הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

ליפוזומים נחקרו באינטנסיביות ויהוו את אחד ממערכות אספקת הסמים ביו-רפואיות ביולוגית ביותר עבור יישומים קליניים ^1,2. הם מורכבים בעיקר מפוספוליפידים וכולסטרול, אשר שניהם תרכובות ביולוגית מחקה חלקים של קרום תא טבעי. אילו יכולים לנפול בפח חומרים הידרופילי בפנים המימי, ניתן לשלב סוכני lipophilic בתוך bilayer פוספוליפידים liposomal ^3. Encapsulation של חומרים בתוך הפנים מימיים של יפוזומים מעניק הגנה מפני השפלה in vivo וגם מונע המערכת המארחת מהשפעות רעילות של תרופות ציטוטוקסיות המשמשות לטיפול במחלות, לדוגמא chemotherapeutics נועד להשמיד תאים סרטניים. השינוי של פני השטח liposomal עם פולימרים כמו polyethylenglycol (PEGylation) מרחיב עוד יותר את זמן זרימת דם liposomal in vivo בשל התייצבות sterical ^4. Moreovאה, ליפוזומים יכולים לעקל ריכוזים גבוהים של מספר חומרים כגון חלבונים ^5,6, חומרים הידרופילי ^7,8 ואנזימים ^9. לכן הם משמשים כלים טיפוליים ואבחון קליניים אמינות כמו שיזכו לאישורם למשלוח של תרופות ציטוטוקסיות כגון דוקסורוביצין לטיפול בסרטן ^4. בשל הגמישות שלהם, יכולים גם להיות טעונים יפוזומים עם fluorochromes למטרות אבחון וניתוחיים מונחות הדמיה.

הדמיה הקרינה מספקת חסכוני ולא פולשנית בכלי אבחון vivo שלעומת זאת, דורשים כמה דרישות בסיסיות. זה יכול להיות הוכיח כי יש לי fluorochromes שיתאים להדמית in vivo קליטה אופיינית ומקסימום פליטה בטווח שבי פיזור האור והפיזור, כמו גם autofluorescence רקמות שמקורן במים והמוגלובין נמוך. לפיכך, יש בדיקות כאלה מקסימום שרירי הבטן / em בין 650 ל 900 ננומטר ^10. חוץ מזה, את היציבות של fluorochromes הן במבחנה in vivo היא קריטית, כמו opsonization ופינוי מהיר יכולים להגביל את בקשתם לin vivo הדמיה ¹¹ מאוד. השפעות אחרות כגון יציבות עניה ורגישות נמוכה או תופעות רעילות לתאים באברי מטרה כפי שניתן לראות בירוק Indocyanine (ICG) ^12-16, אינן רצויות ויש לקחת בחשבון בעת תכנון בדיקות הדמיה in vivo. תצפיות אלה הובילו לפיתוח הפעיל של כמה fluorochromes פרה-קליני NIR, חלקיקים, כמו גם טכניקות חדשות להדמית in vivo של תהליכים דלקתיים, סרטן ולניתוחי מונחי תמונה ^17-20. למרות היציבות ביותר (הקרינה תת-אדום הקרובה) NIRF פרה-קליני צבעים במבחנה, זלוף המהיר והסליקה דרך הכבד והכליות לעכב את השימוש שלהם בהדמיה האופטית in vivo של מחלות ותהליכים דלקתיים.

ntent "> לכן אנו מציגים פרוטוקול לאנקפסולציה של fluorochromes כגון מאופיין היטב קרוב אינפרא אדום צבע פלואורסצנטי DY-676-COOH, ידוע בנטייתה להרוות עצמי בריכוזים גבוהים יחסית ²¹ ביפוזומים. בריכוזים גבוהים H- היווצרות ו / או דימר ואינטראקציות בין מולקולות fluorophore ממוקמות בתוך תוצאת רדיוס פורסטר של זה בהעברת פורסטר אנרגיית תהודה (סריג) בין מולקולות fluorochrome. בריכוז נמוך המרחב שבין עליות מולקולות fluorophore, ובכך למנוע אינטראקציה לערום-pi לערום-pi H-דימר היווצרות וכתוצאה מכך פליטת הקרינה גבוהה. מעבר בין ריכוז הגבוה ונמוך ומרווית הקרינה הליווי וההפעלה הוא אסטרטגיה מבטיחה שניתן לנצל להדמיה אופטית ^22. במובן זה, אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבע NIRF DY-676-COOH בפנים המימי של יפוזומים הוא יותר favorable הדמיה in vivo מהצבע החופשי. האתגר של השיטה טמונה קודם כל באנקפסולציה הנכונה ושנית, באימות של היתרונות הנובעים ממתמצתים ריכוזים גבוהים של הצבע. השוואת תכונות ההדמיה של יפוזומים הרווה עם זה של הצבע החופשי וגם עם ניסוח liposome-הרווה אינה עם ריכוזים נמוכים של הצבע היא הכרחית. אנחנו מראים בפרוטוקול לחות סרט וחול פשוט, אך יעיל מאוד בשילוב עם מחזורי הקפאה והפשרה חלופיים שאנקפסולציה של ריכוזי מרווה של DY-676-COOH ביפוזומים אינה ריאלי. שיטות אחרות המשמשות להכנה ליפוזומים כגון שיטת השלב ההפוך אידוי ^23, כמו גם את שיטת הזרקת אתנול ²⁴ לאפשר הכנת liposome עם יעילות אנקפסולציה גבוהה עבור רבים חומרים הידרופילי. עם זאת, טבעו של החומר להיות במארז יכול להשפיע על יעילות אנקפסולציה. למעשה,פרוטוקול לחות סרט וחול שהוצג כאן גילה את היעילות הגבוהה ביותר לאנקפסולציה של DY-676-COOH. כדי להמחיש את היתרונות של אנקפסולציה liposomal של DY-676-COOH, מודל בצקת נגרם על zymosan, המאפשר חקר תהליכים דלקתיים בתוך כמה שעות, היה בשימוש. כאן, הוא הוכיח כי ליפוזומים עם ריכוזים גבוהים של DY-676-COOH במארז מתאימים יותר לכל גוף בהדמיה אופטית vivo של תהליכים דלקתיים מאשר לצבוע בחינם או ניסוח liposomal-הרווה אינה עם ריכוזי צבע נמוכים. כך הפרוטוקול הבסיסי מספק שיטה פשוטה ומהירה כדי לייצר ליפוזומים ניאון הרווה והאימות של פוטנציאל ההפעלה והדמיה שלהם הן ​​במבחנה in vivo.

Protocol

הערה: כל הנהלים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים האזורית ובהתאם להנחיות בינלאומיות על השימוש האתי בבעלי חיים.

1. הכנת חומרים ומכשירים

1. הכנת פיזור שלפוחית ​​נוצר באופן ספונטני (SFV)
   1. לפזר ולהכין מלאי של פתרונות פוספוליפידים הבאים: 214 מ"ג / מיליליטר phosphatidylcholine ביצה (EPC), 134 מ"ג / מיליליטר כולסטרול, 122 מ"ג / מיליליטר 1,2-distearoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- - [methoxy (פוליאתילן גליקול) -2000] (מלח אמוניום) (MPEG _2,000 -DSPE) ו- 2 מ"ג / מיליליטר 1,2-dioleoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- - (7-ניטרו-2-1,3-benzoxadiazol-4 -yl) (מלח אמוניום) (NBD-DOPE) בכלורופורם וחנות בבקבוקוני זכוכית.
   2. לרהט כלורופורם כ 3 מיליליטר בבקבוק תחתון עגול ולהעביר את הנפח המתאים של פתרון מניות פוספוליפידים לתוך הבקבוק התחתון העגול להכין ליפוזומים מורכבים מEPC: -DSPE MPEG ₂₀₀₀ ביחס טוחנת של 6.5:: חול 3: 0.5. לתיוג הקרינה הכפול של יפוזומים להוסיף 0.3% mol NBD-DOPE לפתרון השומנים.
   3. להתאדות כלורופורם מהפתרון אורגני פוספוליפידים תחת לחץ מופחת (300 mbar) על 55 מעלות צלזיוס באמצעות מאייד סיבובי.
   4. לאחר סרט פוספוליפידים הומוגנית נוצר, להפחית את הלחץ עד 10 mbar במשך 1-2 שעות כדי להסיר הפקדת כלורופורם שיורית.
   5. בעוד כלורופורם הוא מתאדה, לפזר DY-676-COOH (6.181 מיקרומטר) ב 10 pH חיץ מ"מ טריס 7.4 ולמלא כלי דיואר עם חנקן נוזלי. לעבור על אמבטיה קולית ונקבע על 50 מעלות צלזיוס.
   6. העבר את הנפח מתאים (0.5-1 מיליליטר) של DY-676-COOH (6.181 מיקרומטר) פתרון לבקבוק התחתון העגול כדי ללחלח את הסרט היבש פוספוליפידים והמערבולת במרץ עד שלפוחית ​​נוצרה באופן ספונטני (SFV) צורות פיזור. ודא שכל פוספוליפידים הם התפזרו כדי למנוע אובדן של שומנים.
   7. tra זהירותnsfer הבקבוק התחתון העגול מכיל את פיזור SFV לחנקן נוזלי ולהקפיא את הפיזור במשך 3-5 דקות. מניחים את הבקבוק התחתון העגול לאמבטיה קולית על 50 מעלות צלזיוס להפשיר הפיזור אז מערבולת הפיזור מרץ במשך 1-2 דקות. חזור על תהליך זה שש פעמים, ובסך הכל שבעה מחזורי הקפאה והפשרה.
2. חול של SFV ליצור שלפוחית ​​liposome הומוגנית
   1. העבר את פיזור SFV לתוך מזרק 1 מיליליטר (מזרק) וextrude הפיזור דרך קרום פוליקרבונט 100 ננומטר באמצעות מכבש LiposoFast-יסוד לתוך מזרק-ב.
   2. Extrude הפיזור מהמזרק-b, חזרה למזרק, ואז לחזור על המחזור עשר פעמים. בשל חול, הפתרון בשינויים המזרק ממראה מעורפל לפיזור ברור עם זמן. לאחר עשרה מחזורים (עשרים צעדים שחול יחידים) להסיר מזרק-ב מההתקן ולמתוח את הפיזור בפעם האחרונה ממזרק ישירות לתוך סטרילי1.5 מיליליטר צינור תגובה.
3. טיהור liposomal כמוס DY-676-COOH מצבע חופשי
   1. הכן עמודת כרומטוגרפיה ג'ל באמצעות חרוזים G25 הספוגים ב( 10 סנטימטר אורך עמודה 28, קוטר 0.8 סנטימטרים) pH חיץ מ"מ טריס 7.4.
   2. העבר 0.5 מיליליטר של פיזור שלפוחית ​​extruded על מיטת ג'ל ולתת לטמיון המדגם לתוך מטריצת ג'ל.
   3. Elute יפוזומים עם 10 7.4 (איור 1 א) מ"מ טריס חיץ pH ולשטוף את הטור עד מתנקז צבע החופשי לגמרי מחוץ לטור. אם יהיה בכך צורך, לאסוף ולמחזר את הצבע בחינם על ידי desalting והתייבשות על פי הוראות היצרן.
   4. להתרכז יפוזומים eluted ידי ultracentrifugation (200,000 XG, שעת 2 ​​ב 8 ° C) ולאחר מכן לפזר אותם בנפח מספק של pH סטרילי 10 מ"מ טריס חיץ, 7.4.
4. כימות של ריכוז DY-676-COOH במארז
   1. הכן עקומת כיול על ידי המסת DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 ננומטר) ב 10 חיץ מ"מ טריס, pH 7.4 המכיל 0.1% טריטון X100.
   2. לפזר 2 μl (100 nmol שומנים סופיים של מניית / L 50 mmol) של יפוזומים במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 100 μl חיץ טריס המכיל 1% טריטון X100 להרוס את שלפוחית ​​ולשחרר את הצבע במארז. ואז לדלל דגימות עם 10 חיץ מ"מ טריס, pH 7.4 לריכוז Triton-X100 סופי של 0.1% (V / V) מה שהופך את נפח כולל של 1 מיליליטר. הכן את כל הדגימות בשני עותקים.
   3. מדוד את הבליעה ופליטה של ​​כל הדגימות (חינם DY-676-COOH וTriton-X100 טופל יפוזומים) בעירור λ = 645 nm ופליטה λ = 700 nm. להקים ולהשתמש עקומת כיול של הצבע החופשי כדי לקבוע את הריכוז של צבע במארז.
5. אפיון Liposome
   1. לקבוע את פוטנציאל הגדלים וzeta של יפוזומים על ידי פיזור אור דינאמי. לדלל את דגימות liposomal עם המסנן מעוקר (0.2 מיקרומטר) pH חיץ 10 מ"מ טריס 7.4 לaconcentration של 100-300 מיקרומטר (שומנים בדם). העברת הדגימות מדוללת לקובט חד פעמי בנפח נמוך ולמדוד את המדגם על פי הוראות היצרן.
   2. לאפיין את יפוזומים על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים על מנת לבסס את הגודל, היושרה וההומוגניות של שלפוחית ​​liposomal על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

2. אישור של הקרינה-מרווה והפעלה של יפוזומים מוכנים

1. ניתוח physicochemical של מרווה הקרינה והפעלה
   1. הכן שני צינורות 1.5 מיליליטר לLip-Q ו- 2 צינורות לDY-676-COOH החופשי. 100 nmol שומני ההעברה כולל (2.38 μl של פתרון מניות / L Lip-Q 42 mmol, המכיל 138 מיקרוגרם / מיליליטר של DY-676-COOH במארז) לצינורות המתאימים. העבר את המקבילה DY-676-COOH חופשי לתוכן הצבע של השפתיים-Q (0.38 מיקרוגרם שהתוצאה למשל מ 138 מיקרוגרם / μl 1000 x 2.38 μl Lip-Q בשימוש). דגירה אמבטיה אחדדואר של כל בדיקה על 4 מעלות צלזיוס ולהקפיא את הצינור השני ב -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה (16 שעות).
   2. לחמם בלוק חימום עד 30 מעלות צלזיוס. מלא תיבת קירור עם קרח כתוש ולאזן aliquot של pH חיץ 10 מ"מ טריס 7.4 לטמפרטורת חדר.
   3. הסר בדיקות מ4 ° C ולאזן בטמפרטורת חדר (עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור) ובמהירות להפשיר בדיקות מ-80 ° C ב 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צ'יל הבדיקות מופשרות על קרח דק 1 לפני העברתן לטמפרטורת חדר (גם עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור).
   4. הוסף 10 חיץ מ"מ טריס (pH 7.4) לכל אחד מהבדיקות עד 100 נפח סופי μl ולאזן את כל הבדיקות בבית RT במשך 10 דקות.
   5. פיפטה 80 μl של כל בדיקה לקובט זכוכית בנפח נמוך ולמדוד את הספיגה של כל בדיקה 400-900 ננומטר בספקטרומטר. להחזיר את הבדיקה לצינורות המתאימים שלהם.
   6. העבר את 80 μl של כל בדיקה לקובט זכוכית מתאימהולמדוד את פליטת הקרינה על ידי spectrofluorometer מרגשות הבדיקות בבית 674 ננומטר ומדידת הקרינה 694-800 ננומטר.
2. ספיגת הקרינה סלולרית והפעלה
   1. קבל ותרבות שורות התאים הבאות בתקשורת והתרבות המקבילה שלהם בהתאם לתנאים סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO ₂ ו -95% אווירת humidified). כאן, השתמש בJ774A.1 שורת תאי מקרופאג העכברית (שונה הבינוני של הנשר בתוספת 10% (V / V) בסרום עגל עוברי של Dulbecco), קו תא גליובלסטומה אדם, U-118MG (ממ המכיל ויטמינים חיוניים ו -10% (v / v) בסרום עוברי עגל) וקו תא fibrosarcoma האנושי, HT-1080 (RPMI עם 5% FCS).
   2. שקופיות קאמריות מעיל 8-גם עם פולי-L ליזין (להוסיף 100 μl 0.001% פולי-L ליזין היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. פתרון לשאוב ולתת השקופיות קאמריות להתייבש לפחות 4 hr ב RT על שולחן עבודה סטרילית. יש לשטוף את השקופיות קאמריות 3פעמים עם תמיסת מלח שנאגרו של 200 μl האנק אז לאטום אותם עם פרפין ורדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 ° C עד צורך.
   3. בעוד השקופיות קאמריות מתייבשות, המסנן לעקר יפוזומים ופתרון צבע ולאחסן ב 4 ° C עד הצורך.
   4. לניתוח ספיגת בדיקה עם כל הגוף במערכת ההדמיה הקרינה vivo NIR, להכין 5 צלוחיות קטנות תרבות לכל אחת משורות תאי 3 מבחן (15 צלוחיות בסך הכל). הזרע 2 x 10 ⁶ J774A.1, U-118MG ותאי HT-1080 לכל בקבוק תרבות עם 5 מיליליטר של מדיום תרבות בהתאמה (בquintuples) ולגדול במשך 16-24 שעות. במקביל לצלוחיות התרבות, זרע 30,000 תאים של כל שורת תא (J774A.1 וHT-1080) או 20,000 תאים (U-118MG) 2 בארות של חדר שקופיות בהתאמה ולגדול במדיום תרבות 500 μl במשך 16-24 שעות .
   5. ביום שלמחרת, להוסיף 100 nmol (כמות שומנים סופית) של Lip-Q 2 צלוחיות בכל שורת תא וגם אחד מכל שורת תאים בתא השקופיות.מייד להעביר בקבוק 1 בכל שורת תא עד 4 מעלות צלזיוס והבקבוק השני חזרה לחממה.
      (5 מיליליטר הוא 500 מדיום תרבות μl) הנפח של הבדיקות נוספות לצלוחיות והשקופיות קאמריות הן אותו הדבר, מה שהופך את הריכוז בתא שקופיות גבוה פי 10: הערה. זה נחוץ משום הגילוי מיקרוסקופי הוא פחות רגיש ממערכת ההדמיה הקרינה NIR בי כדורי תא מהצלוחיות הם צילמו.
   6. הוסף את DY-676-COOH החופשי במקביל ריכוז לתוכן הצבע של השפתיים-Q לתאים בכל שורת 2 צלוחיות תא וגם אחד מכל שורת תאים בתא השקופיות, ולאחר מכן להעביר בקבוק 1 בכל שורת תאים באופן מיידי ל4 ° C (דלדול אנרגיה) והבקבוק האחר יחד עם השקופיות קאמריות חזרה לחממה. דגירה כל התאים למשך 24 שעות בתנאים המקביל. תאי הבקבוק בלי בדיקה ישמשו כקבוצה ביקורת.
3. הדמיה NIRF וניתוח חצי כמותית
   1. לאחר 24 משך דגירה שעה, לקצור את התאים בצלוחיות על ידי שטיפת תאים 2 פעמים עם הנקס שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) ולאחר מכן לגרד תאים ב 500 μl HBSS וגלול על ידי צנטריפוגה (5 דק 'ב 200 XG) ב 500 צינורות μl.
   2. מניחים את הצינורות עם כדורי התא (וHBSS) בתרמי NIRF ומסננים באמצעות תמונה לעירור (615-665 ננומטר) ופליטה (חתך ב> 700 ננומטר).
   3. לנכות autofluorescence ולהעריך את עוצמת היעד לעומת autofluorescence בהתאם להוראות יצרן. זה ייתן לי הרמות חצי כמותית של עוצמת הקרינה כאות ממוצעת (ספירה טיפסה / sec), המייצגת את רמות ספירה לאחר שינוי קנה המידה לזמן חשיפה, רווח מצלמה, binning ועומק סיבית, כך שהמדידות הן להשוות בין זה לזה.
4. ניתוח מיקרוסקופי confocal
   1. אחרי 24 שעות דגירה, לקצור את התאים על שקופיות קאמריות על ידי שטיפת 2 פעמים עם 500 μl HBSS.
   2. תקן CELLS עם 200 μl HBSS המכיל 3.7% (v / v) פורמלדהיד למשך 30 דקות ב RT.
   3. בעוד הקיבעון קורה, לדלל את כתם DNA, Hoechst-33258 1:50 פתרון הרכבה.
   4. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים 2 פעמים עם HBSS אז להפריד את התאים משקופיות הזכוכית. הוספת פתרון הרכבה 50 μl המכיל DNA-הכתם על כל נקודה המתאימה לבארות של השקופיות קאמריות. לכסות את התאים עם coverslips זכוכית, לאטום קצוות עם לק השקוף ואוויר יבש במשך 10 דקות ב RT (כהה).
   5. תאי תמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים או מיקרוסקופ confocal. השתמש בהגדרות הבאות העירור ופליטה להדמיה של הרכיבים המקביל: הגרעינים (Hoechst-33258: עירור 405 ננומטר, פליטה 420-480 ננומטר). NBD-DOPE (שומנים בדם liposomal: ננומטר עירור 488, פליטת 530 ננומטר). DY-676-COOH (צבע פלואורסצנטי NIR: nm 633-645 העירור, פליטת 650-700 ננומטר).
      הערה: ודא שמיקרוסקופ פלואורסצנטיvailable מצויד במסננים מתאימים המאפשרים עירור ופליטה של ​​אורכי גל גבוה יותר מאשר 630 ננומטר.

3. Liposome מבוסס בVivo דימות פלואורסצנטי של דלקת

1. הכנה של בעלי חיים וחומרים
   1. בית 8-12 שבועות בן עכברי זכרי NMRI במשקל כ 36 גרם בתנאים סטנדרטיים עם כרצונך מזון ומים.
   2. שבעה ימים לפני תחילת ניסויים, לתת את כל עכברי דיאטת pheophorbide נמוכה על מנת לצמצם autofluorescence רקמות.
   3. עשרים וארבע שעות לפני תחילת כל ניסוי, לגלח עכברים באזור הרצוי (למשל, אזור גב כל אם הדמיה של בצקת רגל האחורית היא רצויה).
   4. לשקול את בעלי החיים ולחשב את כמות הבדיקה כדי להיות מוזרק לכל עכבר (Lip-Q וLip-DQ ב 10 μmol (ריכוז שומנים בדם) לכל קילוגרם משקל וחופשי DY-676-COOH (שווה ערך ל לצבוע תוכן של-Q שפתיים בשימוש) .
   5. תמונת בעלי החיים בתרמי NIR הקרינה גוף כולו עם אותן ההגדרות המשמשות לכדורי התא. מדידה זו מספקת autofluorescence של בעלי החיים.
   6. לפזר 10 מ"ג zymosan-ב 1 מיליליטר תמיסת מלח איזוטוני ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
2. אינדוקציה של דלקת ובהדמית NIRF vivo
   1. הכן 3 מזרקים לכל עכבר המכילים את הפתרונות הבאים. מלא מזרק אחד עם 50 zymosan-פתרון μl (10 מ"ג / מיליליטר) ואת המזרק השני עם תמיסת מלח איזוטוני 50 μl. מלא את המזרק השלישי עם הבדיקות, לפי Lip-Q וLip-DQ (10 μmol / משקל קילוגרם (שומנים בדם)) מיועדים לבעלי חיים בדיקה וחופשי DY-676-COOH (ריכוז כמו בשפות-Q) לבעלי חיים שליטה. ודא שהבדיקות הן בדילול עם HBSS סטרילי 150 נפח סופי μl.
   2. החל קרם עיניים בעיניים של בעלי חיים כדי למנוע יובש ולהרדים חיות עם isoflurane 2% עד שהם שקועים בשינה עמוקה ולא מגיב כאשר נגעו בכפות (זה לוקח בערך 2 דקות).
   3. מניחים את העכבר על מחצלת חמה (עדיין תחת הרדמה) ולהזריק zymosan-תת עורי פתרון ברגל האחורית הימנית ותמיסת מלח על הרגל האחורית השמאלית. מייד להזריק לוריד ובדיקת תמונת החיה לאחר מכן לאחר מכן זמן שיא של הזרקה / מדידה (כt = 0 שעה). שמור את התמונות וכתוצאה מכך כקוביות תמונה וחזור על השלבים לעיל עבור כל בעלי החיים האחרים והבדיקות המתאימות.
   4. תמונת בעלי החיים בכל שעה 2 לאחר הזרקה לשעה 10 ולאחר מכן ב 24 שעות לאחר הזרקה, ולוודא כי השלב של חדר המדידה הוא חם (למשל, על ידי הצבת מחצלת חמה מתחת), על מנת להימנע מהיפותרמיה. לאחר כל מדידה, למקם את החיות בכלוב עם כרצונך מזון ומי מודעה ולמקם את הכלוב בתא בעלי חיים ממוזג. להרדים בעלי החיים על ידי ההרדמה הראשונה עם 2% isoflurane עד בעלי החיים כבר לא מגיבים למגע, ואז להרדים עם פחמן דו חמצני למשך 5-10 דקות, מה שהופך אתבטוח שבעלי החיים להפסיק לנשום לחלוטין וצפידים מתרחש.
   5. לנתח את העכברים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים שניתן להעריך באינטרנט (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) ותמונת האיברים.
   6. להעריך את תוצאות המדידה על פי הוראות יצרן על ידי ניכוי הקרינה הכוללת של בעלי החיים (unmixing) אז אזורי הקצאה של העניין לautofluorescence (משמאל רגל אחורית עם מי מלח) וקרינת היעד של אזור המודלק (רגל אחורית תקין עם zymosan-) הראשון.

תוצאות

אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון DY676-COOH צבע NIRF משמש כאן בפנים המימי של יפוזומים מובילה לרמה גבוהה של הקרינה מרווה. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה, ניתן לנצל בכמה יישומי ההדמיה vivo בי רגישות גבוהה וזיהוי אמין של אזור היעד הם ?...

Discussion

מאז יפוזומים גם יכולים לשמש כמערכות אספקה ​​לצבעי ניאון, הם מאפשרים הדמיה של מחלות יעד. אנקפסולציה של ריכוזים גבוהים של צבעי ניאון כגון צבע NIRF, DY676-COOH משמש כאן, מובילה לרמה גבוהה של מרווה הקרינה של הצבע וממולכד. מרווה הקרינה, תופעה ראתה עם fluorophores רבות בריכוז גבוה יכול?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials