Выделение и Обогащение жировой ткани стромальных клеток для расширенной остеогенеза

Резюме

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Аннотация

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Введение

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы больных были получены с информированного согласия, и экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Стэнфордского университета Institutional Review Board (протокол № 2188 и № 9999).

1. Выделение клеток и культура:

1. Получить человеческого подкожной жировой ткани от здоровых пациенток, проходящих выборные липоаспирация животе, фланг, и / или области бедра под местной / общая анестезия. Убедитесь, что Экспертный совет (IRB) одобрение получено для протокола изоляции ИСС из тканей человека и следуйте институциональные меры предосторожности при работе с такими материалами.
2. Чтобы получить СФДВ от lipoaspirated жировой ткани, первый мыть липоаспирата три раза равными объемами стерильного 1x фосфатно-солевом буфере (PBS). Тщательно аспирата и отбросить нижний водный слой.
3. Подготовка коллагеназы пищеварения буфера: 0,075% Тип I коллагеназы в ХэнкаСбалансированный солевой раствор (HBSS). Подготовка FACS буфера: 2% FBS, 1% P188 и 1% Пен-Strep в PBS. Фильтр оба решения, используя коммерчески доступный размер пор быстрый поток полиэфирсульфоновой фильтр 0,22 мкм.
4. Переваривать промывают жировой ткани, добавить равный объем коллагеназы пищеварения буфера и помещают сосуд пищеварения надежно встряхивании на водяной бане в течение 60 мин при 37 ° С (примерно 180 качает / мин).
   Примечание: Лучше всего использовать больший объем пищеварения сосуд, чем это требуется, так как это позволяет максимально пищеварения при встряхивании (т.е. 250 мл коллагеназы пищеварения буфера 250 мл жировой ткани промывают в 1 л стерильной колбе).
5. Нейтрализовать ферментативную активность добавлением равного объема FACS буфера и позволяет сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее, центрифуге при 233 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
6. Тщательно аспирата и отбросить супернатант, стараясь не потревожить высокой плотности SVF гранул.
7. Ресуспендируют осадок в 5-10 мл РТ красныйбуфера для лизиса клеток, в зависимости от размера гранул. Оставьте раствор, чтобы сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифуге при 233 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок путем добавления 5-10 мл традиционной ростовой среде, в зависимости от размера гранул (Дульбекко в модификации Дульбекко [DMEM] / 10% FBS / 1% пенициллина-стрептомицина решение [перо стрептококк]).
9. Суспензию фильтруют через сито нейлона клеток 100 мкм для удаления остатков клеток.
10. Центрифуга на 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант, не нарушая гранул.
11. Ресуспендируют осадок в 5-10 мл традиционных СМИ роста, в зависимости от размера гранул.
12. Поместите 2 × 10 ⁶ клеток в стандартной 15 см блюдо культуры и создать первичные культуры O / N на 37 ° C / 21% O _2, 5% СО _2. Поддержание в суб-сливающийся уровнях с целью предотвращения спонтанной дифференцировке при 37 ° С / 21% O _2, 5% СО ₂ в среде роста.
    Плотность клеток в полной мере: ПРИМЕЧАНИЕсливной 15 см пластины приблизительно 4-6 х 10 ⁶ клеток.

2. Окрашивание

1. Культура ИСС в традиционной среде роста при 37 ° С / 21% O _2, 5% CO ₂ в течение 36 ч перед окрашиванием / сортировки.
2. Лифт ИСС от культуры пластин с использованием Accutase (в соответствии с протоколом производителя).
3. Вымойте клеток один раз FACS-буфера (PBS с 2% FBS и 1% пера стрептококк).
4. Центрифуга на 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
5. Удалите супернатант, не нарушая гранул. Ресуспендируют клеток в 0,5-1 мл FACS буфера (в зависимости от числа клеток и количество антител нужной).
   ПРИМЕЧАНИЕ: объем клеточной суспензии, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя FACS антитела, определяет концентрацию антител. Тем не менее, титрование концентрации антител, с использованием исходной концентрации 1: 100, как правило, рекомендуется, если это первый раз использовать антитела.
6. Подсчитайте общее количествоклеток с использованием гемоцитометра.
7. Резервный 100 мкл аликвоты в 1,5 мл центрифужные пробирки, которые будут использоваться для неокрашенной пробы и одноцветных контроля (в соответствии с количеством флуоресцентных антител, используемых).
8. Добавьте соответствующие флуоресцентно-меченных моноклональных антител (при заданных концентраций, в соответствии с инструкциями изготовителя) и инкубировать в течение 20-30 мин на льду, защищают от света.
   1. Для обозначения остеогенной субпопуляции: Развести анти-CD90 (APC анти-CD90 человека (Thy1)) или анти-CD105 (FITC анти-человеческого CD105 (эндоглин)) в FACS буфере до концентрации 1:50.
   2. Чтобы присвоить другие клеточные популяции (например, кроветворной и эндотелиальные клетки): Развести анти-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), анти-CD34 (Anti-Human CD34 APC), и / или анти-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) в FACS буфере до концентрации 1:50.
   3. Если не используется непосредственно конъюгированных антител, использовать биотинилированного первичного антитела с соответствующим стрептавидин-конъюгированные второйичных антитела, такие как стрептавидин PE-Cy7, в разведении 1: 100.
9. После инкубации промыть клетки дважды: заполнить трубы с буфером FACS и центрифуги в 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, супернатант аспирацией.
10. Ресуспендируют клеток в 400-500 мкл FACS буфера и фильтра образцов через сито нейлон клеток 70 мкм, чтобы удалить скопления клеток.
11. Передача меченых клеток в FACS труб с фильтром верхней и сохранить образцы на льду в течение всего срока анализа.

3. флуоресценции активирован сортировки клеток

Примечание: Следующие шаги мандат предыдущие знания в флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS) или помощь квалифицированным специалистом.

1. Использование программного обеспечения соответствующих FACS, анализа проектирования участков для изучения рассеяния вперед (ФСБ), боковое рассеивание (SSC), Фикоэритрин (PE) -Texas Красный, Pacific Blue, флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), аллофикоцианином (APC) и любое другое использование флюорофорd маркировать клетки.
2. Перед загрузкой в ​​клеточного сортера, кратко вихря каждого образца для ресуспендирования клеток.
3. Начать с анализом образца неокрашенной, чтобы установить ворота для общего количества клеток, чтобы исключить продукты распада клеток, а для определения базового аутофлюоресценция.
4. Добавить пропидийиодидом (PI) для неокрашенной пробы и анализировать ее для того, чтобы визуализировать население живых клеток в общей численности населения клеток. Построить ворота вокруг этого населения.
5. Анализ контрольного образца одного цвета для каждого флуорохромом, чтобы установить компенсацию флуоресценции.
6. Анализ окрашенных образец, чтобы установить положение ворот для сортировки.
7. Добавить PI для окрашенных образца для того, чтобы окрашивать мертвые клетки.
8. Сортировать меченых клеточных популяций. Сортировка в любой 1,5 мл центрифужные пробирки или конические пробирки (15 мл), содержащем культуральную среду.
9. Вручную прекратить сортировки когда была получена необходимое количество клеток.
10. Намчисле FACS, выполните проверку на чистоту с помощью анализа небольшую долю (напр.,, 500 ячеек) приобретенной клеточной популяции.
    Примечание: Этот шаг подтверждает чистоту отсортированных клеточных популяций. В идеале, чистота должна быть больше, чем 90-95%.
11. Центрифуга клетки при 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С сразу после завершения сортировки и ресуспендируют в 1 мл свежей среды, содержащей 10% FBS.
    Примечание: Количество используемых сред может быть увеличена в зависимости от размера из клеточного осадка.
12. Пластина на покрытые желатином пластин для повышения жизнеспособности клеток. В зависимости от конечного выхода клеток, пластины 300000 клеток на лунку в 6-луночный планшет, 100000 клеток на лунку в 12-луночный планшет.

Результаты

Использование CD90 в качестве маркера для клеток с улучшенными результатами остеогенеза в изоляции из высокообогащенного населения человеческих ИСС (рис 1а, 1б). ИСС окрашивали Pacific Blue-сопряженных анти-человеческого CD45, FITC-сопряженных анти-человеческого CD105 и APC-сопряженных анти-...

Обсуждение

В настоящее время, изоляция однородных групп населения ИСС из SVF в жировой ткани человека остается сложной, хотя желанной целью. Выделение про-остеогенных ASC субпопуляций особенно желательно, так как такие клетки могут быть использованы для изучения формирования и гомеостаз скелетных ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences