات توقف التنفس تماما ويحدث تيبس الميت.
   5. تشريح الفئران وفقا لبروتوكولات القياسية والتي يمكن تقييمها على الانترنت (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) وصورة الأجهزة.
   6. تقييم نتائج القياس وفقا لتعليمات الشركة الصانعة التي كتبها خصم لأول مرة مضان العام للحيوانات (unmixing) ثم المناطق إسناد من الفائدة للتألق ذاتي (من اليسار الساق الخلفية مع المياه المالحة) ومضان المستهدفة من منطقة ملتهبة (الساق الخلفية اليمنى مع زيموزان-A).

النتائج

تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل NIRF صبغ DY676-COOH المستخدمة هنا في الداخل مائي من الجسيمات الشحمية يؤدي إلى مستوى عال من مضان التبريد. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت مع العديد من fluorophores في تركيز عال، يمكن استغلالها في العديد من تطبيقات التصوير الجسم الح?...

Discussion

منذ الجسيمات الشحمية ويمكن أيضا أن تكون بمثابة نظم توفير الأصباغ الفلورية، وتمكين التصوير من الأمراض المستهدفة. تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل الصبغة NIRF، DY676-COOH المستخدمة هنا، يؤدي إلى ارتفاع مستوى التبريد مضان من صبغ شرك. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials