Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Résumé

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Résumé

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Introduction

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

Protocole

REMARQUE: Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Conseil d'examen Stanford University institutionnel (Protocole N ° 2188 et # 9999).

1. Isolement et culture cellulaire:

1. Obtenir le tissu adipeux sous-cutané humain provenant de patients sains de sexe féminin subissant lipoaspiration élective de l'abdomen, du flanc, et / région ou de la cuisse sous anesthésie locale / générale. Assurez-vous que l'Institutional Review Board (IRB) l'approbation a été obtenue pour le protocole d'isoler ASC de tissus humains, et suivre les précautions de sécurité institutionnels tout en travaillant avec de tels matériaux.
2. Pour obtenir le SVF à partir du tissu adipeux lipoaspirated, le lipoaspirat premier laver trois fois avec des volumes égaux de 1x solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Aspirer soigneusement et jeter la couche aqueuse inférieure.
3. Préparer le tampon collagénase de digestion: 0,075% collagénase de type I dans HankBalanced Salt Solution (HBSS). Préparer tampon FACS: 2% de FBS, 1% et 1% P188 Pen-Strep dans du PBS. Filtrez les deux solutions en utilisant un 0,22 um taille des pores débit rapide filtre polyéthersulfone disponible dans le commerce.
4. Pour digérer le tissu adipeux lavé, ajouter un volume égal de tampon de digestion à la collagénase et le placer récipient de digestion en toute sécurité dans un bain-marie à agitation pendant 60 min à 37 ° C (environ 180 secousses / min).
   REMARQUE: Il est préférable d'utiliser un récipient de digestion de volume plus important que nécessaire, car cela permet à la digestion maximale pendant l'agitation (c.-250 ml de tampon de digestion collagénase, 250 ml de tissu adipeux lavé dans un flacon stérile 1L).
5. Neutraliser l'activité enzymatique par addition d'un volume égal de tampon pour FACS et permettant de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 233 g pendant 20 min à 4 ° C.
6. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot SVF-haute densité.
7. Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de RT rougeTampon de lyse cellulaire, selon la taille du culot. Laissez la solution de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min et centrifuger à 233 g pendant 5 min à température ambiante.
8. Aspirer le surnageant et remettre le culot en ajoutant 5-10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille de pellets (milieu de Eagle modifié Dulbecco [DMEM] / 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine solution [pen-strep]).
9. On filtre la suspension à travers un filtre cellulaire en nylon de 100 um pour éliminer les débris cellulaires.
10. Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, et jeter le surnageant sans perturber le culot.
11. Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille du culot.
12. Placez 2 x 10 ⁶ cellules dans une boîte de culture de 15 cm standard et établir des cultures primaires O / N à 37 ° C / 21% d'O _2, 5% de CO _2. Maintenir au niveau sous-confluentes à prévenir une différenciation spontanée à 37 ° C / 21% O _2, 5% CO ₂ dans des milieux de croissance.
    La densité cellulaire dans un cadre entièrement: NOTEconfluentes 15 cm plaque est d'environ 4-6 x 10 ⁶ cellules.

2. coloration

1. CSA de la culture dans un milieu de croissance classique à 37 ° C / 21% O _2, 5% de CO _2, pendant 36 heures avant la coloration / tri.
2. ASC Ascenseur à partir de plaques de culture à l'aide Accutase (selon le protocole du fabricant).
3. Laver les cellules une fois avec du tampon FACS (PBS avec 2% de FBS et 1% de Pen-strep).
4. Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C.
5. Jeter le surnageant sans perturber le culot. Remettre en suspension les cellules dans 0,5 à 1 ml de tampon FACS (selon le nombre de cellules et la quantité souhaitée de l'anticorps).
   NOTE: Le volume de la suspension cellulaire, selon les recommandations du fabricant d'anticorps FACS, détermine la concentration d'anticorps. Cependant, le titrage de la concentration en anticorps, en utilisant une concentration de départ de 1: 100, est habituellement conseillé si ce est la première fois d'utiliser un anticorps.
6. Comptez le nombre total decellules en utilisant un hémocytomètre.
7. Réserve aliquotes de 100 ul dans 1,5 ml tubes de centrifugeuse à utiliser pour un échantillon non colorées et les contrôles d'une seule couleur (selon le nombre d'anticorps fluorescents utilisés).
8. Ajouter les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence appropriés (à des concentrations prédéterminées, selon les instructions du fabricant) et incuber pendant 20-30 min sur la glace, à l'abri de la lumière.
   1. Pour étiqueter sous-population ostéogénique: Diluer anti-CD90 (CD90 APC anti-humain (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humain (endogline)) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50.
   2. Pour marquer d'autres populations de cellules (par exemple, hématopoïétiques et les cellules endothéliales): Diluer anti-CD45 (anti-humain CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-humain CD34 APC), et / ou anti-CD31 (anti-humain CD31 PE ) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50.
   3. Si vous ne utilisez anticorps directement conjugués, utiliser un anticorps primaire biotinylé avec une seconde de streptavidine conjugué appropriéeary anticorps, tels que la streptavidine PE-Cy7, à une dilution de 1: 100.
9. Après incubation, laver les cellules deux fois: remplir les tubes avec du tampon FACS et centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, aspiration surnageant.
10. Remettre en suspension les cellules dans 400 à 500 échantillons ul FACS tampons et filtrer à travers une cellule de nylon filtre 70 um pour éliminer les grumeaux de cellules.
11. Transfert cellules marquées dans des tubes FACS avec le dessus du filtre et conserver des échantillons sur la glace pendant la durée de l'analyse.

3. fluorescence tri cellulaire activé

REMARQUE: Les étapes suivantes prescrivent des connaissances préalables dans la cellule activé par fluorescence (FACS) ou l'assistance d'un technicien qualifié.

1. Utilisation du logiciel FACS appropriées, parcelles d'analyse de conception pour examiner diffusion vers l'avant (FSC), diffusion latérale (SSC), la phycoérythrine (PE) -Texas rouge, bleu Pacifique, isothiocyanate de fluorescéine (FITC), Allophycocyanin (APC) et toute autre utilisation de fluorophored pour marquer les cellules.
2. Avant de charger dans le trieur de cellules, vortex brièvement chaque échantillon pour remettre en suspension les cellules.
3. Commencer avec l'analyse de l'échantillon non coloré afin de mettre en portes pour la population totale de la cellule, pour exclure les débris cellulaires, et de déterminer autofluorescence base.
4. Ajouter l'iodure de propidium (PI) à l'échantillon non colorées et les analyser afin de visualiser la population de cellules vivantes dans la population totale de la cellule. Construire une porte autour de cette population.
5. Analyser un échantillon de contrôle d'une seule couleur pour chaque fluorochrome pour régler la compensation de fluorescence.
6. Analyser l'échantillon teinté pour régler la position des portes pour le tri.
7. Ajouter PI à l'échantillon coloré pour colorer les cellules mortes.
8. Trier les populations cellulaires marqués. Trier soit 1,5 ml dans des tubes à centrifuger ou tubes coniques (15 ml) contenant du milieu de culture.
9. Cesser tri manuellement une fois que la quantité requise de cellules a été obtenue.
10. Nousing FACS, effectuer une vérification de la pureté en analysant une petite fraction (ex., 500 cellules) de la population de cellules acquise.
    NOTE: Cette étape confirme la pureté des populations de cellules triées. Idéalement, la pureté soit supérieure à 90-95%.
11. Centrifuger les cellules à 233 g pendant 5 min à 4 ° C immédiatement après la fin du tri et remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais contenant 10% de FBS.
    REMARQUE: La quantité de support utilisé peut être augmentée en fonction de la taille du culot cellulaire.
12. Plate sur des plaques revêtues de gélatine pour améliorer la viabilité des cellules. Selon le rendement cellulaire finale, plaque 300000 cellules par puits dans une plaque à 6 puits, 100 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits.

Résultats

Utilisation de CD90 en tant que marqueur pour des cellules avec des résultats améliorés d'ostéogenèse en isolement d'une population hautement enrichi de CSA humains (Figure 1A, 1B). CSA ont été colorées avec Pacific Blue-CD45 anti-humain conjugué, conjugué à FITC anti-CD105 humain, et APC conjugué anti-CD90 humain. Après le tri, le niveau de pureté était supérieure à 98%, telle que quantifiée par une analyse post-tri.

Définir les groupes de cellule...

Discussion

Actuellement, l'isolement des sous-populations homogènes de CSA de la SVF de tissu adipeux humain reste un défi si objectif souhaitable. L'isolement de sous-populations de l'ASC pro-ostéogéniques est particulièrement souhaitable, car ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la formation et l'homéostasie des tissus squelettiques. Toutefois, le SVF du tissu adipeux abrite hétérogénéité significative en ce qui concerne d'endiguer la capacité des cellules et le potentiel de différ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences