Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويتجلى إعادة تشكيل البروتين الغشاء، KvAP، إلى الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) للطريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation، وبمساعدة هلام التورم. في كلتا الطريقتين، وتنصهر الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتين معا لتشكيل GUVs التي يمكن بعد ذلك دراستها من قبل المجهري مضان والتصحيح، المشبك الكهربية.

Abstract

عملاق Unilamellar الحويصلات (GUVs) هي نظام بيوميمتيك شعبية لدراسة الظواهر المرتبطة الغشاء. ومع ذلك، وتستخدم عادة بروتوكولات لتنمو يجب أن يتم تعديل GUVs من أجل تشكيل GUVs تحتوي على البروتينات عبر الغشاء وظيفية. توضح هذه المقالة طريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation وبمساعدة هلام تورم - لتشكيل GUVs تحتوي على قناة البوتاسيوم الجهد بوابات، KvAP. في كلتا الطريقتين، وهو حل من الحويصلات التي تحتوي على البروتين unilamellar صغيرة هو المجففة جزئيا لتشكيل كومة من الأغشية، والتي يتم بعد ذلك يسمح للتضخم في منطقة عازلة الإماهة. للتعرف على طريقة electroformation، وتودع الفيلم على أقطاب البلاتين بحيث يمكن تطبيق حقل AC خلال فيلم الإماهة. في المقابل، يستخدم الأسلوب بمساعدة هلام تورم هلام الركيزة الاغاروز لتعزيز فيلم الإماهة. ويمكن لكل من طرق إنتاج GUVs في (على سبيل المثال، 100 ملم) تركيزات منخفضة (على سبيل المثال، 5 ملم) والفسيولوجية الملح. وتتميز GUVs الناتجة عن طريق المجهر مضان، وظيفة من القنوات أعيد قياسها باستخدام التكوين التصحيح، المشبك من الداخل إلى الخارج. في حين تورم في وجود حقل كهربائي متناوب (electroformation) يعطي عالية الغلة من GUVs خالية من العيوب، وتنتج طريقة بمساعدة هلام تورم توزيع البروتين أكثر تجانسا ويتطلب أي معدات خاصة.

Introduction

عند دراسة المبادئ الفيزيائية التي تحكم الأنظمة الحية، ونهج من أسفل إلى أعلى تسمح للالتجريبي للسيطرة على تكوين النظام وغيرها من المعالم التي لم يتم التلاعب بها بسهولة في النظم القائمة على خلية 1. للعمليات التي تعتمد على الأغشية، العملاق Unilamellar الحويصلات (GUVs، قطر ~ 1-100 ميكرون) وقد ثبت أن نظام بيوميمتيك مفيدة جدا 2-7 كما هي مناسبة تماما للدراسات الفحص المجهري والمجهرية 8-10. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات المختلفة لإنتاج GUVs، ومعظم تقع في فئتين - مستحلب أساس النهج 11،12 والتقنيات التي تعتمد على إعادة إماهة فيلم الدهون 13-16. في الأساليب المستندة إلى مستحلب، يتم تجميع النشرات الداخلية والخارجية من الأغشية GUV بالتتابع من الطبقات الوحيدة الدهون في واجهات المياه / النفط. هذا النهج هو المثالي لتغليف البروتينات القابلة للذوبان معفي GUVs، وتشكيل GUVs مع غير المتماثلة تكوين النشرة الدهون. ومع ذلك، يمكن GUVs تشكلت من المستحلبات تحتفظ آثار مذيب أن تغيير خصائص الغشاء والميكانيكية 17، والنهج ليس وخاصة مناسبة تماما لالعابرة للغشاء البروتين إعادة.

طرق معالجة الجفاف الفيلم تعتمد على حقيقة أن تجفيف (الجفاف) يسبب العديد من خليط الدهن لتشكيل كومة متعددة رقائقي من الأغشية. إذا ثم يتم وضع هذا المكدس في اتصال مع وجود مخزن مؤقت مائي، والأغشية في المكدس تتحرك التدفقات بصرف النظر المذيبات فيما بينها وعلى سطح المكدس، يمكن الأغشية الفردية فصل لتشكيل GUVs 13،18 (وكذلك حديقة حيوانات حقيقية ل الأجسام شحمي أخرى). ومع ذلك، حتى بالنسبة المثلى العازلة والدهون التراكيب، وهذا "تورم عفوية" الكلاسيكية الأسلوب لديه العائد المنخفض نسبيا من GUVs خالية من العيوب. واحد الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لزيادة العائد من GUVs خالية من العيوب هو "electroformation221 ؛، التي يتم تطبيق (AC) الحقل التيار المتردد خلال فيلم الإماهة. في حين لا تزال الآلية غير مفهومة، "electroformation" يمكن أن تعطي عوائد GUV مذهلة (> 90٪ في الظروف مواتية) لمخازن تركيز الملح منخفضة (<5 ملم) 14،19، ويمكن أن تعمل حتى في مخازن الفسيولوجية (~ 100 ملم) باستخدام تردد أعلى (500 هرتز مقابل 10 هرتز) AC المجال وأقطاب البلاتين 15. نهج بديل لزيادة العائد من GUVs خالية من العيوب هو "بمساعدة هلام تورم"، الذي وتودع الحل الدهون على هلام الركيزة البوليمرية بدلا من السلبي (على سبيل المثال، والزجاج، PTFE) ركائز المستخدمة في الكلاسيكية "تورم العفوي ". عندما يتم ممهى الناتجة الفيلم الدهون / هلام، يمكن GUVs تشكل بسرعة حتى لمخازن الفسيولوجية 16،20.

ويمكن لجميع هذه الأساليب تنتج GUVs-الدهون الوحيد الذي يمكن استخدامه لدراسة غشاء المرتبطة الظواهر مثلالتفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان والأغشية. ومع ذلك، لإدراج البروتين العابر للغشاء في GUVs، هناك حاجة إلى تعديلات كبيرة لضمان أن البروتين لا يزال في حالة وظيفية في جميع أنحاء الإجراء إعادة. في حين حلول الدهون في المذيبات العضوية (على سبيل المثال، والكلوروفورم، الهكسان الحلقي) مثالية لإنتاج الأفلام الدهون والبروتينات عبر الغشاء وعادة ما تكون مستقرة فقط عندما يتم تضمين مسعور المجال الخاص بها عبر الغشاء في طبقة ثنائية الدهون، أو محاطة مذيلة المنظفات ( على سبيل المثال، خلال تنقية البروتين). وهكذا، فإن المواد بدءا من أجل إعادة هي عادة الأغشية الأم، البروتين النقي في حل المنظفات، أو الحويصلات التي تحتوي على البروتين unilamellar صغيرة (PROTEO-سيارات الدفع الرباعي) و / أو حويصلات متعددة رقائقي (PROTEO-MLVs) التي شكلتها إزالة المنظفات في وجود الدهون. معظم طرق لدمج هذه البروتينات الغشاء إلى GUVs تقع في ثلاث فئات.

مغرز مباشرةن: يتم خلط عبر غشاء البروتين معلقة في المنظفات مع، الدهون فقط، GUVs تذوب المنظفات أقل ما يقال شكلت مسبقا، والمنظفات ثم إزالة باستخدام biobeads 21. في حين بسيطة من الناحية المفاهيمية، يتطلب هذا الأسلوب مراقبة دقيقة من تركيز المنظفات، وتركيز عالية جدا المنظفات يمكن أن يحل GUVs في حين منخفضة جدا تركيز يمكن أن يسبب البروتين لتتكشف أو مجموع المباراتين.

يتم الجمع بين البروتين في PROTEO-سيارات الدفع الرباعي مع شكلت مسبقا، الدهون فقط GUVs ويتم تسهيل الاندماج مع الببتيدات fusogenic الخاصة 22 أو المنظفات 21: GUV / PROTEO-SUV فيوجن. وعادة ما مدى الانصهار ومحدودة يؤدي إلى GUVs مع انخفاض كثافة البروتين.

الجفاف / الإماهة: يتم تشكيل لفيلم الدهون التي تحتوي على البروتين بسبب الجفاف الجزئي لPROTEO-SUV (أو PROTEO-MLV) حل وGUVs يتم بعد ذلك نمت كما لفيلم الدهن النقي. التحدي الواضح هو حماية البروتين خلال dehydrati جزئيعلى الخطوة 23، ولكن الأسلوب وقد استخدم بنجاح لإعادة البروتينات العابرة للغشاء مثل رودوبسين جرثومي، الكالسيوم أتباز، إنتغرين وVDAC إلى GUVs 7،23 - 25.

توضح هذه المقالة بروتوكولات الجفاف / الإماهة لجعل GUVs تحتوي على قناة الجهد بوابات البوتاسيوم، KvAP، من فرط حرارة الأركيا، Aeropyrum pernix. KvAP لديه درجة عالية من التماثل إلى الجهد حقيقية النواة قنوات البوتاسيوم تعتمد 26 والتركيب البلوري المعروف 27 ، مما يجعلها نموذجا جيدا لدراسة آلية الجهد النابضة. وقد وصفت إنتاج PROTEO-سيارات الدفع الرباعي بالتفصيل سابقا وليس جزءا من هذا البرنامج التعليمي 26،28،29. الأهم من ذلك، KvAP PROTEO-سيارات الدفع الرباعي لا يجب أن يتم إنتاجها لكل إعداد GUV، لأنها يمكن خزنها في صغيرة (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر) aliquots في -80 ° C لفترات طويلة من الزمن (> 1 سنة). Electroformationأو بمساعدة هلام تورم ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لزراعة GUVs من KvAP PROTEO-سيارات الدفع الرباعي (أو PROTEO-MLVs).

ويوضح الخطوات الرئيسية لبروتوكول electroformation في الشكل 1. تترسب قطرات من محلول سيارات الدفع الرباعي التي تحتوي على البروتين على أسلاك البلاتين (كما هو موضح في الشكل 2). الجفاف الجزئي للتعليق SUV يؤدي إلى تشكيل لفيلم البروتين الدهني من خلال مزيج من سيارات الدفع الرباعي. أثناء الإماهة، يتم تطبيق حقل AC إلى الأقطاب لمساعدة طبقات الدهون لdelaminate وتشكيل GUVs. حقل 10 هرتز يعمل بشكل جيد عند استخدام "قليل الملح" (<5 مم) الإماهة عازلة 28 و GUVs يستغرق عدة ساعات لتنمو. في المقابل، مخازن الفسيولوجية (التي تحتوي على ~ 100 ملم الملح) تعمل بشكل جيد مع الجهد أقل، 500 هرتز AC المجال ولكن تحتاج إلى فترات طويلة (~ 12 ساعة) مدة 15 التورم. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول سابق باستخدام الشرائح ITO 24، ولكن يستخدم تابع غرفة مخصصةaining اثنين من الأسلاك البلاتين كما هو مبين في الشكل 2 (انظر مناقشة للحصول على تفاصيل تصميم واقتراحات لبساطة وبدائية غرف).

ويوضح الشكل (3) طريقة تورم بمساعدة هلام. بروتوكول يعمل بشكل جيد مع مخازن مع تركيز الملح الفسيولوجية، سريع، وينتج GUVs مع توزيع البروتين أكثر تجانسا. ومع ذلك، فإن العائد من معزولة، GUVs المجانية عيب، على ما يبدو (أي الغشاء GUV موحد في موازين طول البصرية ولا أرفق أي كائنات) هو أقل من ذلك، على الرغم من أنها توفر عدد كاف لالتصحيح، المشبك والتجارب الصغيرة التلاعب . واستند هذا الأسلوب على البروتوكول باستخدام هلام الاغاروز لإنتاج الدهون الوحيد GUVs 16 ويتطلب معدات متخصصة أقل من الطريقة electroformation.

يوصف توصيف GUVs مع مضان المجهري، وكذلك الإجراءات باستخدام معيار التصحيح، المشبك مجموعة المتابعة لقياس النشاط KvAP في "الداخل إلى الخارج" رفعه بقع الغشاء.

يمكن المتزايدة GUVs التي تحتوي على البروتين أن يكون أكثر صعوبة من GUVs-الدهون الوحيد. على وجه الخصوص، يمكن أن العائد GUV النهائي يعتمد على بحساسية بالضبط كيف وتودع الحل SUV والمجففة لتشكيل كومة الغشاء. لشخص دون أي خبرة سابقة مع GUVs، قد يكون من المفيد أن ينمو أولا GUVs-الدهون الوحيد التالية بروتوكول التقليدي 15،16 في الذي يتكون الفيلم الغشاء عن طريق إيداع الدهون من المذيبات العضوية. وبمجرد أن البروتوكول التقليدي يعمل بشكل جيد، SUV ترسب والجفاف الجزئي ويمكن بعد ذلك أن يتقن استخدام سيارات الدفع الرباعي-الدهون فقط، التي هي أيضا مفيدة جدا عند ضبط بروتوكول لتكوين الدهون الجديد. عندما تنمو GUVs موثوق من سيارات الدفع الرباعي-الدهون فقط، وعندها فقط خطوة صغيرة لإنتاج GUVs التي تحتوي على البروتين من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي.

Protocol

1. إعداد الحل

  1. إعداد 5 مل من "عازلة SUV" تحتوي على 5 ملي بوكل، 1 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو تريس (7.5 درجة الحموضة)، و 2 ملي طرهالوز. تصفية المخزن المؤقت مع فلتر حقنة 0.2 ميكرون وتقسيمها إلى 1 مل مأخوذة التي يمكن تخزينها في -20 ° C.
    ملاحظة: يتم إعطاء تفاصيل إضافية للمواد والأدوات في قائمة المواد.
  2. إعداد 40 مل من "الواق النمو" GUV التي سوف تملأ GUV الداخلية خلال فيلم الإماهة. لنمو "الملح المنخفض"، والجمع بين 5 ملي بوكل، 1 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو 1 ملم تريس (7.5 درجة الحموضة)، و~ 400 ملي السكروز. لنمو "الملح الفسيولوجي"، والجمع بين 100 ملي بوكل، 5 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو 5 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، و~ 200 ملي السكروز.
  3. إعداد 40 مل من "الواق مراقبة" من أجل حل خارجي في الغرفة التجريبية من خلال الجمع بين 100 ملي بوكل، 5 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو 5 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، و~ 200 ملي الجلوكوز.
    ملاحظة: هذه المخازن هي إكساء فقطmples. الاطلاع على المناقشات لتكييف مخازن للتجارب أخرى.
  4. قياس osmolarities من النمو والمراقبة مخازن مع مقياس التناضح. إضافة حبيبات من السكروز أو الغلوكوز لمباراة لهم في حدود 1٪ بحيث GUVs لا ليز أو تنهار عند نقلها من غرفة النمو إلى غرفة المراقبة.
    ملاحظة: في هذا النطاق التركيز، مضيفا 1 ملم من السكروز (13.7 ملغ لكل 40 مل) أو الجلوكوز (7.2 ملغ لكل 40 مل) يزيد الأسمولية التي كتبها ~ 1 الميلي أسمول.
  5. تصفية النمو والمراقبة مخازن مع 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية لمنع نمو البكتيريا.
  6. حل 50 ملغ من البيتا الكازين في 10 مل من 20 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة) العازلة لتشكيل 5 ملغ / مل حل بيتا الكازين اللازمة لإيقاف فاعلية أسطح الغرف التجريبية بحيث GUVs لا عصا، تنتشر وتنفجر. مرة واحدة يتم حله تماما بيتا الكازين (تصل إلى عدة ساعات في 4 درجة مئوية)، ومرشح (0.2 ميكرون) أنه إلى 0.5 مل مأخوذة التي يمكن تجميدها وتخزينها فلاشفي -20 ° C لاستخدامها لاحقا (مأخوذة إذابة تخزينها في 4 ° C يمكن عادة أن تستخدم لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع).

2. إعداد SUV

  1. تحضير وتجميد aliquots من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي بعد بروتوكول مفصل نشرت سابقا 28. استخدام KvAP fluorescently المسمى مع اليكسا-488 maleimide، أعادت إلى DPhPC سيارات الدفع الرباعي (10 ملغ / مل) في البروتين إلى نسبة الدهون 1:10 (من الكتلة).
    ملاحظة: من نوع البرية KvAP يحتوي على السيستين واحد لكل مونومر تقع بالقرب من داخل الخلوية C-محطة (الأحماض الأمينية 247).
  2. الفلورسنت،-الدهن الوحيد سيارات الدفع الرباعي:
    ملاحظة: التعامل مع الكلوروفورم تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات النتريل ونظارات السلامة. تجنب استخدام أي البلاستيكية والكلوروفورم يمكن حل لها. ويمكن تخزين حلول الكلوروفورم في قوارير الزجاج العنبر مع قبعات تفلون ونقل باستخدام المحاقن الزجاجية. الحرص على شطف جميع الأواني الزجاجية على الأقل من 5 إلى 10 مرات مع الكلوروفورم قبل وبعد pipetting لنسبة الدهون.
    1. إعداد 100 ميكرولتر من10 سيارات الدفع الرباعي ملغ / مل DPhPC تحتوي على 0.5 مول٪ من الدهون أحمر فلوري، تكساس الأحمر DHPE، عن طريق خلط 100 ميكرولتر من حل DPhPC (10 ملغ / مل في الكلوروفورم) مع 8.2 ميكرولتر من حل تكساس الأحمر DHPE (1 ملغ / مل في الميثانول) في كوب 1.5 مل العنبر قنينة.
    2. تجفيف الدهون أسفل تحت سيل من النيتروجين في غطاء الكيميائية في حين تناوب القارورة. عندما يظهر الفيلم أن تكون جافة، ضع الدهون تحت فراغ لمدة 3 ساعة إلى إزالة أي المذيبات المتبقية.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة SUV إلى الدهون، ودوامة بقوة حتى لا يبقى الدهون عالقة على جدران القارورة والحل هو موحد حليبي.
    4. يصوتن الحل الدهون لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. ضبط الموقف قارورة حتى يتسبب في الموجات فوق الصوتية في معظم الحركة والتدفق داخل القارورة، والحرص على عدم تسخين حل دون داع. مواصلة صوتنة حتى يصبح الحل شفاف، أو عندما يكون ذلك ممكنا، شفافة (2-5 دقيقة للطرف صوتنة، ~ 20 دقيقة للحمام صوتنة).
    5. أليكور سيارات الدفع الرباعي (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر) وتجميد (-20 ° C) لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: الدهون، وخاصة الدهون غير المشبعة، ويمكن بسهولة الانهيار. حلول تخزين الدهون عند 20 درجة مئوية (أو 80 درجة مئوية) تحت الأرجون وتستخدم في غضون 6 أشهر. ويمكن الكشف عن المنتجات انهيار الدهون مع اللوني طبقة رقيقة.

3. GUV النمو التي كتبها Electroformation

  1. إعداد غرفة electroformation.
    1. إذا لم يتم تنظيف الغرفة، وإزالة النوافذ، وتمحو كل تسرب والشحوم، واستخراج الأسلاك، وشطف وتنظيف الغرفة مع النسيج باستخدام الماء والإيثانول (≥70٪) بالتناوب.
    2. فرك الأسلاك جيدا، وغمر الأسلاك وغرفة في الأسيتون، ويصوتن لمدة 5 دقائق. مسح كل شيء بمنديل مرة أخرى باستخدام الأسيتون. وضع الغرفة في الإيثانول ويصوتن لمدة 5 دقائق.
    3. غرفة تجميع عن طريق إدراج الأسلاك من خلال الثقوب، وتدوير ومسح الأسلاك للتأكد من أنها عالبريد نظيفة. وضع الغرفة في الماء المقطر، يصوتن لمدة 5 دقائق وتجفيف الغرفة مع تيار من النيتروجين أو الهواء.
  2. إعداد 30 ميكرولتر من 3 ملغ / مل تعليق SUV في المخزن SUV. لتشكيل GUVs التي تحتوي على البروتين، والجمع بين 8 ميكرولتر من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي (DPhPC 10 ملغ / مل KvAP 01:10)، 2 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي الفلورسنت (10 ملغ / مل DPhPC، 0.5٪ مول TexasRed-DHPE) و 20 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي عازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لبروتين النهائي الدهون (الكتلة) نسبة 1 إلى: 12.5٪ و 0.1 مول TexasRed-DHPE. مزيج الحل بقوة.
    1. بدلا من ذلك، لممارسة بروتوكول مع سيارات الدفع الرباعي الدهون فقط، وذلك ببساطة الجمع بين 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي الفلورسنت (10 ملغ / مل DPhPC و 0.5 مول٪ TexasRed-DHPE) مع 20 ميكرولتر عازلة SUV.
  3. إيداع الحل SUV.
    1. استخدام ماصة 2 ميكرولتر أو 5 ميكرولتر الزجاج حقنة لإيداع صغيرة (<0.2 ميكرولتر) قطرات من الحل SUV على الأسلاك. تقريبا هو مطلوب 1 ميكرولتر من حل لتشكيل سلسلة من قطرات على طول1 سم من السلك. تأكد من قطرات صغيرة بما فيه الكفاية ومتباعدة بعيدا بما فيه الكفاية بعيدا أنهم لا تلمس أو الصمامات.
    2. السماح للسيارات الدفع الرباعي المودعة الجافة ~ 30 دقيقة في الهواء الطلق. عندما استقروا كل قطرات، وتناوب السلك حتى ودائع الدهون هي أسهل لمراقبة مع المجهر.
      ملاحظة: إذا السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات لا يجف بما فيه الكفاية، فإنها يمكن أن يغسل قبالة الأسلاك عند إضافة عازلة النمو، في حين تجفيف أكثر من اللازم يمكن أن تتلف البروتين. بسبب الرطوبة الجوية يؤثر على معدل التجفيف، ووقت التجفيف و / أو رطوبة الهواء يمكن تعديلها لتحقيق أفضل النتائج 30. وينبغي أن يكون الفيلم الدهون على الأسلاك مرئية تحت المجهر.
  4. تجميع الغرفة.
    1. ختم أسفل الغرفة: استخدام حقنة لتطبيق الشحوم فراغ إلى الجزء السفلي من الغرفة حول الآبار الثلاثة والضغط على 40 ملم × 22 ملم ساترة بلطف ضدها لختم أسفل الغرفة بحيث تتمسك دون فجوة. ختم الجانبين من الغرفة (حيث خروج أسلاك) معختم لصق. تطبيق الشحوم فراغ على رأس غرفة تحدد الآبار الثلاثة.
    2. إضافة ببطء عازلة النمو حتى يتم شغل كل بئر إلى الأعلى. تجنب أي حركة سريعة من الحل في الآبار وهذا يمكن أن تجريد فيلم الدهون قبالة الأقطاب.
    3. إغلاق الغرفة عن طريق الضغط على أعلى الشريحة غطاء بلطف على الشحوم، مع الحرص على عدم طرد ساترة القاع. استخدام منديل ورقي لإزالة أي قطرات من عازلة على حواف الغطاء العلوي زلة.
      ملاحظة: هذا هو الوقت المناسب للنظر في غرفة تحت المجهر للتأكد من أن الفيلم الدهون ظلت على الأسلاك.
  5. توصيل مولد إشارة إلى الأسلاك باستخدام اثنين من مقاطع التمساح. ضبط التردد (10 هرتز / 500 هرتز موجة جيبية لانخفاض / ارتفاع عازلة الملح) واستخدام المتعدد لقياس وضبط الجهد عبر الأسلاك إلى 0.7 / 0.35 V الجذر يعني مربع (VRMS) لمنخفض / عالية عازلة الملح. تغطية غرفة بورق الألمنيوم لحماية fluorophores من ضوء. ترك رانه GUVs لتنمو لمدة 2 إلى 3 ساعات لعازلة المنخفض الملح، و 12 ساعة أو O / N لعازلة عالية من الملح.
  6. افصل غرفة من المولد وبعناية وضعه على مجهر مقلوب لتقييم النمو GUV. استخدام بطيئة، وحركات ثابتة أو تدفق السوائل في الآبار قد فصل قبل الأوان GUVs من الأسلاك.
    ملاحظة: GUVs على حواف الأسلاك وعادة ما تكون وضوحا في مرحلة النقيض (40X الهدف مسافة العمل الطويل)، في حين GUVs في أي مكان على النصف السفلي من الأسلاك ويمكن رؤية مع epifluorescence. إذا لم يكن هناك GUVs مرئية، في محاولة الدورية للأسلاك لإلقاء نظرة على السطح العلوي. ويمكن تخزين GUVs في 4 درجات مئوية في غرفة النمو لعدة أيام.

4. GUV النمو التي كتبها تورم جل بمساعدة

  1. إعداد 10 مل من محلول الاغاروز 1٪ عن طريق خلط 100 ملغ من الاغاروز مع 10 مل من الماء النقي. الحرارة حتى يغلي عن طريق وضعها في الميكروويف في 480 W ل~ 20 ثانية. اثارة للتأكد من حل الاغاروز تماما.
    ملاحظة: الحلويمكن تخزينها في 4 ° C وإعادة تسخينها عند الحاجة.
  2. البلازما نظيفة (البلازما الجوية) غطاء الشريحة لمدة 1 دقيقة بحيث الحل الاغاروز سوف تنتشر بشكل جيد على ذلك. استخدام غطاء الشرائح داخل 15 دقيقة القادم حيث تأثير التنظيف البلازما يلبس بسرعة.
  3. تطبيق 200 ميكرولتر من الحل الاغاروز الحار كل 22 × 22 مم 2 الشريحة بحيث الحل يبلل السطح بأكمله. إمالة الشريحة عموديا ولمس الحافة السفلية للنسيج لإزالة السائل الزائد وترك مجرد طبقة ملساء رقيقة من الاغاروز على الشريحة.
  4. ضع الشريحة على طبق ساخن أو الفرن على 60 درجة مئوية وتترك لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل. الفيلم الاغاروز لا يكاد يكون مرئيا بالعين. بعد تبريد الشرائح لRT، واستخدامها على الفور، أو تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد في حاوية مغلقة في 4 درجات مئوية.
  5. ضع ساترة المغلفة الاغاروز في معيار 3.5 سم طبق بتري.
  6. إعداد الحل SUV كما في القسم 3.2 و تطبيق ~ 15 ميكرولتر من الحل SUV (3 ملغ / مل الدهون) في~ 30 قطرات صغيرة جدا بلطف على سطح الاغاروز. والحرص على عدم تشويه طبقة الاغاروز أكثر من اللازم.
  7. ضع الشريحة تحت تيار لطيف من النيتروجين لمدة 10-15 دقيقة واتبع تبخر العازلة العين كما قطرات تجف.
  8. في أقرب وقت جفت سيارات الدفع الرباعي، إضافة عازلة النمو لتغطية سطح الشريحة. لصغير 3.5 سم بيتري استخدام طبق ~ 1 مل من العازلة.
  9. السماح للتورم والمضي قدما ل~ 30 دقيقة، ومن ثم دراسة نمو GUVs في الغرفة باستخدام مجهر مقلوب مع المرحلة على النقيض أو التفاضلي التباين التدخل (DIC).
    ملاحظة: الملاحظة Epifluorescence صعبة نظرا للخلفية قوية من fluorophores في هلام وصناعة السيارات في مضان من الاغاروز.

5. حصاد ومراقبة GUVs

  1. إيقاف فاعلية غرفة المراقبة (على سبيل المثال، طبق بيتري صغيرة أو الزجاج ساترة) بحيث GUVs لا عصا، تنتشر وتنفجر على الجزء السفلي غرفة. تغطية شامنوفمبر أسفل مع حل بيتا الكازين، احتضان لمدة 5 دقائق، شطف خارج الحل الكازين مع مياه نقية وجافة مع تيار من الهواء أو النيتروجين، وأخيرا إضافة عازلة المراقبة (على سبيل المثال، ~ 5 مم عمق لطبق بيتري صغير).
  2. حصاد GUVs. قطع نهاية 100 نصائح ماصة ميكرولتر ذلك افتتاح أكبر (~ 2 مم)، وتطمح ببطء مثل إجهاد القص من pipetting ليمكن أن تدمر بسهولة GUVs.
    1. لGUVs شكلت الكهربائية، وفتح غرفة النمو عن طريق إزالة بلطف ساترة العليا. مكان غيض ماصة مباشرة فوق كل سلك ونضح ~ 50 ميكرولتر بينما تتحرك طرف ماصة على طول السلك لفصل GUVs.
      ملاحظة: قد تساعد على تدوير الأسلاك لجمع GUVs على "الجانب الآخر" من السلك.
    2. لGUVs "بمساعدة هلام تورم"، انقر أولا على جانب طبق بتري عدة مرات لمساعدة GUVs فصل من سطح ساترة. ضع طرف ماصة فقط فوق ساترة ونضح 50 ميكرولتر بينما صulling طرف إلى أكثر من السطح. نقل مباشرة GUVs حصادها إلى غرفة المراقبة، أو مخزن في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
  3. ضع غرفة المراقبة على مجهر مقلوب، إضافة GUVs إلى غرفة المراقبة، والانتظار بضع دقائق لGUVs ليستقر في قاع الغرفة.
  4. مسح الغرفة مع النقيض من المرحلة أو مدينة دبي للإنترنت لتحديد مكان بسرعة نحو سلس، كروية ('الحرة عيب') "المرشحين GUV". فحص كل "مرشح GUV" في epifluorescence لاستبعاد أي التي تحتوي على الجسيمات الشحمية أصغر تداخل داخل. وأخيرا، تأكد من أن كثافة الدهون مضان هي موحدة ومتوافقة مع غشاء واحد (أي unilamellar).
    ملاحظة: في بعض bilamellar (أو متعددة رقائقي) الحويصلات، الأغشية هي قريبة جدا معا لحلها بحيث تظهر unilamellar في مرحلة التباين أو الصور DIC. ومع ذلك، هذه الكائنات يمكن تمييزها عن unilame الفعليةGUVs llar من قبل مضان الدهون، والتي هي مرتين (أو أكثر) أكثر إشراقا.

6. GUVs-لقط التصحيح

  1. جعل ماصات التصحيح التي يبلغ قطرها 1-2 ميكرون غيض من معيار الزجاج البورسليكات الشعرية باستخدام برنامج الموصى بها لمجتذب ماصة.
    ملاحظة: العلاجات الخاصة مثل تلميع النار ليست ضرورية، والماصات يمكن استخدامها لعدة أيام بعد أن تم سحبها إذا تكون مسجونة في صندوق مغلق.
  2. إيقاف فاعلية الغرفة التي يحتضنها مع حل بيتا الكازين (5 ملغ / مل) لضمان أن GUVs لا تلتزم، انتشر وتمزق على الأسطح الغرفة. شطف الكازين بعد 5 دقائق.
  3. إدراج القطب الأرض، وملء الغرفة مع العازلة المراقبة، ونقل 10 ميكرولتر من تعليق GUV كما هو موضح في الخطوة 5.2 و 5.3، والانتظار بضع دقائق لGUVs ليستقر في القاع.
  4. ملء ماصة التصحيح جديدة مع الحل (عازلة للمراقبة أو حل ايزو الاسموزي آخر) وتركيبها على مكبر للصوت headstage التصحيح، المشبك.
  5. البحث من خلال الغرفة لتحديد موقع GUV "خالية من العيوب" كما هو موضح في القسم 5.4، والتحقق من أنه يحتوي على بروتين فلوري.
  6. تطبيق الضغط الايجابي المستمر (> 100 با، أو ما يقرب من 1 سم H 2 O في مقياس ضغط الدم) للحفاظ على ماصة التصحيح الداخلية نظيفة، وإدراج ماصة التصحيح في الغرفة. جلب ماصة التصحيح في مجال الرؤية، وتطبيق اختبار لقياس نبضات / تعويض الجهد ماصة تعويض والمقاومة، ودراسة ماصة تحت إضاءة الفلورسنت للتأكد من أن الطرف نظيف.
  7. جلب ماصة التصحيح نحو GUV، وإذا لزم الأمر، والحد في وقت واحد ضغط إيجابي حتى تدفق نحو الخارج من ماصة التصحيح لا يجعل GUV "الهرب". عندما ماصة التصحيح على مقربة من GUV، وتطبيق الضغط السلبي (حتى 5 سم H 2 O) لسحب GUV ضد ماصة التصحيح. مراقبة مقاومة باسم "، اللسان "من غشاء GUV يدخل ماصة التصحيح وأشكال gigaseal.
  8. إذا لم يكن gigaseal تشكيل، وإزالة ماصة التصحيح من الغرفة والعودة إلى الخطوة 6.4. إذا شكلت التصحيح غشاء gigaseal، ولكن GUV لا تزال تعلق على ماصة، استئصال التصحيح عن طريق سحب بعيدا عن GUV، متخلصا من GUV ضد قاع الغرفة، أو لفترة وجيزة تحريك ماصة للخروج من الحل.
  9. عندما تم رفعه للمن الداخل إلى الخارج التصحيح غشاء من GUV وgigaseal مستقر، وإيقاف نبضات اختبار وتطبيق بروتوكول الجهد مثل واحد هو مبين في الشكل (13).
    يتبع الشكل 13 اتفاقية الكهربية القياسية لالتصحيح من الداخل إلى الخارج الذي التيار المار في التصحيح القطب هو "الإيجابي"، وV = V حمام - V ماصة: ملاحظة. عقد التصحيح في السلبية المحتملة (مثل V = -100 بالسيارات) ل~ 30 ثانية الأماكن KvAP في حالة الراحة، في حين أن الخطوات (100 مللي ثانية إلى 5 ثانية) إلى إمكانات أكثر إيجابية (على سبيل المثال، V = 100 فولت) ويمكن بعد قيادتها إلى إجراء (أي فتح) الدول النشطة.
  10. بعد الانتهاء من القياسات على رقعة غشاء، وكسر التصحيح مع نبض انطلق أو الضغط وتحقق من أن الجهد إزاحة القطب التصحيح لم انجرف. إزالة ماصة التصحيح من الغرفة، والعودة إلى الخطوة 6.4.

النتائج

نمو GUVs يمكن تقييمها بسرعة عن طريق فحص غرفة النمو تحت المجهر. لelectroformation، وGUVs تميل إلى النمو في عناقيد على طول الأسلاك البلاتين، كما هو مبين في الشكل (4). وخلال بمساعدة هلام تورم، وتظهر GUVs عن الهياكل الكروية التي تنمو وتلتحم مع بعضها (الشكل 5) بسرعة.

Discussion

نظم نموذج المحاكاة البيولوجية هي أداة هامة لدراسة خصائص وتفاعلات البروتينات والأغشية. مقارنة بأنظمة أخرى مثل إعادة تشكيل BLMs أو الأغشية الدهنية المعتمدة، GUV النظم القائمة الحالية عدة فرص بما في ذلك سيطرة كبيرة من تكوين الغشاء والتوتر والهندسة، فضلا عن كونه حقا خالية...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of the
Material/Equipment		CompanyCatalog NumberComments/ Description
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids 850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids 850375P
cholesterol (ovine wool, >98%) Avanti Polar Lipids 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPlabeled lipid
BPTR-CeramideInvirtogenD-7540 labeled lipid
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
AcetoneVWR20066.296AnalaR Normapur
EthanolVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Hamilton syringes Hamilton Bonaduz AGdiverse
Amber vials and teflon cupsSigmaSU860083 and SU860076
ParafilmVWR291-1214
microcentrifuge tubeeppendorfdiverse
AgaroseEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SucroseSigma84097-1kg
Glucose SigmaG8270-1kg
TrehaloseSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1kg
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A
OsmometerWescorVapro
pH meterSchott instrumentsLab850
SonicatorElmasonicS 180 H
Syringe filter 0.2µmSartorius steimMinisart 16532
Function generatorTTiTG315
Platinum wiresGoodfellowLS41307499.99+%, d=0.5mm
PolytetrafluoroethyleneGoodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'VWR1597418
sealing pasteVitrex medical A/S, DenmarkREF 140014Sigillum Wax
Cover slides 22x40 mm No1,5VWR 631-0136
Cover slides 22x22 mm No1,5VWR 631-0125
plasma cleanerHarrickPDC-32Gairplasma, setting 'high'
petri dishesFalcon BDREF 3530013.5 cmx1cm
patch clamp amplifierAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ CardNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsversion 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mmHarvard ApparatusGC100-15
Electrode holderWarner Instruments Q45W-T10P
MicromanipulatorSutter MP-285
pipette pullerSutter P-2000 
CameraProSilica GC1380
Zeiss microscopeZeissAxiovert 135
ObjectiveZeiss40x long working distance, Phase contrast
Objective Zeiss100x Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488)HoribaXF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed)HoribaXF101-2
beta-caseinSigma C6905-1G
confocal microscopeNikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 confocal head
ObjectiveNikonPlan Fluor 100× NA1.3
matlabMathworksfor image processing and analysis of the current traces

References

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95 Unilamellar KvAP electroformation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved