Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для<em&gt; В Vivo</em&gt; Оптических изображений

Резюме

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Аннотация

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Введение

Липосомы интенсивно исследовали и служить в качестве одного из наиболее биосовместимых биомедицинских систем доставки лекарственных средств для клинического применения ^1,2. Они, в основном, состоит из фосфолипидов и холестерина, оба из которых являются биосовместимыми соединения, имитирующие части природных клеточных мембран. В то время как гидрофильные вещества могут быть заключены в водном внутреннем пространстве, липофильные агенты могут быть включены в липосомальной фосфолипидный бислой ^3. Инкапсуляция веществ в водном внутреннем пространстве липосом предоставляет защиту от деградации в естественных, а также предотвращает хост-системы от токсических эффектов цитотоксических лекарственных средств, используемых для лечения заболеваний, например химиотерапевтических направленных на разрушение опухолевых клеток. Модификация липосомной поверхности полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) дополнительно увеличивает время циркуляции крови в липосомальной естественных вследствие стерических стабилизации ^4. Moreovэр, липосомы могут улавливания высокие концентрации различных веществ, таких как белки ^5,6, гидрофильных веществ и ферментов ^{7,8 9.} Таким образом, они служат в качестве надежного клинического лечебно-диагностические инструменты, которые заслуживают свое согласие на поставку цитотоксических препаратов, таких как доксорубицин для лечения рака ^4. Благодаря своей гибкости, липосомы также могут быть загружены с флуорохромами для диагностических и графических наведением хирургических целей.

Флуоресцентной томографии обеспечивает экономически эффективный и неинвазивный в естественных условиях диагностического инструмента, которые, однако, требует некоторых основных требований. Это может быть продемонстрировано, что флуорохромы, которые подходят лучше для визуализации в естественных условиях имеют характеристическое поглощение и максимумов излучения в диапазоне, где дисперсия света и рассеяния, а также ткани аутофлюоресценция, происходящих из воды и гемоглобина является низким. Таким образом, такие датчики имеют свою абс / EM максимумов между 650 и 900 нм ^10. Кроме того, стабильность флуорохромов в пробирке и в естественных условиях имеет решающее значение, так как опсонизация и быстрое оформление может значительно ограничить их применение для естественных изображений в ^11. Другие эффекты, такие как плохой стабильностью и низкой чувствительности или цитотоксических эффектов на органы-мишени, как видно с индоцианина зеленого (ICG) ^12-16, являются нежелательными и должны быть приняты во внимание при разработке зондов для визуализации в естественных условиях. Эти наблюдения привели к активному развитию нескольких доклинических NIR флуорохромии наночастиц, а также новых методов для визуализации в естественных условиях воспалительных процессов, рака и для имиджа наведением хирургии ^17-20. Несмотря на стабильность большинства доклинических NIRF (ближней инфракрасной флуоресценции) красителей в пробирке, их быстрое перфузии и оформление через печень и почки препятствовать их использование в в естественных условиях оптической визуализации заболеваний и воспалительных процессов.

ntent "> Поэтому мы приводим протокол для инкапсуляции флуорохромами, таких как хорошо охарактеризованы в ближней инфракрасной области флуоресцентным красителем DY-676-COOH, известный своей склонностью к себе закалки при относительно высоких концентрациях ²¹ в липосомы. При высоких концентрациях Н димеров и / или пи-укладки взаимодействия между молекулами флуорофора, расположенных в пределах Ферстер результате друг друга радиуса в Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) между флуорохромом молекул. При малой концентрации пространство между увеличением молекул флуорофорные, тем самым предотвращая пи-укладки взаимодействия и Н-димеров и приводит к высокой эмиссии флуоресценции. переключение между высокой и низкой концентрации и прилагаемых тушение флуоресценции и активации является многообещающей стратегией, которая может быть использована для оптического изображения ^22. В этом отношении, инкапсуляция высоких концентраций красителя NIRF DY-676-COOH в водном внутреннем липосом является более FAvorable для визуализации в естественных условиях, чем свободного красителя. Задача метода заключается в первую очередь в правильном инкапсуляции и, во-вторых, в проверке преимущества, вытекающие из инкапсуляции высокие концентрации красителя. Сравнивая свойства изображений закаленных липосом с этим свободного красителя, а также с не останавливают липосомной композиции с низким содержанием красителя не обойтись. Покажем на простом, но очень эффективном фильм гидратации и экструзии протокола в сочетании с альтернативными замораживания и оттаивания, что инкапсуляция тушения концентрации DY-676-COOH в липосомы возможно. Другие способы, используемые для получения липосом, такие как метод с обращенной фазой испарения ^23, а также методом впрыска этанола ²⁴ включить липосомного препарата с высокой эффективностью инкапсуляции для многих гидрофильных веществ. Однако природа вещества, которое необходимо инкапсулировать может влиять на эффективность инкапсуляции. В действительности,Фильм гидратации и экструзии протокол, представленные здесь показал высокую эффективность для инкапсуляции DY-676-COOH. Чтобы проиллюстрировать преимущества липосомальной инкапсуляции DY-676-COOH, в зимозаном-индуцированного отека модели, которая позволяет изучать воспалительных процессов в течение нескольких часов, был использован. Здесь показано, что липосомы с высокой концентрацией инкапсулированного DY-676-COOH являются более подходящими для всего тела в естественных условиях оптической визуализации воспалительных процессов, чем свободного красителя или не-гасили липосомной композиции с концентрацией низких красителей. Таким образом, основной протокол обеспечивает простой и быстрый способ получения закаленных люминесцентные липосомы и проверку их активации и визуализации потенциала как в пробирке и в естественных условиях.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры утверждаются областным комитетом животных и в соответствии с международными стандартами по этическим использования животных.

1. Подготовка материалов и инструментов

1. Подготовка спонтанно образуется пузырек дисперсии (SFV)
   1. Растворить и подготовить исходные растворы следующих фосфолипидов: 214 мг / мл яичного фосфатидилхолина (ЕРС), 134 мг / мл холестерина, 122 мг / мл 1,2-distearoyl- Sn глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [метокси (полиэтиленгликоль гликоль) -2000] (соль аммония) (MPEG ₂₀₀₀ -DSPE) и 2 мг / мл 1,2-dioleoyl- SN глицеро-3-phosphoethanolamine- N - (7-нитро-2-1,3-benzoxadiazol-4 ил) (соль аммония) (NBD-DOPE) в хлороформе и в магазине в стеклянных флаконах.
   2. Отделка примерно 3 мл хлороформа в круглодонную колбу и передавать соответствующий объем раствора фосфолипида в круглодонную колбу, чтобы подготовить липосомы, состоящие из ЕРС: Чхор: MPEG ₂₀₀₀ -DSPE в молярном соотношении 6,5: 3: 0,5. Для двойной флуоресценции маркировки липосом добавить 0,3 моль% НБД-DOPE в липидной раствора.
   3. Упаривают хлороформ из органического раствора фосфолипида при пониженном давлении (300 мбар) при 55 ° С с помощью роторного испарителя.
   4. После однородный фосфолипид пленка образуется, уменьшить давление до 10 мбар в течение 1-2 ч, чтобы удалить остаточный депозит хлороформом.
   5. В то время как хлороформ выпариванием, растворяют DY-676-COOH (6,181 мкМ) в 10 мМ Трис-буфера, рН 7,4, и заполнить сосуд Дьюара с жидким азотом. Переключатель на ультразвуковой бане и установлен на 50 ° C.
   6. Передача соответствующий объем (0,5-1 мл) DY-676-COOH (6,181 мкМ) раствора в круглодонную колбу дл гидратации сухого фосфолипидов пленки и вихрь энергично, пока спонтанно формируется пузырек (SFV) дисперсии форм. Убедитесь, что все фосфолипиды диспергированы, чтобы избежать потери липидов.
   7. Тщательно траnsfer круглодонную колбу, содержащую дисперсию SFV в жидкий азот и заморозить дисперсию в течение 3-5 мин. Поместите круглодонную колбу в ультразвуковой бане при 50 ° С, чтобы растопить дисперсию затем вихрь дисперсию энергично в течение 1-2 мин. Повторите эту процедуру шесть раз, делая в общей сложности семь замораживания и оттаивания.
2. Экструзия SFV, чтобы сформировать однородные липосом пузырьки
   1. Передача дисперсии SFV в 1 мл шприца (шприц-а), и прессовать дисперсии через поликарбонатную мембрану 100 нм с использованием LiposoFast-Базовая экструдера в шприц-B.
   2. Выдавите дисперсии от шприца-б, обратно в шприц-а, затем повторите цикл десять раз. Благодаря экструзии, раствор в шприц из изменений в туманной внешнему виду четкой дисперсии во времени. После десяти циклов (двадцать отдельные шаги в профиле) удалить шприц-б от устройства и выдавите дисперсию в течение последнего времени от шприца непосредственно в стерильный1,5 мл реакционной трубки.
3. Очистка липосомальных инкапсулированные DY-676-СООН от свободного красителя
   1. Приготовьте на колонке с силикагелем, используя шарики G25 смоченные в 10 мМ Трис-буфер рН 7,4 (колонка длиной 28 см, диаметр 0,8 см).
   2. Передача 0,5 мл экструдированного дисперсии пузырьков на кровать гель и пусть слива пробы в гелевой матрице.
   3. Элюируйте липосом с 10 мМ трис-буфера, рН 7,4 (фиг.1А) и не промывки колонки до тех пор, канализацию свободного красителя полностью из колонны. Если это будет необходимо, собирать и перерабатывать бесплатный красителя, обессоливания и обезвоживания в соответствии с инструкциями изготовителя.
   4. Концентрат элюированной липосом с помощью ультрацентрифугирования (200000 х г, 2 ч при 8 ° С), а затем диспергировать их в надлежащем объеме стерильной 10 мМ Трис буфера, рН 7,4,.
4. Количественное инкапсулированного концентрации DY-676-COOH
   1. Подготовка калибровочной кривой путем растворения DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 нМ) в 10 мМ трис-буфера, рН 7,4, содержащем 0,1% Triton X100.
   2. Растворить 2 мкл (100 нмоль окончательного липида из 50 ммоль / л наличии) липосом в течение 5 мин при комнатной температуре в 100 мкл трис-буфера, содержащего 1% Triton X100, чтобы разрушить пузырьки и освободить инкапсулированный краситель. Затем разбавленные образцы с 10 мМ трис-буфера, рН 7,4 до конечной концентрации Тритон-X100 0,1% (об / об), что делает общий объем 1 мл. Подготовка всех образцов в двух экземплярах.
   3. Измерьте поглощение и испускание всех образцов (бесплатно DY-676-СООН и Тритон-X100 лечение липосомы) на возбуждение λ = 645 нм и эмиссии λ = 700 нм. Создание и использование калибровочной кривой свободного красителя для определения концентрации инкапсулированного красителя.
5. Липосомы характеристика
   1. Определить размеры и дзета-потенциал липосом динамического рассеяния света. Развести образцы липосомальных с фильтром стерилизованного (0,2 мкм) 10 мМ Трис-буфер рН 7,4 в переменного токаoncentration 100-300 мкм (липидов). Передача разбавленных образцов в низких объемов располагаемых кювету и измеряют образец в соответствии с инструкциями изготовителя.
   2. Определение характеристик липосом с помощью электронного микроскопа, чтобы подтвердить размер, целостность и однородность липосомальных везикул в соответствии со стандартными протоколами.

2. Проверка флуоресценции закалки и активация готовых липосом

1. Физико-химический анализ флуоресценции закалки и активации
   1. Приготовьте два 1,5 мл трубы для губ-Q и 2 трубы для свободного DY-676-COOH. Передача 100 нмоль общих липидов (2,38 мкл 42 ммоль / л для губ-Q маточного раствора, содержащие 138 мкг / мл инкапсулированного DY-676-COOH) в соответствующих трубах. Трансфер бесплатный DY-676-СООН эквивалент к содержимому красителя для губ-Q (0,38 мкг, что приводит, например, от 138 мкг / 1000 мкл х 2,38 мкл Лип-Q используется). Выдержите одна ваннае каждого зонда при 4 ° С и заморозить второй трубки при температуре -80 ° С в течение ночи (16 ч).
   2. Нагревают нагревательный блок до 30 ° С. Заполните охлаждающей коробку с колотым льдом и уравновешивают аликвоту 10 мМ трис-буфера с рН 7,4 при комнатной температуре.
   3. Удалить зонды из 4 ° С и уравновешивают при комнатной температуре (заворачивали в алюминиевую фольгу для защиты от света) и быстро оттаивают зондов от -80 ° С при 30 ° С в течение 5 мин. Холод талой зондов на льду в течение 1 мин перед передачей их до комнатной температуры (также заворачивали в алюминиевую фольгу для защиты от света).
   4. Добавить 10 мМ трис-буфера (рН 7,4) для каждого из зондов к 100 мкл конечного объема, и равновесие все зонды при комнатной температуре в течение 10 мин.
   5. Внесите 80 мкл каждого зонда в стеклянной кювете малого объема и измерения поглощения каждого зонда от 400-900 нм на спектрометре. Вернуться зонд для соответствующих труб.
   6. Передача 80 мкл каждого зонда в подходящую стеклянную кюветуи измерить излучение флуоресценции на спектрофлуорометра, возбуждая датчиков на 674 нм и измерения флуоресценции от 694-800 нм.
2. Клеточного поглощения и активация флуоресценции
   1. Получить и культура следующие клеточные линии в их соответствующей культуральной среде в соответствии со стандартными условиями (37 ° С, 5% СО ₂ и 95% увлажненной атмосфере). Здесь используют мышиные линии клеток макрофагов J774A.1 (Дульбекко модифицированной среде Игла, дополненной 10% (об / об) фетальной сыворотки теленка), линии клеток глиобластомы человек, U-118MG (MEM, содержащей необходимые витамины и 10% (об / V) эмбриональной телячьей сыворотки) и линии клеток человека фибросаркомы, HT-1080 (RPMI с 5% FCS).
   2. Пальто 8-а камера скользит с поли-L-лизина (добавить 100 мкл 0,001% поли-L-лизин в каждую лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. Решение набирая и пусть камерные слайды высохнуть в течение по крайней мере 4 ч при комнатной температуре на стерильной верстаке. Промойте камеры слайды 3раза забуференным солевым раствором 200 мкл Хэнка затем запечатать их парафином и алюминиевой фольги и хранят при температуре 4 ° С до необходимости.
   3. В то время как камера скользит иссякают, фильтр-стерилизации липосом и раствор красителя и хранить при 4 ° С до необходимости.
   4. Для поглощения зонд анализа со всем телом в естественных условиях NIR системы флуоресцентной томографии, подготовить 5 небольших флаконах для культуры для каждой из линий 3 тестовых клеток (15 колбы в общей сложности). Семена 2 × 10 ⁶ J774A.1, U-118MG и HT-1080 клеток на колбу культуры с 5 мл соответствующей культуральной среды (в пятерок) и расти в течение 16-24 ч. Параллельно с колбы с культурой, семена 30000 клеток каждой клеточной линии (J774A.1 и HT-1080) или 20000 клеток (U-118MG) 2 лунки камеры слайд, соответственно, и расти в 500 мкл культуральной среды в течение 16-24 часов ,
   5. На следующий день, добавить 100 нмоль (окончательная сумма липидов) губы-Q 2 колбы на клеточной линии и одну лунку каждой клеточной линии на камеру слайда.Сразу передачи 1 колбу на одну клеточную линию до 4 ° С и вторую колбу обратно в инкубатор.
      Примечание: объем зондов добавляют в колбы и камера скользит те же, что делает концентрацию на камере слайдов 10 раз выше (5 мл до 500 мкл культуральной среды). Это необходимо потому, что Микроскопическое исследование является менее чувствительным, чем система визуализации флуоресценции NIR, где сотовые таблетки из колб в образ.
   6. Добавьте бесплатный DY-676-COOH в концентрации, эквивалентной к содержанию красителя для губ-Q к клеткам в 2 колбы на клеточной линии и одну лунку каждой клеточной линии на камеру слайд, а затем немедленно передать 1 флакон на одну клеточную линию 4 ° C (истощение энергии), а другой колбу вместе с камерой скользить назад в инкубатор. Инкубируйте все клетки в течение 24 ч при соответствующих условиях. Клетки в колбе без зонда служат в качестве необработанного контроля.
3. NIRF изображений и полуколичественный анализ
   1. После 24 продолжительности инкубационного ч, урожай клеток в колбах промывкой клеток 2-го раза Хенкса раствор соли (HBSS), то скрести клеток в 500 мкл HBSS и осадок центрифугированием (5 мин при 200 мкг) в 500 мкл трубки.
   2. Место труб с клеточного осадка (и ССРХ) в тепловизора NIRF и изображения с помощью фильтров для возбуждения (615-665 нм) и эмиссии (CUT IN> 700 нм).
   3. Минус аутофлуоресценцию и оценить интенсивность цели по сравнению с автофлуоресценции соответствии с инструкциями производителя. Это даст полуколичественного уровней интенсивности флуоресценции как среднего сигнала (в пересчете имп / сек), который представляет уровнях насчитывается после масштабирования для времени экспозиции, увеличение камеры, биннинга и битовой глубины, так что измерения сопоставимы друг с другом.
4. Конфокальной микроскопический анализ
   1. После 24 ч инкубации сбора клеток на камерных промыванием слайдов 2 раза с 500 мкл HBSS.
   2. Закрепите CEзаполняет с 200 мкл HBSS, содержащего 3,7% (об / об) формальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре.
   3. В то время как фиксация происходит, разбавить пятно ДНК, Hoechst-33258 1:50 с монтажной решения.
   4. После фиксации промыть клетки 2 раза ССРХ затем отделить камер от стеклянных слайдов. Добавить 50 мкл раствора, содержащего монтажную ДНК-пятно на каждой точке, соответствующей лунки камеры слайдов. Обложка клетки с покровные стекла, печать края с прозрачным лаком для ногтей и воздушно-сухой в течение 10 мин при комнатной температуре (темный).
   5. Клетки изображение на подходящем флуоресцентного микроскопа или конфокальной микроскопии. Используйте следующие параметры возбуждения и эмиссии для визуализации соответствующих компонентов: ядра (Hoechst-33258: возбуждение 405 нм, эмиссия 420-480 нм). НБД-DOPE (липосомальной липид: возбуждение 488 нм, излучение 530 нм). DY-676-COOH (NIR флуоресцентный краситель: возбуждение 633-645 нм, эмиссия 650-700 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флуоресцентный микроскопмодели шириной оснащен соответствующих фильтров, которые позволяют возбуждение и эмиссию длин волн выше, чем 630 нм.

3. на основе липосом in vivo с флуоресцентной визуализации воспаления

1. Получение животных и материалов
   1. Дом 8-12-недельных самцов мышей NMRI весом примерно 36 г в стандартных условиях с пищей и водой вволю.
   2. Через семь дней до начала экспериментов, дают все мыши низкую феофорбид диету, чтобы уменьшить ткани аутофлюоресценция.
   3. Через двадцать четыре часа до начала каждого эксперимента, брить мышей в желаемой области (например, всю заднюю область, если изображения отека задней ноги желательно).
   4. Взвешивание животных и рассчитать количество зонда, который будет введен на мышь (Lip-Q и Lip-DQ на 10 мкмоль (концентрации липидов) на кг массы и свободного DY-676-COOH (эквивалент для окрашивания содержание губ-Q используется) ,
   5. Изображение животных вВсе тело NIR флуоресценции тепловизор с теми же настройками, используемыми для сотовых гранул. Это измерение обеспечивает аутофлюоресценция животных.
   6. Растворите 10 мг зимозаном-A в 1 мл изотонического солевого раствора и хранить в течение ночи при 4 ° С.
2. Индукция воспаления и в естественных NIRF изображений
   1. Подготовьте 3 шприцы на мышь, содержащие следующие решения. Заполните один шприц с 50 мкл зимозаном раствора (10 мг / мл), а второй шприц с 50 мкл изотонического солевого раствора. Заполните третий шприц с зондами, в результате чего Lip-Q и Lip-DQ (10 мкмоль / кг массы (липидный)) предназначены для подопытных животных и бесплатным DY-676-COOH (концентрации, как в Лип-Q) для контрольных животных. Убедитесь, что зонды разбавляют стерильной HBSS до 150 мкл конечного объема.
   2. Нанесите крем для глаз на глазах животных, чтобы избежать сухости и обезболить животных с 2% изофлуран пока они глубоко спит и не реагируют при прикосновении на лапах (Это займет около 2 мин).
   3. Наведите на теплой коврик (еще под наркозом) и ввести зимозаном решение подкожно на правой задней ноги и солевой раствор на левой задней ноге. Сразу вводят зонд внутривенно и изображение животного после затем рекордное время впрыска / измерения (как Т = 0 ч). Сохраните полученные изображения как изображение кубиков и повторите эти шаги для всех других животных и соответствующих датчиков.
   4. Image животные каждые 2 ч в течение после инъекции 10 ч, а затем в 24 ч после инъекции, убедившись, что этап измерительной камере тепло (например, путем размещения теплый коврик под) для того, чтобы избежать переохлаждения. После каждого измерения, установите животных в клетке с пищей и водой вволю и поместить клетку в умеренном камеры животных. Усыпить животных от первого обезболивающие с 2% изофлуран до животные больше не реагируют на ощупь, то усыпить углекислым газом в течение 5-10 мин, что делаетУбедитесь, что животные полностью остановить дыхание и трупное окоченение происходит.
   5. Проанализируйте мышей в соответствии со стандартными протоколами, которые могут быть использованы для определения в Интернете (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) и изображение органов.
   6. Оценка результатов измерений в соответствии с инструкциями изготовителя сначала вычитанием общего флуоресценции животных (расслоение), то назначая регионах, представляющих интерес для флуоресценции (левой задней лапы с физиологическим раствором) и целевой флуоресценции воспаленной области (правой задней лапы зимозаном-A).

Результаты

Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как NIRF красителя DY676-COOH используемых здесь, в водном внутреннем пространстве липосом приводит к высоким уровнем тушения флуоресценции. Шение флуоресценции, явление видели со многими флуорофорами в высокой концентра?...

Обсуждение

Поскольку липосомы могут также служить в качестве систем доставки для флуоресцентных красителей, они дают возможность визуализации целевых заболеваний. Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как краски, NIRF DY676-COOH используемых здесь, приводит к высокому у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials