العزلة وإثراء الإنسان الدهنية المشتقة من خلايا انسجة لتعزيز تكون العظم

Summary

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Abstract

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Introduction

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على جميع عينات المرضى للموافقة المسبقة عن، وتم استعراض البروتوكولات التجريبية والمعتمدة من قبل جامعة ستانفورد مجلس المراجعة المؤسسية (بروتوكول # 2188 و # 9999).

1. عزل خلية والثقافة:

1. الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد الإنسان من المرضى من النساء الأصحاء تمر lipoaspiration الاختيارية من البطن، الجناح، و / أو منطقة الفخذ تحت تخدير موضعي / عام. تأكد من أن مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) الموافقة قد تم الحصول عليها عن بروتوكول لعزل ASCS من الأنسجة البشرية، واتباع احتياطات السلامة المؤسسية بينما كان يعمل مع مثل هذه المواد.
2. للحصول على صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية lipoaspirated، وغسل لأول مرة lipoaspirate ثلاث مرات مع أحجام متساوية من 1X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). نضح بعناية وتجاهل الطبقة المائية أسفل.
3. إعداد العازلة كولاجيناز الهضم: 0.075٪ النوع الأول كولاجيناز في لهانكمحلول ملحي متوازن (HBSS). إعداد عازلة FACS: 2٪ FBS، 1٪ P188 و 1٪ القلم بكتيريا في برنامج تلفزيوني. تصفية كل من حلول باستخدام المتاحة تجاريا 0.22 ميكرون حجم المسام تدفق سريع مرشح polyethersulfone.
4. لهضم الأنسجة الدهنية غسلها، إضافة حجم مساو من كولاجيناز عازلة الهضم ووضع سفينة الهضم بشكل آمن في حمام مائي تهتز لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية (حوالي 180 يهز / دقيقة).
   ملاحظة: فمن الأفضل لاستخدام أكبر حجم الوعاء الهضم مما هو مطلوب، وهذا يسمح للهضم القصوى خلال الهز (أي 250 مل من العازلة كولاجيناز الهضم، 250 مل من الأنسجة الدهنية غسلها في قارورة معقمة 1L).
5. تحييد النشاط الأنزيمي بإضافة حجم مساو من العازلة FACS والسماح للجلوس على RT لمدة 5 دقائق. وبعد ذلك، الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
6. نضح بعناية وتجاهل طاف، مع الحرص على عدم تعكير صفو عالية الكثافة SVF بيليه.
7. resuspend الكرية في 5-10 مل من RT الأحمرخلية تحلل العازلة، استنادا إلى حجم بيليه. ترك حل للجلوس على RT لمدة 5 دقائق والطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
8. نضح طاف و resuspend بيليه بإضافة 5-10 مل من وسائط النمو التقليدي، استنادا إلى حجم بيليه (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة [DMEM] / 10٪ FBS / 1٪ البنسلين الستربتومايسين حل [القلم بكتيريا]).
9. تعليق تصفية من خلال 100 ميكرون خلية النايلون مصفاة لإزالة الحطام الخلوي.
10. الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
11. resuspend الكرية في 5-10 مل من وسائط النمو التقليدي، استنادا إلى حجم بيليه.
12. ضع 2 × 10 ⁶ خلايا في طبق ثقافة 15 سم القياسية وإقامة الثقافات الأولية O / N عند 37 درجة مئوية / 21٪ O _2، 5٪ CO _2. الحفاظ على المستويات دون متموجة لمنع التمايز عفوية في 37 ° C / 21٪ O _2، 5٪ CO ₂ في وسائل الاعلام النمو.
    كثافة خلية في كامل ملاحظة:متموجة 15 سم لوحة ما يقرب من 4-6 × 10 ⁶ خلايا.

2. تلطيخ

1. ASCS الثقافة في متوسطة النمو التقليدي عند 37 درجة مئوية / 21٪ O _2، 5٪ CO _2، لمدة 36 ساعة قبل تلطيخ / الفرز.
2. ASCS رفع من لوحات ثقافة استخدام Accutase (وفقا للبروتوكول الشركة المصنعة).
3. غسل خلايا مرة واحدة مع FACS العازلة (PBS مع 2٪ FBS و 1٪ القلم بكتيريا).
4. الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
5. تجاهل طاف دون الإخلال بيليه. resuspend الخلايا في 0.5-1 مل من العازلة FACS (اعتمادا على عدد الخلايا وكمية من الأجسام المضادة المطلوبة).
   ملاحظة: حجم التعليق الخلية، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة الأجسام المضادة FACS، ويحدد تركيز الأجسام المضادة. ومع ذلك، المعايرة تركيز الأجسام المضادة، وذلك باستخدام تركيز الانطلاق من 1: 100، وينصح عادة إذا كان هذا هو المرة الأولى لاستخدام الأجسام المضادة.
6. عد العدد الإجمالي للالخلايا باستخدام عدادة الكريات.
7. الاحتياطي 100 UL مأخوذة في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي التي تستخدم في عينة غير ملوثين والضوابط أحادية اللون (وفقا لعدد من الأجسام المضادة الفلورسنت المستخدمة).
8. إضافة الاجسام المضادة المناسبة fluorescently المسمى (بتركيزات محددة سلفا، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة)، واحتضان لمدة 20-30 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
   1. لتسمية حيوانية عظمي المنشأ: تمييع مكافحة CD90 (APC CD90 مكافحة الإنسان (Thy1)) أو مكافحة CD105 (FITC مكافحة الإنسان CD105 (endoglin)) في المخزن FACS إلى تركيز 01:50.
   2. لتسمية السكان الخلية الأخرى (على سبيل المثال، المكونة للدم والخلايا البطانية): تمييع مكافحة CD45 (مكافحة CD45 الإنسان والمحيط الهادئ الأزرق)، ومكافحة CD34 (مكافحة الإنسان CD34 APC)، و / أو مكافحة CD31 (مكافحة CD31 الإنسان PE ) في FACS العازلة إلى تركيز 01:50.
   3. إذا لم تكن تستخدم الأجسام المضادة مترافق مباشرة، واستخدام الأجسام المضادة الأولية المعقدة البيروكسيديز مع-streptavidin مترافق الثاني المناسبةالأجسام المضادة آرى، مثل Streptavidin PE-Cy7، في التخفيف من 1: 100.
9. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين: ملء الأنابيب مع FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وطاف الشفط.
10. resuspend الخلايا في 400-500 ميكرولتر FACS العازلة ومرشح عينات من خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة لإزالة كتل الخلية.
11. نقل الخلايا المسمى في أنابيب FACS مع كبار تصفية والاحتفاظ بعينات على الجليد لمدة التحليل.

3. تنشيط الإسفار الفرز خلية

ملاحظة: الخطوات التالية ولاية معرفة سابقة في الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) أو مساعدة من أحد الفنيين المهرة.

1. باستخدام برنامج FACS المناسبة والمؤامرات تحليل تصميم لدراسة مبعثر إلى الأمام (FSC)، والجانب مبعثر (SSC)، فيكوإيريترين (PE) -Texas الأحمر، الأزرق المحيط الهادئ، فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، Allophycocyanin (APC) وأي استخدام fluorophore أخرىد لتسمية الخلايا.
2. قبل تحميل في فارز الخلية، لفترة وجيزة دوامة كل عينة إلى resuspend الخلايا.
3. تبدأ مع تحليل العينة غير ملوثين من أجل وضع بوابات بالنسبة لمجموع السكان الخلية، لاستبعاد الحطام الخلوي، وتحديد خط الأساس تألق ذاتي.
4. إضافة يوديد propidium (PI) على عينة غير ملوثين وتحليلها من أجل رؤية السكان من الخلايا الحية داخل مجموع السكان الخلية. بناء بوابة حول هذه الفئة من السكان.
5. تحليل عينة سيطرة أحادية اللون لكل تألقي من أجل وضع تعويض مضان.
6. تحليل العينة الملون لتحديد موقف من البوابات للفرز.
7. إضافة إلى PI العينة الملون من أجل وصمة عار الخلايا الميتة.
8. فرز السكان الخلية المسمى. ترتيب إما إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي أو أنابيب مخروطية (15 مل) التي تحتوي على مستنبت.
9. وقف الفرز مرة واحدة وقد تم الحصول على الكمية المطلوبة من خلايا يدويا.
10. لناFACS جي، إجراء فحص النقاء من خلال تحليل جزء صغير (على سبيل المثال، 500 خلية) من سكان الخلية المكتسبة.
    ملاحظة: هذه الخطوة تؤكد على نقاء السكان الخلية فرزها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون النقاء أكبر من 90-95٪.
11. خلايا الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية التالية مباشرة الانتهاء من الفرز وresuspend في 1 مل من المتوسط ​​الطازجة تحتوي على 10٪ FBS.
    ملاحظة: يمكن زيادة كمية سائل الإعلام المستخدمة على أساس حجم الخلية بيليه.
12. لوحة على لوحات الجيلاتين المغلفة لتحسين بقاء الخلية. اعتمادا على محصول خلية النهائي، لوحة 300،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا، 100،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 12-جيدا.

النتائج

باستخدام CD90 كعلامة للخلايا مع تعزيز النتائج تكون العظم في عزلة من سكان عالي التخصيب من ASCS الإنسان (الشكل 1A، 1B). كانت ملطخة ASCS مع باسيفيك بلو-مترافق CD45 مكافحة الإنسان، FITC مترافق CD105 مكافحة الإنسان، وAPC-مترافق CD90 مكافحة الإنسان. بعد الفرز، وكان مستوى من النقاء أ?...

Discussion

حاليا، وعزل مجموعات سكانية فرعية متجانسة من ASCS من صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان لا يزال يشكل تحديا على الرغم من الهدف المرغوب فيه. عزلة المجموعات السكانية الفرعية ASC الموالية للالمكونة للعظم أمر مرغوب فيه بشكل خاص، كما مثل هذه الخلايا يمكن است...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences