Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Zusammenfassung

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Zusammenfassung

Riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV) stellen eine populäre biomimetischen System für die Untersuchung Membran verbundenen Phänomenen. Jedoch allgemein verwendeten Protokolle zu wachsen GUVs muß, um GUVs funktionelle Transmembranproteine, die Form modifiziert werden. Dieser Artikel beschreibt zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden - Elektroformation und Gel-unterstützte Schwellung - zu GUVs mit dem spannungsabhängigen Kaliumkanal, KvAP zu bilden. Bei beiden Verfahren ist eine Lösung von Protein enthaltenden kleinen unilamellaren Vesikeln partiell dehydratisiert, um einen Stapel von Membranen, die man dann in ein Rehydrationspuffer quellen zu bilden. Für die Elektroformation Verfahren wird der Film auf Platinelektroden abgeschieden, so dass eine AC-Feld bei der Folien Rehydratisierung angewendet werden. Im Gegensatz dazu verwendet das Gel gestützten Quellverfahren ein Agarosegel Substrat Film Rehydratisierung verbessern. Beide Methoden können GUVs in niedrigen (zB 5 mM) und physiologischen (zB 100 mM) Salzkonzentrationen zu produzieren. Die resultierenden GUVs über Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert, und die Funktion des rekonstituierten Kanäle gemessen mit der Inside-Out-Patch-Clamp-Konfiguration. Während Schwellung in der Gegenwart eines elektrischen Wechselfeldes (Elektroformation) ergibt eine hohe Ausbeute an fehlerfreien GUVs das Gel gestützten Quellverfahren erzeugt eine homogene Proteinverteilung und erfordert keine spezielle Ausrüstung.

Einleitung

Bei der Untersuchung der physikalischen Prinzipien, die lebende Systeme regeln, Bottom-up-Ansätze ermöglichen ein Experimentator die Systemzusammensetzung und andere Parameter, die nicht leicht in der zellbasierten Systemen ¹ manipuliert werden, zu steuern. Für membranbasierte Prozesse, Giant unilamellare Vesikel (GUVs, Durchmesser ~ 1-100 um) haben sich als sehr nützlich biomimetischen Systems ² sein ^{- 10 - 7,} wie sie für die Mikroskopie Studien und Mikromanipulation ⁸ geeignet sind. Zwar gibt es viele verschiedene Protokolle zur GUVs produzieren, die meisten fallen in zwei Kategorien - Emulsion nähert ^11,12 und Techniken, die auf eine rückfettenden Lipidfilm ^13-16. In Emulsion basierenden Verfahren werden die inneren und äußeren Blättchen der GUV Membranen nacheinander von Lipid-Monoschichten auf Wasser / Öl-Grenzflächen zusammengefügt. Diese Vorgehensweise eignet sich zur Verkapselung lösliche Proteine ​​mitin den GUVs und zur Bildung GUVs mit asymmetrischer Broschüre Lipidzusammensetzung. Allerdings kann GUVs von Emulsionen gebildet Spuren des Lösungsmittels, die der Membran mechanische Eigenschaften ¹⁷ ändern zu behalten, und der Ansatz ist nicht besonders gut geeignet, um Transmembranprotein Rekonstitution.

Film Rehydratisierung Verfahren beruhen auf der Tatsache, daß die Trocknung (Entwässerung) verursacht viele Lipidgemische einen multilamellare Membranstapel zu bilden. Wenn dieser Stapel wird dann in Kontakt mit einem wässrigen Puffer platziert werden Membranen in dem Stapel auseinander als Lösungsmittel fließt zwischen ihnen und an der Oberfläche des Stapels bewegen können einzelne Membranen lösen zu GUVs ^13,18 (und einen regelrechten Zoo bilden anderen lipidischen Objekte). Auch für eine optimale Puffer und Lipidzusammensetzungen, hat diese klassische "spontane Schwellung" Verfahren jedoch eine relativ geringe Ausbeute an fehlerfreie GUVs. Eine weit verbreitete Methode, um die Ausbeute an fehlerfreie GUVs steigern ist "Elektroformation221 ;, in dem ein Wechselstrom (AC) -Feld wird während der Film Rehydratisierung aufgebracht. Während der Mechanismus bleibt kaum verstanden ", Elektroformation" kann spektakuläre GUV Ausbeuten (> 90% unter günstigen Bedingungen) für niedrige Salzkonzentration Puffer (<5 mm) ^14,19, und kann sogar in physiologischen Puffern zu arbeiten (~ 100 mM) mit eine höhere Frequenz (500 Hz gegenüber 10 Hz) Wechselstromfeld und Platinelektroden ^15. Ein alternativer Ansatz, um die Ausbeute an fehlerfreien GUVs BOOST "Gel-unterstützte Schwellung", in dem die Lipidlösung wird auf ein polymeres Gel Substrat anstelle des passiven abgeschieden (zB Glas, PTFE) Substrate in der klassischen "spontane Quellung verwendete ". Wenn die resultierende Lipid / Gelfilm rehydriert kann GUVs schnell bilden auch für physiologische Puffer ^16,20.

Alle diese Methoden können lipid nur GUVs die benutzt werden können, um Membran-assoziierten Phänomene wie die Studie zu produzierenInteraktion zwischen löslichen Proteinen und Membranen. Um jedoch ein Transmembranprotein in GUVs einzubauen, sind wesentliche Änderungen erforderlich, um sicherzustellen, dass das Protein bleibt in einem Funktionszustand in der gesamten Aufbereitungsvorgang. Während Lösungen von Lipiden in organischen Lösungsmitteln (beispielsweise Chloroform, Cyclohexan) sind ideal für die Herstellung von Lipidfilmen, sind Transmembranproteine ​​in der Regel nur dann stabil, wenn die hydrophobe Transmembrandomäne in einer Lipiddoppelschicht eingebettet ist, oder durch ein Detergens Mizelle umgeben ( beispielsweise bei der Proteinreinigung). Somit ist das Ausgangsmaterial für eine Rekonstitution typischerweise nativen Membranen, gereinigtes Protein in einer Reinigungslösung oder kleinen unilamellaren proteinhaltigen Vesikel (Proteo SUVs) und / oder multilamellare Vesikel (MLVs Proteopolysaccharide) durch Entfernung des Detergens in das gebildete Gegenwart von Lipiden. Die meisten Methoden, diese Membranproteine ​​in GUVs integrieren sich in drei Kategorien.

Direkter Insertion: Transmembranprotein in Waschmittel suspendiert ist mit vorgeformten, lipid nur mild solubilisiertem GUVs vermischt und das Waschmittel dann mit Bio-Beads ²¹ entfernt. Obwohl vom Konzept her einfach, erfordert dieses Verfahren eine genaue Steuerung der Waschmittelkonzentration, da ein zu hoher Waschmittelkonzentration die GUVs während eine zu geringe Konzentration kann bewirken, dass das Protein zu entfalten oder Aggregat aufzulösen.

GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein in Proteo-SUVs mit vorgeformten, lipid nur GUVs Kombination und Verschmelzung wird mit speziellen fusogenen Peptide ²² oder Reinigungsmittel ²¹ erleichtert. Typischerweise ist das Ausmaß der Fusion ist begrenzt, was zu GUVs mit niedrigen Proteindichte.

Dehydratisierung / Rehydratisierung: Ein Protein enthaltenden Lipidfilm wird durch partielle Dehydratisierung einer Proteopolysaccharide SUV (oder Proteo MLV) -Lösung und GUVs gebildet werden dann wie bei einem reinen Lipid-Film aufgewachsen. Die offensichtliche Herausforderung besteht darin, das Protein während der partiellen dehydrati schützenam Schritt ^23, aber das Verfahren wurde erfolgreich verwendet, um Transmembranproteine ​​wie Bakteriorhodopsin, Calcium-ATPase, Integrin und VDAC in GUVs ^7,23 rekonstituieren ^{- 25.}

Dieser Artikel beschreibt die Dehydratisierung / Rehydratisierung Protokolle GUVs welche die spannungsabhängigen Kaliumkanals, KvAP aus der hyperthermophilen Archaea, Aeropyrum pernix machen. KvAP hat einen hohen Grad an Homologie zu eukaryotischen spannungsabhängige Kaliumkanäle ²⁶ und eine bekannte Kristallstruktur ²⁷ , so dass es ein gutes Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Spannung Gating. Die Produktion der Proteo-SUV wurde im Detail beschrieben worden und ist nicht Teil dieses Tutorials ^26,28,29. Wichtig ist, dass KvAP Proteopolysaccharide SUVs nicht für jeden GUV Zubereitung hergestellt werden, wie sie in kleinen (beispielsweise 10 ul) Aliquots bei -80 ° C für längere Zeit (> 1 Jahr) gelagert werden. Elektroformationoder Gel-unterstützte Schwellung kann dann verwendet werden, um aus den GUVs KvAP Proteopolysaccharide SUVs wachsen (oder Proteo MLVs).

Die Schlüsselschritte für die Elektroformation Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Tröpfchen einer Lösung von SUVs, die das Protein enthalten, werden auf Platindrähten (in 2 gezeigt) abgeschieden. Partielle Dehydratisierung der SUV-Suspension zur Bildung eines Lipidproteinfilm durch Fusion des SUVs. Während der Rehydratisierung wird ein Wechselstromfeld an die Elektroden, um die Lipidschichten unterstützen delaminieren und bilden GUVs aufgebracht. Ein Feld 10 Hz funktioniert gut bei der Verwendung von "salzarme" (<5 mM) Rehydrationspuffer ²⁸ und GUVs mehrere Stunden dauern, um zu wachsen. Im Gegensatz dazu physiologische Puffer (mit ~ 100 mM Salz) arbeiten gut mit einer niedrigeren Spannung, 500 Hz Wechselfeld, sondern erfordern einen längeren (~ 12 h) Schwellungen Zeitraum ^15. Dieses Verfahren basiert auf einem früheren Protokoll mit ITO-Folien ²⁴ basiert, aber einen benutzerdefinierten Kammer Fortsetzungaining zwei Platindrähte wie in Abbildung 2 dargestellt (siehe die Diskussion für Design-Details und Anregungen für einfachere, improvisierte Kammern).

Abbildung 3 zeigt die Gel-unterstützte Schwellung Methode. Das Protokoll funktioniert gut mit Puffern mit physiologischer Kochsalzkonzentrationen, ist schnell, und produziert GUVs mit homogener Proteinverteilung. Die Ausbeute an isoliertem offenbar mangelfreien GUVs (dh der GUV Membran Uniform bei optischen Längenskalen und keine Objekte umschließen) jedoch geringer ist, auch wenn es eine ausreichende Anzahl für Patch-Clamp-und Mikromanipulationsexperimente . Diese Methode wurde auf einem Protokoll mit Agarose-Gel, um lipid nur GUVs ¹⁶ zu produzieren und weniger spezialisierte Ausrüstung als die Elektroformation Methode.

Die Charakterisierung GUVs Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, sowie Verfahren unter Verwendung eines Standard-Patch-Clamp-Set-up, ummessen KvAP Aktivität in "inside-out" herausgeschnitten Membranflecken.

Wachsende proteinhaltigen GUVs kann schwieriger als lipid nur GUVs sein. Insbesondere kann die endgültige GUV Ausbeute empfindlich von genau, wie der SUV-Lösung aufgebracht und entwässert, um den Membranstapel bilden, hängen. Für jemanden ohne Vorkenntnisse mit GUVs, kann es hilfreich sein, zuerst wachsen lipid nur GUVs nach einem herkömmlichen Protokoll ^15,16 in dem der Membranfilm wird durch Abscheiden von Lipiden aus einem organischen Lösungsmittel gebildet werden. Sobald der herkömmlichen Protokoll gut funktioniert, kann SUV Abscheidung und teilweise Wasser entzogen dann mit lipid nur Geländewagen, die auch bei der Einstellung des Protokolls für eine neue Lipidzusammensetzung sind sehr hilfreich, gemeistert werden. Wenn GUVs wachsen zuverlässig von lipid nur Geländewagen, dann ist es nur ein kleiner Schritt, um proteinhaltige GUVs von Proteo-SUV zu produzieren.

Protokoll

1. Herstellung der Lösung

1. Bereiten 5 ml "SUV Puffer", der 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) oder Tris (pH 7,5) und 2 mM Trehalose. Filtern des Puffers mit einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter und teilen sich in 1 ml Aliquots, die bei -20 ° C gelagert werden kann.
   HINWEIS: Weitere Einzelheiten für Reagenzien und Instrumente werden in der Liste Materialien.
2. Bereiten Sie 40 ml GUV "Wachstum Buffer ', die die GUV Innenraum während der Film Rehydrierung füllen wird. Für eine "Niedrigsalz" Wachstums kombinieren 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) oder 1 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 400 mM Saccharose. Für eine "physiologische Salzwachstums kombinieren 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) oder 5 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 200 mM Saccharose.
3. Vorbereitung 40 ml "Observation Buffer 'für die externe Lösung im Versuchsraum durch die Kombination von 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) oder 5 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 200 mM Glucose.
   HINWEIS: Diese Puffer sind nur examples. Siehe die Diskussion um die Puffer für andere Experimente anpassen.
4. Messen Sie die Osmolarität der Wachstum und Beobachtung Puffer mit einem Osmometer. Fügen Granulat von Saccharose oder Glucose, um ihnen zu entsprechen weniger als 1%, so dass GUVs nicht aufzulösen oder zusammenbrechen, wenn es von der Wachstumskammer zu der Beobachtungskammer übertragen.
   HINWEIS: In diesem Konzentrationsbereich, Zugabe von 1 mM an Saccharose (13,7 mg pro 40 ml) oder Glucose (7,2 mg pro 40 ml) erhöht Osmolarität von ~ 1 mOsm.
5. Filtern der Wachstum und Beobachtungs Puffer mit einem 0,2 um Filter und im Kühlschrank bei 4 ° C, um das Bakterienwachstum zu hemmen.
6. Man löst 50 mg von Beta-Casein in 10 ml 20 mM TRIS (pH 7,5) Puffer, einen notwendig, um die Oberflächen der Versuchskammern zu passivieren, so daß GUVs kleben nicht, die Ausbreitung und Burst 5 mg / ml beta-Casein-Lösung zu bilden. Sobald das beta-Casein vollständig (bei 4 ° C bis zu mehreren Stunden), Filter (0,2 um) darin gelöst in 0,5 ml Aliquote, die schockgefroren und gelagert werden können,bei -20 ° C für eine spätere Verwendung (aufgetauten Aliquots bei 4 ° C gelagert kann typischerweise bis zu einer 1 Woche verwendet werden).

2. SUV Vorbereitung

1. Vorbereiten und einfrieren Aliquots der Proteo-SUVs im Anschluss an die bisher veröffentlichten detaillierten Protokoll ^28. Verwenden KvAP fluoreszenz Alexa-488 Maleimid in DPhPC SUVs rekonstituiert (10 mg / ml) zu Lipid-Verhältnis von 1:10 (Masse) beziffert mit einem Protein.
   HINWEIS: Wildtyp KvAP enthält ein Cystein pro Monomer in der Nähe der intrazellulären C-Terminus (Aminosäure 247) befindet.
2. Leuchtstoff, Lipid-only SUVs:
   HINWEIS: Die beim Umgang Chloroform unter einer Abzugshaube tragen Nitril Handschuhe und Schutzbrille. Vermeiden Sie die Verwendung eines Kunststoff wie Chloroform sie aufzulösen. Chloroform-Lösungen können in Braunglasflaschen mit Teflon-Kappen gespeichert und übertragen mit Glasspritzen werden. Achten Sie darauf, alle Glaswaren mindestens 5 bis 10 mal mit Chloroform vor und nach dem Pipettieren Lipide spülen.
   1. Bereiten 100 ul10 mg / ml DPhPC SUVs, die 0,5 Mol-% des roten fluoreszierenden Lipids, Texas Red-DHPE, indem 100 ul DPhPC Lösung (10 mg / ml in Chloroform) mit 8,2 & mgr; l von Texas Red-DHPE Lösung (1 mg / ml in Methanol) in einem 1,5-ml-Braunglasfläschchen.
   2. Trocknen Sie die Lipide unter einem Stickstoffstrom in einem Chemieabzug während der Drehung der Flasche. Wenn der Film trocken zu sein scheint, legen die Lipide unter einem Vakuum für 3 h, um restliches Lösungsmittel zu entfernen.
   3. 100 l SUV Puffer in die Lipide und kräftig vortexen bis kein Lipid bleibt an den Wänden des Röhrchens und die Lösung gleichmäßig milchig.
   4. Beschallen die Lipid-Lösung für SUVs zu bilden. Stellen Sie die Flasche, bis es der Ultraschall bewirkt, dass die meisten Bewegung und fließen in das Fläschchen, und kümmern uns nicht um die Lösung unnötig erhitzen. Weiter Beschallung, bis die Lösung durchscheinend oder, wenn möglich, transparent (2-5 min zur Spitze Beschallung, ~ 20 Minuten für die Behandlung in einem Ultraschallbad).
   5. Aliquot SUVs (beispielsweise 10 ul oder 20 ul) und Kühlschrank (-20 ° C) für eine spätere Verwendung.
      HINWEIS: Lipide, insbesondere ungesättigten Lipiden, kann leicht Zusammenbruch. Shop Lipidlösungen bei 20 ° C (oder 80 ° C) unter Argon und innerhalb von 6 Monaten. Lipidabbauprodukte mit Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden.

3. GUV Wachstum von Elektroformation

1. Bereiten Sie die Elektroformation Kammer.
   1. Wenn die Kammer nicht gereinigt wurde, entfernen Sie die Fenster, wischen Sie alle Dichtungsmasse und Fett, extrahieren Sie die Kabel, und spülen Sie und reiben Sie die Kammer mit mit Wasser und Ethanol (≥70%) abwechselnd ein Gewebe.
   2. Reiben Sie die Drähte gut, tauchen die Drähte und Kammer in Aceton und beschallen für 5 min. Wischen Sie alles mit einem Gewebe wieder mit Aceton. Setzen Sie die Kammer in Ethanol und beschallen für 5 min.
   3. Setzen Sie die Kammer, indem Sie die Kabel durch die Löcher und drehen, und wischen Sie die Kabel, um sicherzustellen, sie ARe sauber. Setzen Sie die Kammer mit destilliertem Wasser, beschallen für 5 min und die Kammer mit einem Strom von Stickstoff oder Luft trocknen.
2. Vorbereitung 30 ul 3 mg / ml SUV-Suspension in SUV-Puffer. Zur Bildung proteinhaltigen GUVs kombinieren 8 ul Proteopolysaccharide SUVs (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 ul von fluoreszierenden SUVs (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) und 20 ul SUV Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für eine abschließende Protein zu Lipid (Masse) Verhältnis von 1: 12,5 und 0,1 Mol-% TexasRed-DHPE. Mischen Sie die Lösung kräftig.
   1. Alternativ kann, um das Protokoll mit lipid nur SUVs Praxis einfach kombinieren 10 ul Fluoreszenz SUVs (10 mg / ml DPhPC und 0,5 mol% TexasRed-DHPE) mit 20 ul SUV Puffer.
3. Zahlen Sie den SUV-Lösung.
   1. Verwenden Sie ein 2 ul Pipette oder 5 ul Glasspritze zu klein (<0,2 ul) Tröpfchen der SUV-Lösung auf den Drähten zu hinterlegen. Etwa 1 ul der Lösung benötigt wird, um eine Reihe von Tropfen entlang bilden1 cm Draht. Achten Sie darauf, die Tropfen sind klein genug, und mit Abstand weit genug voneinander entfernt, dass sie sich nicht berühren oder die Sicherung.
   2. Lassen Sie die abgeschiedenen SUVs trocknen für ca. 30 Minuten im Freien. Wenn alle Tropfen angesiedelt haben, drehen Sie den Draht, so dass die Lipidablagerungen lassen sich leichter mit dem Mikroskop beobachten.
      HINWEIS: Wenn die SUVs nicht ausreichend trocknen, sie einfach zu waschen können von den Leitungen, wenn die Wachstumspuffer wird zugegeben, während der Trocknung zu viel kann das Protein beschädigen. Da die Luftfeuchtigkeit beeinflußt die Trocknungsgeschwindigkeit, der Trocknungszeit und / oder Luftfeuchte kann für optimale Ergebnisse ³⁰ eingestellt werden. Der Lipidfilm auf den Drähten sollte unter dem Mikroskop sichtbar.
4. Setzen Sie die Kammer.
   1. Verschließen Sie die Kammer unten: mit einer Spritze Vakuumfett auf den Boden der Kammer um die drei Brunnen gelten, und drücken Sie eine 40 mm x 22 mm Deckglas sanft gegen sie den Kammerboden zu versiegeln, so dass es ohne eine Lücke haftet. Dichten Sie die Seiten der Kammer (wo die Drähte Ausgang) mitDichtpaste. Bewerben Vakuumfett auf der Oberseite der Kammer umreißt die drei Brunnen.
   2. Langsam Wachstums Puffer, bis jeder Vertiefung nach oben befüllt. Vermeiden Sie schnelle Bewegung der Lösung in den Vertiefungen, da dies den Lipidfilm aus den Elektroden zu strippen.
   3. Die Kammer, indem Sie die obere Abdeckung Schieber vorsichtig auf das Fett, kümmert sich nicht um die untere Deckglas entfernen. Verwenden Sie eine Gewebe irgendwelche Tropfen Puffer an den Rändern der oberen Deckglas entfernen.
      Hinweis: Dies ist ein guter Zeitpunkt, um die Kammer unter dem Mikroskop untersucht, um zu bestätigen, dass die Lipidfilm wurde auf die Drähte geblieben.
5. Verbinden Sie den Signalgenerator an die Drähte mit zwei Krokodilklemmen. Stellen Sie die Frequenz (10 Hz / 500 Hz Sinuswelle für hohen / niedrigen Salzpuffer) und mit einem Multimeter messen und die Spannung an den Leitungen von 0,7 / 0,35 V quadratischer Mittelwert (V effektiv) für den hohen / niedrigen Salzpuffer. Decken Sie die Kammer mit einer Aluminiumfolie, um die Fluorophore vor Licht zu schützen. Lassen ter GUVs für 2 bis 3 h bei der niedrigen Salzpuffer und 12 h oder O / N für die Hochsalzpuffer wachsen.
6. Trennen Sie die Kammer aus dem Generator und sorgfältig legen Sie sie auf einem inversen Mikroskop GUV Wachstum zu bewerten. Verwenden langsame, stetige Bewegungen oder Flüssigkeitsströmung in den Vertiefungen kann vorzeitig abzulösen GUVs von den Drähten.
   HINWEIS: GUVs an den Drahtkanten sind in der Regel im Phasenkontrast (40X großen Arbeitsabstand Ziel) sichtbar, während GUVs überall auf der unteren Hälfte der Drähte mit Epifluoreszenz ersichtlich. Wenn keine GUVs sichtbar sind, drehen Sie die Kabel an der oberen Fläche zu suchen. GUVs können bei 4 ° C in einer Wachstumskammer für mehrere Tage gelagert werden.

4. GUV Wachstum durch Gel-unterstützte Schwellung

1. Herstellung von 10 ml einer 1% igen Lösung, die durch Mischen von 100 mg Agarose mit 10 ml reinem Wasser. Erhitzen Sie es, bis es, indem Sie es in der Mikrowelle bei 480 W für ~ 20 Sekunden kocht. Rühren Sie um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig gelöst ist.
   HINWEIS: Die Lösungkönnen bei 4 ° C gelagert und bei Bedarf wieder aufgeheizt werden.
2. Plasma-sauber (Luft-Plasma) eine Abdeckung Rutsche für 1 Minute, so dass das Agarose-Lösung wird gut darauf verteilen. Verwenden Sie die Cover-Folien in den nächsten 15 Minuten, wie die Wirkung der Plasmareinigung nachlässt schnell.
3. Anwenden 200 ul warmes Agaroselösung zu jedem 22 x 22 mm ² Schieber so der Lösung benetzt die gesamte Fläche. Neigen Sie den Schiebe vertikal und berühren Sie die Unterkante auf ein Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und nur eine dünne glatte Schicht aus Agarose auf der Folie.
4. Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte oder Ofen bei 60 ° C und lassen Sie es für mindestens 30 Minuten trocknen lassen. Die Agarose Films mit dem Auge kaum sichtbar. Nachdem die Objektträger zu kühlen RT, verwenden Sie sie sofort, oder speichern Sie sie für bis zu einer Woche in einem geschlossenen Behälter bei 4 ° C.
5. Legen Sie die Agarose-beschichtete Deckglas in einem Standard 3,5 cm Petrischale.
6. Bereiten Sie das SUV-Lösung, wie in Abschnitt 3.2 und gelten ~ 15 ul der SUV-Lösung (3 mg / ml Lipid) in~ 30 kleinster Tropfen vorsichtig auf die Agarose-Oberfläche. Achten Sie darauf, die Agarose-Schicht zu stark verzerren.
7. Legen Sie die Objektträger unter einem leichten Stickstoffstrom für ca. 10-15 min und folgen Sie dem Verdampfen des Puffers mit dem Auge als die Tröpfchen trocknen.
8. Sobald die SUVs getrocknet sind, fügen Wachstum Puffer, um die Gleitfläche zu decken. Für eine kleine 3,5 cm Petrischale Gebrauch ~ 1 ml Puffer.
9. Lassen Sie die Schwellung für ~ 30 min gehen, und überprüfen Sie das Wachstum von GUVs in der Kammer mit einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC).
   HINWEIS: Epifluoreszenz Beobachtung ist schwierig aufgrund der starken Hintergrund der Fluorophore in dem Gel und der Autofluoreszenz der Agarose.

5. Ernte und Observing GUVs

1. Passivieren des Beobachtungskammer (zB kleine Petrischale oder Deckglas), so dass GUVs kleben nicht, zu verbreiten und brach auf dem Kammerboden. Decken Sie die Chamber Boden mit Beta-Casein-Lösung, Inkubation für 5 min, spülen Sie den Casein-Lösung mit reinem Wasser, trocken mit einem Strom von Luft oder Stickstoff, und schließlich fügen Beobachtung Puffer (zB ~ 5 mm Tiefe für eine kleine Petrischale).
2. Ernten Sie die GUVs. Schneiden Sie das Ende eines 100 ul Pipettenspitzen, so dass die Öffnung größer (~ 2 mm Durchmesser) und streben langsamer als die Schubspannung von Pipettieren kann leicht zerstört GUVs.
   1. Für elektro gebildet GUVs, öffnen Sie die Wachstumskammer durch leichtes Entfernen der oberen Deckglas. Legen Sie die Pipettenspitze direkt über jeden Draht und saugen ~ 50 & mgr; l, während Sie die Pipettenspitze entlang des Drahtes, um die GUVs lösen.
      HINWEIS: Es kann helfen, um den Draht zu GUVs auf der "anderen Seite" des Drahtes sammeln drehen.
   2. Für "Gel-unterstützte Schwellung" GUVs, tippen Sie auf die erste Seite der Petrischale ein paar Mal zu helfen, die GUVs lösen sich von der Deckfläche. Positionieren Sie die Pipettenspitze knapp über dem Deckglas und saugen, während 50 & mgr; pulling die Spitze über die Oberfläche zurück. Direkt an eine Beobachtungskammer, oder speichern zu übertragen geerntet GUVs in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
3. Legen Sie die Beobachtungskammer auf einem inversen Mikroskop, fügen Sie die GUVs zu der Beobachtungskammer, und ein paar Minuten warten, bis die GUVs am Kammerboden absetzen.
4. Umfrage der Kammer mit Phasenkontrast oder DIC, um schnell glatt, kugelförmig ("fehlerfrei") "GUV-Kandidaten". Untersuchen Sie jeden "GUV Kandidat" in Epifluoreszenz, alle, die kleiner Liposomen innerhalb verschachtelt auszuschließen. Schließlich prüfen, ob die Lipidfluoreszenzintensität ist einheitlich und kompatibel mit einer einzigen Membran (dh unilamellaren).
   HINWEIS: In einigen bilamellare (oder multilamellare) Vesikel sind die Membranen zu dicht beieinander, um gelöst werden, so dass sie in unilamellare Phasenkontrast oder DIC Bilder werden angezeigt. Jedoch können diese Gegenstände aus tatsächlichen unilame unterscheidenllar GUVs durch ihre Lipid Fluoreszenz, die zwei Mal (oder mehr) heller ist.

6. Patch-Klemm GUVs

1. Stellen Sie Patch-Pipetten mit einer 1-2 um Spitzendurchmesser von Standard-Borosilikat-Glas-Kapillare mit Hilfe des Programms für die Pipette Abzieher empfohlen.
   HINWEIS: Nur spezielle Behandlungen wie Feuerpolitur sind nicht erforderlich, und Pipetten können für mehrere Tage, nachdem sie zuvor gezogen, wenn sie in einer geschlossenen Box aufbewahrt werden.
2. Passivieren der Kammer durch Inkubation mit einem Beta-Casein-Lösung (5 mg / ml), um sicherzustellen, dass GUVs nicht anhaften, die Ausbreitung und Bruch an Kammeroberflächen. Spülen Sie das Kasein nach 5 min.
3. Legen Sie die Masseelektrode, füllen Sie die Kammer mit Beobachtung Puffer übertragen 10 ul der GUV-Suspension, wie in Schritt 5.2 und 5.3 beschrieben, und ein paar Minuten warten, bis die GUVs am Boden absetzen.
4. Füllen Sie einen frischen Patch-Pipette mit Lösung (Beobachtung Puffer oder anderen isoosmotisch Lösung) undbringen Sie es am Patch-Clamp-Verstärker heads.
5. Suche durch die Kammer, um einen "fehlerfreie" GUV finden wie in Kapitel 5.4 beschrieben, und prüfen Sie ihn fluoreszierendes Protein enthält.
6. Tragen Sie einen konstanten Überdruck (> 100 Pa oder ungefähr 1 cm H ₂ O in einem Manometer), um die Patch-Pipette Innenraum sauber zu halten, und legen Sie die Patch-Pipette in die Kammer. Bringen Sie die Patch-Pipette in das Sichtfeld, gelten Testimpulse zur Messung / Kompensation der Pipette Spannungsoffset und Widerstand, und untersuchen Sie die Pipette unter Fluoreszenzbeleuchtung, um zu bestätigen, dass die Spitze sauber ist.
7. Bringen Sie die Patch-Pipette auf die GUV und, falls erforderlich, den Überdruck gleichzeitig zu reduzieren, so das Ausströmen aus der Patch-Pipette macht nicht den GUV "Durchgehen". Wenn der Patch-Pipette in der Nähe des GUV gelten einen Unterdruck (bis zu 5 cm H ₂ O), um das GUV gegen die Patch-Pipette zu ziehen. Überwachen Sie den Widerstand als "; Zunge "der GUV-Membran in die Patch-Pipette und die Gigaseal Formen.
8. Wenn ein Gigaseal nicht gebildet hat, ziehen Sie den Patch-Pipette aus der Kammer und wieder mit Schritt 6.4. Wenn der Membranfleck bildeten eine undurchlässige, aber der GUV bleibt an der Pipette befestigt, herausschneiden den Patch, indem Sie von der GUV, platzt die GUV gegen den Kammerboden oder kurz Bewegen der Pipette aus der Lösung aus.
9. Wenn der inside-out Membranfleck aus der GUV herausgeschnitten worden und die Gigaseal stabil ist, schalten Sie die Testimpulse und eine Spannung Protokoll wie die in Abbildung 13 dargestellt.
   HINWEIS: Abbildung 13 folgt dem Standard elektroKonvention für eine Inside-Out-Patches, in der Strom in den Patch-Elektrode fließt, ist "positiv" und V = _V-Bad - V _Pipette. Halten Sie den Patch auf einem negativen Potential (zB V = -100 mV) für ~ 30 sec Stellen KvAP im Ruhezustand, während Schritte (100 ms bis 5 s) zu positiveren Potentialen (zB kann V = 100 mV), dann fahren sie in die Durchführung (dh offen) aktiv Staaten.
10. Nach Messungen an einer Membran-Patch fertig sind, brechen Sie den Patch mit zap oder Druckimpuls und prüfen, ob der Spannungsoffset des Patch-Elektrode nicht getrieben. Entfernen Sie die Patch-Pipette aus der Kammer, und kehren Sie zu Schritt 6.4.

Ergebnisse

Das Wachstum GUVs schnell durch Untersuchen der Wachstumskammer unter dem Mikroskop ausgewertet werden. Für Elektroformation neigen die GUVs in Bündeln längs der Platindrähte wachsen, wie in Figur 4 gezeigt ist. Während Gel gestützten Schwellung, erscheinen GUVs als sphärische Strukturen, die schnell wachsen und miteinander verschmelzen (Abbildung 5).

Mangelfreien GUVs leichter identifiziert und nach der Übertragung auf eine Beobachtungskammer ausgew...

Diskussion

Biomimetische Modellsysteme sind ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Eigenschaften und Wechselwirkungen von Proteinen und Membranen. Im Vergleich zu anderen wiederhergestellten Systeme wie BLMs oder unterstützte Lipidmembranen, GUV-basierte Systeme weisen mehrere Möglichkeiten, wie zB erhebliche Kontrolle über die Zusammensetzung der Membran, Spannung und Geometrie, sowie als wahrhaft ölfrei. Einbeziehung Transmembranproteine, wie KvAP in GUVs Jedoch erfordert erhebliche Anpassungen herkömmlicher Proto...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840101P
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375P
cholesterol (ovine wool, >98%)	Avanti Polar Lipids	700000P
TRed-DHPE	Invirtogen	T-1395MP	labeled lipid
BPTR-Ceramide	Invirtogen	D-7540	labeled lipid
Choloroform	VWR	22711.290	AnalaR Normapur
Acetone	VWR	20066.296	AnalaR Normapur
Ethanol	VWR	20821.330	AnalaR Normapur
Kimwipe	Kimtech	7552
Hamilton syringes	Hamilton Bonaduz AG		diverse
Amber vials and teflon cups	Sigma	SU860083 and SU860076
Parafilm	VWR	291-1214
microcentrifuge tube	eppendorf		diverse
Agarose	Euromex	LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
Sucrose	Sigma	84097-1kg
Glucose	Sigma	G8270-1kg
Trehalose	Sigma	T9531-25G
KCl	Sigma	P9333-1kg
Hepes	Sigma	H3375-100G
TRIS	Euromex	EU0011-A
Osmometer	Wescor	Vapro
pH meter	Schott instruments	Lab850
Sonicator	Elmasonic	S 180 H
Syringe filter 0.2µm	Sartorius steim	Minisart 16532
Function generator	TTi	TG315
Platinum wires	Goodfellow	LS413074	99.99+%, d=0.5mm
Polytetrafluoroethylene	Goodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'	VWR	1597418
sealing paste	Vitrex medical A/S, Denmark	REF 140014	Sigillum Wax
Cover slides 22x40 mm No1,5	VWR	631-0136
Cover slides 22x22 mm No1,5	VWR	631-0125
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G	airplasma, setting 'high'
petri dishes	Falcon BD	REF 353001	3.5 cmx1cm
patch clamp amplifier	Axon instruments	Multiclamp700B
DAQ Card	National Instruments	PCI-6221
Labview	National Instruments	version 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm	Harvard Apparatus	GC100-15
Electrode holder	Warner Instruments	Q45W-T10P
Micromanipulator	Sutter	MP-285
pipette puller	Sutter	P-2000
Camera	ProSilica	GC1380
Zeiss microscope	Zeiss	Axiovert 135
Objective	Zeiss		40x long working distance, Phase contrast
Objective	Zeiss		100x Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488)	Horiba	XF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed)	Horiba	XF101-2
beta-casein	Sigma	C6905-1G
confocal microscope	Nikon Eclipse TE 2000-E		D-Eclipse C1 confocal head
Objective	Nikon		Plan Fluor 100× NA1.3
matlab	Mathworks		for image processing and analysis of the current traces