분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

요약

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

초록

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

서문

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

프로토콜

참고 : 모든 환자 샘플 동의 얻었다, 실험 프로토콜을 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 승인되었다.

1. 세포 분리 및 문화 :

1. 일반 / 국소 마취하에 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지 영역의 선택 과목 lipoaspiration를 받고 건강한 여성 환자에서 인간의 피하 지방 조직을 얻습니다. 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 인체 조직에서의 ASC를 분리의 프로토콜 얻어되었는지 확인하고, 그러한 물질들로 작업하는 동안 제도적 안전주의 사항을 따르십시오.
2. lipoaspirated 지방 조직에서 SVF를 얻으려면, 먼저 1X 멸균 인산 완충 생리 식염수를 같은 부피 (PBS)와 리포 애스 퍼 레이트 세 번 씻는다. 조심스럽게 기음과 바닥 수성 층을 버린다.
3. 내가 행크의에서 콜라 0.075 % 유형 : 콜라겐 소화 버퍼를 준비균형 소금 솔루션 (HBSS). FACS 버퍼를 준비 : 2 % FBS, 1 % P188 및 PBS에 1 % 펜 연쇄상 구균을. 시판 0.22 ㎛의 공극 크기 빠른 유동 폴리 필터를 사용하여 두 용액을 필터.
4. 세척 된 지방 조직을 소화, 37 ° C (약 180 흔들기 / 분)에서 60 분 동안 진탕 수욕 안전하게 분해 용기를 콜라게나 제 소화 버퍼의 동일 부피를 추가 배치.
   참고 :이 떨고 동안 최대한의 소화 수 있습니다대로, 요구되는 것보다 더 큰 볼륨 분해 용기를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다 (즉, 콜라겐 소화 버퍼 250 ml의, 1L 멸균 플라스크에 씻어 지방 조직의 250 ㎖).
5. FACS 완충액의 동량을 첨가하고 5 분 동안 RT에 앉아 있도록함으로써 효소 활성을 중화. 다음, 4 ℃에서 20 분 동안 233 XG에 원심 분리기.
6. 조심스럽게 기음과 고밀도 SVF 펠렛을 방해하지 돌보는, 상층 액을 제거한다.
7. RT 레드 5-10 ml의 펠렛을 재현 탁세포 펠렛의 크기에 기초하여, 용해 완충액. 실온에서 5 분 동안 233 XG에서 5 분 원심 분리기에 대한 RT에 앉아 솔루션을 남겨주세요.
8. 기음 상등액과 펠릿 크기에 따라 기존의 성장 배지 5-10 ml를 첨가하여 펠릿을 재현 탁 (둘 베코 변형 이글 중간 [DMEM] / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 [펜 연쇄상]).
9. 세포 파편을 제거하기 위해 100 ㎛ 나일론 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과.
10. 4 ° C에서 5 분 233 XG에 원심 분리기 및 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다.
11. 펠릿의 크기에 기초하여 기존의 성장 배지 5~10 ㎖,에 펠렛을 재현 탁.
12. 15cm 표준 배양 접시에 2 × 10 ⁶ 세포를 놓고 37 ° C / 21 % O _2, 5 % CO _2에서 차 문화 O / N을 설정합니다. 37 ° C / 21 % O _2, 성장 배지에서 5 % CO _2에서 자발적인 분화를 방지하기 위해 서브 합류 수준에서 유지한다.
    참고 : 완전히의 셀 밀도합류 15cm 플레이트는 약 4-6 × ¹⁰⁶ 세포이다.

2. 염색

1. 염색하기 전에 36 시간 동안 37 ° C / 21 % O _2, 5 % CO _2, 전통적인 성장 배지에서 배양의 ASC는 / 정렬.
2. (제조사의 프로토콜에 따라) Accutase를 사용하여 배양 접시에서 리프트의 ASC.
3. 한 번 (2 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 구균과 PBS) FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오.
4. 4 ℃에서 5 분 동안 233 XG에 원심 분리기.
5. 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. FACS 완충액 0.5 ml의 세포를 재현 탁 (세포 수 및 항체의 원하는 양에 따라).
   주 : 세포 현탁액의 부피는, FACS 항체 제조자의 권고에 따라, 항체 농도를 결정한다. 그러나, 항체의 농도가 적정, 하나의 출발 농도를 사용 : 그것은 항체를 사용하는 최초 시간 인 경우 (100), 일반적으로 권장된다.
6. 총 수를 계산혈구를 사용하여 세포.
7. 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에서 예약 100 UL 분취 흠 샘플 (사용하는 형광 항체의 수에 따라) 단일 색상 조절을 위해 사용된다.
8. (제조업체의 지침에 따라 소정의 농도에서) 적절한 형광 표지 된 단일 클론 항체를 추가하고 빛으로부터 보호 얼음에 20 ~ 30 분 동안 품어.
   1. 골 형성 모집단 레이블을 지정하려면 : 1시 50분의 농도로 FACS 버퍼에 안티 CD90 (APC 안티 - 인간 CD90 (Thy1)) 또는 안티 CD105 (FITC 안티 - 인간의 CD105 (endoglin))를 희석.
   2. 다른 세포 집단 (예를 들어, 조혈 및 내피 세포)에 레이블을 지정하려면 : 안티 CD45 (안티 - 인간 CD45 태평양 블루), 항 CD34 (안티 - 인간 CD34 APC), 및 / 또는 항 CD31 (안티 - 인간 CD31 PE를 희석 ) FACS 1:50의 농도로 버퍼.
   3. 직접 접합 된 항체를 사용하지 않는 경우, 적절한 스트렙 타비 딘 - 접합 제와 비오틴 차 항체를 사용하여하나의 희석 등 스트렙 타비 딘 PE-Cy7로 진 항체, 100.
9. 상층 액을 흡입, 4 ° C에서 5 분 동안 233 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기와 튜브를 채우기 : 부화 후, 두 번 세포를 씻으십시오.
10. 세포 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 400 ~ 500 μL FACS 버퍼 및 필터 샘플에서 세포를 재현 탁.
11. 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 세포를 전송하고 분석 기간 동안 얼음에 샘플을 유지.

3. 형광 활성화 셀 정렬

주 : 다음 단계는 이전 형광 활성화 된 세포에서 지식 정렬 (FACS) 또는 숙련 된 기술자의 도움을 의무화.

1. 포워드 산란 (FSC), 측면 산란 (SSC)를 조사하기 위해 설계 분석 플롯을 적절한 FACS 소프트웨어를 이용하여, 피코 에리 트린 (PE) - 텍사스 레드, 퍼시픽 블루, 형광 염료 (FITC), 알로 피코시 아닌 (APC)와 다른 형광 물질을 사용D는 세포 레이블을.
2. 셀 소터, 잠시 소용돌이 세포를 재현 탁 각 샘플에로드하기 전에.
3. 세포 파편을 제외하고,베이스 라인 형광도를 결정하기 위해, 전체 세포 집단을위한 게이트를 설정하기 위해 흠 견본의 분석을 시작.
4. 흠 견본에 요오드화 프로피 듐 (PI)를 첨가하고, 전체 세포 집단 내에서 살아있는 세포 집단을 시각화하기 위해 그것을 분석. 이 인구 주위에 게이트를 구축합니다.
5. 형광 보정을 설정하기 위해 각각의 형광 색소에 대한 단색 대조군 샘플을 분석한다.
6. 정렬 게이트의 위치를​​ 설정하는 스테인드 샘플을 분석 할 수 있습니다.
7. 죽은 세포를 염색하기 위해 염색 된 샘플에 PI를 추가합니다.
8. 표지 된 세포 집단을 정렬합니다. 정렬 1.5 ml를 원심 분리기 튜브 또는 배양 배지를 함유하는 원뿔형 튜브 (15 mL) 중 하나에.
9. 수동 셀들의 수량이 필요한 구하면 정렬 중단.
10. 우리FACS를 보내고, 극히 일부를 분석 (예., 500 세포) 취득 된 세포 집단의 순도에 의해 검사를 수행한다.
    참고 :이 단계는 정렬 된 세포 집단의 순도를 확인합니다. 이상적으로, 순도 90-95 % 이상이어야한다.
11. 39 °에서 5 분 동안 원심 분리기 (233) XG 세포를 즉시 10 % FBS를 함유하는 새로운 배지 1 ㎖에 정렬 완료하고 다음을 재현 탁시켰다.
    주 : 사용 된 용지의 양이 세포 펠렛의 크기에 따라 증가 될 수있다.
12. 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이트는 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 최종 세포 수율, 판 6 웰 플레이트에 웰 당 30 만 셀, 12 웰 플레이트에 웰 당 10 만 셀에 따라.

결과

인간의 ASC (그림 1A, 1B)의 고농축 인구의 분리 향상된 골 형성의 결과 세포 마커로서 CD90 사용. 태평양의 ASC는 블루 - 공액 항 - 인간 CD45, FITC 접합 된 항 - 인간 CD105 및 APC 공액 항 - 인간 CD90으로 염색 하였다. 정렬 후 분석으로 정량으로 정렬 한 후 순도의 수준은 98 % 이상이었다.

두 개의 새로운 개체군의 미래의 격리를 위해 허용 전사 프로필을 기반으로 세포의 그...

토론

현재, 인간 지방 조직의 SVF에서의 ASC의 동종 개체군의 분리는 바람직한 목표 그래도 도전 남아있다. 이러한 세포는 골격 조직의 형성 및 항상성을 연구하는데 이용 될 수있는 친 조골 ASC의 개체군의 분리는, 특히 바람직하다. 그러나, 지방 조직의 SVF는. 셀 용량과 분화 가능성을 막기위한 관련이 이질성에 대한 분자 기초는 세포의 풀링 된 인구에서 이해 될 수없는 ¹¹ 이질성을 품고, 대신 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences