Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований

Резюме

Восстановление трансмембранного белка, KvAP, в гигантские однослойные везикулы (GUVs) демонстрируется в течение двух методов дегидратации-регидратации - electroformation, и гель-помощь набухания. В обоих методах, небольшие однослойные везикулы, содержащие белок слиты вместе, чтобы сформировать GUVs, которые затем могут быть изучены с помощью флуоресцентной микроскопии и патч-зажим электрофизиологии.

Аннотация

Гигантский однослойные везикулы (GUVs) являются популярным биомиметический системой для изучения мембран связанные с ней явления. Тем не менее, обычно используются протоколы расти GUVs должны быть изменены, чтобы сформировать GUVs содержащие функциональные трансмембранных белков. Эта статья описывает два способа дегидратации-регидратации - electroformation и гель-помощь отеки - сформировать GUVs, содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP. В обоих способах раствор белка, содержащего небольшие однослойные пузырьки частично обезвоженной чтобы сформировать стопку мембран, который затем дают набухнуть в буфере повторной гидратации. Для метода electroformation, пленка наносится на платиновыми электродами, так что поле переменного тока могут быть применены во пленки регидратации. В отличие от этого, способ отек гель-помощь использует агарозном геле подложку пленки для повышения регидратации. Оба метода могут производить GUVs в низких (например, 5 мМ) и физиологических (например, 100 мм) концентрации соли, Полученные GUVs характеризуются с помощью флуоресцентной микроскопии, и функция восстановленных каналов измеряется с использованием конфигурации патч-зажим наизнанку. В то время как опухоль в присутствии электрического поля переменного (electroformation) дает высокий выход бездефектных GUVs, метод отек гель-помощь производит более равномерное распределение белка и не требует никакого специального оборудования.

Введение

При изучении физических принципов, которые регулируют живые системы, снизу вверх подходы позволяют экспериментатор контролировать состав системы и другие параметры, которые не так легко манипулировать в клеточных систем ^1. Для мембранных процессов на основе Giant однослойные везикулы (GUVs, диаметр ~ 1-100 мкм), оказались очень полезным Биомиметические Система ^{2 - 7,} как они хорошо подходят для микроскопических исследований и микроманипуляций ^{8 - 10.} В то время как есть много различных протоколов для производства GUVs, большинство делятся на две категории - эмульсия на основе подходов ^11,12 и методы, основанные на станавливающим липидной пленки ^{13 - 16.} В эмульсионных основе методов, внутренние и внешние листовки GUV мембран собраны последовательно от липидных монослоев на вода / масло интерфейсов. Этот подход является идеальным для инкапсуляции растворимые белки св GUVs, и для формирования GUVs с асимметричной композиции листовка липидов. Тем не менее, GUVs, образованные из эмульсий может сохранить следы растворителя, которые изменяют механические свойства мембраны ^17, и подход не является особенно хорошо подходит для транс-мембранного восстановления белка.

Способы пленки регидратации рассчитывать на то, что сушка (обезвоживание) вызывает много смеси липидов с образованием нескольких слоистую стопку мембран. Если это стопка затем помещают в контакт с водным буфером, мембраны в стеке будет раздвигаться в качестве растворителя потоков между ними, а на поверхности штабеля, отдельные мембраны могут отделить, чтобы сформировать GUVs ^13,18 (а настоящую зоопарка другие липидные объектов). Тем не менее, даже в оптимальных буферных и липидных композиций, этот метод классических "спонтанное набухание" имеет относительно низкий выход бездефектных GUVs. Один широко используемый метод для повышения урожайности бездефектных GUVs является "electroformation221 ;, в котором поле переменный ток (AC) применяется при фильма регидратации. В то время как механизм остается плохо изученным, "electroformation" может дать впечатляющие урожаи ПРАВ (> 90% при благоприятных условиях) для концентрации буферов с низким содержанием соли (<5 ммоль) ^14,19, и может работать даже в физиологических буферов (~ 100 мм) с использованием Более высокая частота (500 Гц против 10 Гц) переменного поля и платиновые электроды ^15. Альтернативный подход, чтобы повысить выход бездефектных GUVs является "гель-помощь отек", в котором липид раствор наносят на полимерную подложку гель, а не пассивным (например, стекло, PTFE) подложки используется в классической "спонтанной набухания ". Когда результате окисления липидов / гель фильм регидратации, GUVs может быстро сформировать даже по физиологическим буферов ^16,20.

Все эти методы могут производить липидов только GUVs, которые могут быть использованы для изучения мембранных связаны такие явления, какВзаимодействие между растворимых белков и мембран. Тем не менее, чтобы включать транс-мембранного белка в GUVs, значительные изменения необходимы, чтобы гарантировать, что белок остается в функциональном состоянии в течение всей процедуры восстановления. В то время как растворы липидов в органических растворителях (например, хлороформ, циклогексан) идеально подходят для изготовления пленок липидов, транс-мембранные белки, как правило, только стабильны, когда их гидрофобным трансмембранным доменом встроен в липидный бислой или окружен моющего средства мицеллы ( например, во время очистки белков). Таким образом, исходный материал для восстановления, как правило, родной мембраны, очищенный белок в растворе моющего средства, или небольшие однослойные белка, содержащего везикулы (Proteo-внедорожников) и / или мульти-пластинчатые везикулы (Proteo-ГРЩ), образованные при удалении моющего средства в Наличие липидов. Большинство методов, чтобы включить эти мембранные белки в GUVs делятся на три категории.

Прямая Insertioн: Транс-мембранный белок приостановлено в производстве моющих средств смешивают с предварительно сформированным, липидов только, мягко моющих растворенных GUVs и моющим средством, затем удалить с помощью biobeads ^21. В то время как концептуально простой, этот метод требует точного контроля концентрации моющего средства, а слишком высокая концентрация моющего средства может растворять GUVs то время как слишком низкой концентрации могут вызвать белок разворачиваться или агрегировать.

GUV / Proteo-внедорожник Fusion: Белок в протеобактерий-внедорожников в сочетании с заранее сформированным, липидов только GUVs и слияние способствует специальными фузогенные пептидов ²² или моющего средства ^21. Обычно степень плавления в ограниченной приводит к GUVs с низкой плотностью белка.

Обезвоживание / Регидратация: белок, содержащий липидную пленку формируют путем частичного обезвоживания Proteo-SUV (или Proteo-MLV) раствора и GUVs которые затем выращивали в течение чистого липидной пленке. Очевидно, задача состоит в том, чтобы защитить белок во время частичного dehydratiна этапе ^23, но метод был успешно использован для восстановления транс-мембранных белков, таких как Бактериородопсин, кальций-АТФазы, интегрина и VDAC в GUVs ^{7,23 - 25.}

В этой статье описаны протоколы дегидратации / регидратации, чтобы GUVs содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP, с гипер-термофильные археи, Aeropyrum pernix. KvAP имеет высокую степень гомологии в эукариотической напряжения зависимых калиевых каналов ²⁶ и известную кристаллическую структуру ²⁷ , что делает его хорошей моделью для изучения механизма напряжения стробирования. Производство протеобактерий-внедорожников был подробно описан ранее, и не является частью данного руководства ^26,28,29. Важно отметить, что KvAP Proteo-внедорожников не должны быть подготовлены для каждого препарата ГУВ, как они могут быть сохранены в небольших (например, 10 мкл) аликвотах при -80 ° С в течение длительных периодов времени (> 1 год). Electroformationили гель-помощь опухоль может быть использован для выращивания GUVs от KvAP протеобактерий-внедорожников (или Proteo-ГРЩ).

Ключевые шаги для протокола electroformation показаны на рисунке 1. Капли раствора внедорожников, содержащих белок осаждаются на платиновых проводов (как показано на рисунке 2). Частичное обезвоживание суспензии на SUV приводит к образованию липидов белка пленки путем слияния внедорожников. Во время регидратации переменного поля, приложенного к электродам, чтобы помочь липидные слои отслаиваются и образуют GUVs. Поле 10 Гц работает хорошо при использовании "с низким содержанием соли" (<5 ммоль) регидратация буфер ²⁸ и GUVs занять несколько часов, чтобы расти. В отличие от этого, физиологические буферы (содержащий ~ 100 мм соль) хорошо работают с меньшим напряжением, 500 поле Гц переменного тока, но требуют длительного (~ 12 ч) отек период ^15. Этот метод основан на более ранней протокола с использованием ИТО скользит ^24, но использует пользовательский камеры продолжениеAining два платиновых провода, как показано на рисунке 2 (см дискуссию для проектирования деталей и предложения по проще, самодельные камеры).

Фиг.3 иллюстрирует способ отек гель-помощь. Протокол хорошо работает с буферами с физиологических концентрациях соли, протекает быстро, и производит GUVs с более однородным распределением белка. Тем не менее, выход из изолированных, по-видимому, без дефектов GUVs (т.е. GUV мембрана однородна по оптической длины масштабах и не заключать какие-либо предметы) ниже, хотя он обеспечивает достаточное количество для патч-зажим и микро-манипуляции экспериментов , Этот метод был основан на протоколе с использованием агарозном геле с получением липидов только GUVs ¹⁶ и требует специального оборудования меньше, чем метод electroformation.

Характеристика GUVs с флуоресцентной микроскопии описано, а также процедуры с использованием стандартного патч-зажим набора кизмерения KvAP деятельность в "наизнанку" вырезали мембраны патчи.

Рост содержащие белок GUVs может быть более сложным, чем липидных только GUVs. В частности, конечный выход ГУВ может зависеть от чувствительно точно, как SUV раствор осаждают и обезвоженной, чтобы сформировать стопку мембран. Для человека без каких-либо предыдущий опыт с GUVs, это может быть полезно, чтобы первые растут липидов только GUVs после обычного протокола ^15,16, в котором мембрана пленка, путем осаждения липидов из органического растворителя. После того, как обычный протокол работает хорошо, осаждение внедорожник и частичное обезвоживание может быть освоено с помощью липидов только внедорожники, которые также очень полезны при настройке протокола для нового состава липидов. Когда GUVs расти надежно от липидных только внедорожников, это то только маленький шаг для получения белка, содержащего GUVs из протеобактерий-внедорожников.

протокол

1. Решение Подготовка

1. Подготовка 5 мл буфера "джипа", содержащего 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES (рН 7,4) или трис (рН 7,5) и 2 мМ трегалозы. Фильтр буфер с шприцевой фильтр 0,2 мкм и разделить на 1 мл аликвоты, которые могут храниться при температуре -20 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация для реагентов и приборов даны в списке материалов.
2. Подготовка 40 мл ПРАВ "роста буфера", который наполнит ПРАВ интерьер во пленки регидратации. Для '' с низким содержанием соли роста, объединить 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES (рН 7,4) или 1 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 400 мМ сахарозы. Для '' физиологический солевой роста, объединить 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) или 5 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 200 мМ сахарозы.
3. Подготовка 40 мл буфера 'наблюдения' для внешнего раствора в экспериментальной камере путем объединения 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) или 5 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 200 мМ глюкозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти буферы только EXAmples. Смотрите обсуждение адаптировать буферы для других экспериментов.
4. Измерьте osmolarities роста и наблюдения буферы с осмометра. Добавить гранулы сахарозы или глюкозы, чтобы соответствовать им в пределах 1%, так что GUVs не растворит или свернуть, когда перевели из камеры роста на смотровую камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом диапазоне концентраций, добавив 1 мМ сахарозы (13,7 мг на 40 мл) или глюкозы (7,2 мг на 40 мл) повышает осмолярность от ~ 1 мОсм.
5. Фильтр роста и наблюдения буферы с 0,2 мкм фильтр и хранить их при 4 ° С для ингибирования роста бактерий.
6. Растворите 50 мг бета-казеина в 10 мл 20 мМ Трис (рН 7,5) буфера с образованием 5 мг / мл бета-казеина раствор, необходимый для пассивации поверхности экспериментальных камер, так что GUVs не прилипают, распространение и разрыва. После того, как бета-казеин полностью не растворится (до нескольких часов при 4 ° С), фильтр (0,2 мкм) его в 0,5 мл аликвоты, которые могут быть заморожены и хранитьсяпри -20 ° С для последующего использования (размороженных аликвоты хранили при 4 ° С, как правило, могут быть использованы на срок до 1 недели).

2. SUV Подготовка

1. Подготовка и заморозить аликвот протеобактерий-внедорожников, следующих за ранее опубликованные подробный протокол ^28. Используйте KvAP флуоресцентно меченных с Alexa-488 малеимид, восстановленного в DPhPC внедорожников (10 мг / мл) в соотношении белка в липидной 1:10 (по массе).
   ПРИМЕЧАНИЕ: дикого типа KvAP содержит один цистеин на мономер находится рядом с внутриклеточной С-конца (аминокислоты 247).
2. Флуоресцентные липидные только внедорожники:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ручка хлороформ под вытяжкой носить нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте использования любого пластика, как хлороформ могут растворять их. Хлороформ растворы можно хранить в стеклянных флаконах янтарного с тефлоновыми крышками и переносят с помощью шприца стекла. Позаботьтесь, чтобы промыть все посуды по меньшей мере, от 5 до 10 раза хлороформом до и после пипетки липидов.
   1. Подготовьте 100 мкл10 мг / мл DPhPC внедорожников, содержащие 0,5 моль% от красного флуоресцентного липида, Texas Red-DHPE, путем смешивания 100 мкл раствора DPhPC (10 мг / мл в хлороформе) с 8,2 мкл раствора техасский красный-DHPE (1 мг / мл в метаноле) в стекл нный сосудик на 1,5 мл янтарного.
   2. Сушат липиды вниз под потоком азота в химической капотом при вращении флакона. Когда появится фильм должна быть сухой, положите липидов под вакуумом в течение 3 ч, чтобы удалить остатки растворителя.
   3. Добавить 100 мкл буфера для SUV липидов и вихревые энергично, пока не липидов не застревает на стенках флакона, и раствор равномерно молочно.
   4. Разрушать ультразвуком липидов раствора с образованием внедорожников. Отрегулируйте флакон позицию, пока УЗИ не вызывает наибольшее движение и поток внутри флакона, и заботиться, чтобы не нагревать решение без необходимости. Продолжить обработку ультразвуком до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, и, когда это возможно, прозрачным (2-5 мин в течение наконечника ультразвуком, ~ 20 мин для ванной ультразвуком).
   5. Aliquoт внедорожники (например, 10 мкл или 20 мкл) и заморозить (-20 ° C) для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: липиды, особенно ненасыщенных липидов, может легко пробоя. Липидов Store Solutions при 20 ° C (или 80 ° C) в атмосфере аргона и использовать в течение 6 месяцев. Липидов продукты распада могут быть обнаружены при помощи тонкослойной хроматографии.

3. GUV рост за счет Electroformation

1. Подготовка electroformation камеру.
   1. Если камера не была очищена, снимите окна, протрите все герметик и смазку, извлеките провода, и промойте и скраб камеру с ткани с использованием воды и этанола (≥70%) попеременно.
   2. Протрите провода и погрузите провода и камеру в ацетоне, и разрушать ультразвуком в течение 5 мин. Протрите все с ткани еще раз, используя ацетон. Поместите камеру в этаноле и разрушать ультразвуком в течение 5 мин.
   3. Соберите камеру, вставив провода через отверстия и поверните и протрите провода, чтобы убедиться, что они аре чистоте. Поместите камеру в дистиллированной воде, разрушать ультразвуком в течение 5 мин и сушат камеру с потоком азота или воздуха.
2. Подготовка 30 мкл 3 мг / мл суспензии в SUV SUV буфера. Для формирования белка, содержащего GUVs, объединить 8 мкл протеобактерий-внедорожников (DPhPC 10 мг / мл KvAP 1:10), 2 мкл флуоресцентных внедорожников (10 мг / мл DPhPC, 0,5 моль% TexasRed-DHPE) и 20 мкл SUV Буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для окончательного белка липидов (по массе) соотношении 1: до 12,5 и 0,1 моль% TexasRed-DHPE. Смешайте раствор энергично.
   1. С другой стороны, на практике протокол с липидами только внедорожников, просто объединить 10 мкл флуоресцентных внедорожников (10 мг / мл DPhPC и 0,5 моль% TexasRed-DHPE) с 20 мкл буфера SUV.
3. Депозит внедорожник решение.
   1. Используйте 2 мкл пипетки или 5 мкл стеклянный шприц для нанесения небольших (<0,2 мкл) капелек внедорожник решения на проводах. Приблизительно 1 мкл раствора необходимо, чтобы образовать ряд капель вдоль1 см проволоки. Убедитесь, что капли достаточно малы и расположены достаточно далеко друг от друга, что они не касаются или предохранитель.
   2. Пусть хранение внедорожники высохнуть в течение ~ 30 мин на открытом воздухе. Когда все капли поселились, поверните провод так, липидные отложения легче наблюдать под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если внедорожники не высыхают достаточно, они могут просто смыть проводов при буфера рост будет добавлен, время сушки слишком много может повредить белок. Потому что влажность воздуха влияет на скорость сушки, время сушки и / или влажности воздуха можно регулировать для достижения оптимальных результатов ^30. Липидную пленку на проводах должны быть видны под микроскопом.
4. Соберите камеру.
   1. Уплотнение основания камеры: С помощью шприца для применения вакуумной смазки в нижней части камеры вокруг трех скважин и пресс 40 мм х 22 мм покровное осторожно против него, чтобы запечатать дно камеры так, чтобы она прилипает без зазора. Печать стороны камеры (где выход провода) сгерметик. Применение вакуумной смазки на верхней части камеры с изложением три скважины.
   2. Медленно добавьте буфер роста, пока каждый хорошо не заполнен до самого верха. Избегайте быстрого движения раствора в лунках, так как это может лишить липидной пленки с электродами.
   3. Закройте камеру, нажав на верхнюю крышку слайд мягко на смазку, стараясь не сместить нижнюю покровное. Использование ткани, чтобы удалить любые капли буфера на краях верхней покровным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошее время, чтобы изучить камеру под микроскопом, чтобы подтвердить, что липидная пленка осталась на проводах.
5. Подключите генератор сигнала к проводам с помощью двух зажимов-крокодилов. Установите частоту (10 Гц / 500 Гц синусоидальной волны для низкой / высокой солевого буфера) и с помощью мультиметра для измерения и регулировки напряжения на проводах до 0,7 / 0,35 В среднеквадратическое (Vrms) для низкой / высокой солевого буфера. Крышка камеры с алюминиевой фольгой для защиты от света флуорофоров. Оставьте тон GUVs расти в течение 2 до 3 ч на низкой солевого буфера и 12 ч или O / N для высокой солевого буфера.
6. Отключите камеру от генератора и осторожно поместите его на инвертированный микроскоп, чтобы оценить рост ПРАВ. Используйте медленный и стабильный движения или потока жидкости в скважинах может преждевременно снять GUVs от проводов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: GUVs на проводе краям обычно видны в фазового контраста (40X большое рабочее расстояние объективной), в то время как GUVs в любом месте на нижней половине проводов можно увидеть эпифлуоресцентной. Если не видны GUVs, можно попробовать повернуть провода, чтобы посмотреть на верхней поверхности. GUVs можно хранить при 4 ° С в ростовой камере в течение нескольких дней.

4. GUV рост за счет Гель-помощь Отек

1. Подготовка 10 мл 1% -ного раствора агарозы путем смешивания 100 мг агарозы с 10 мл чистой воды. Нагрейте его до кипения, поместив его в микроволновой печи при 480 Вт в течение ~ 20 сек. Движение, чтобы убедиться, что агарозы полностью не растворится.
   ПРИМЕЧАНИЕ: решениеможно хранить при 4 ° С и нагревают при необходимости.
2. Плазма-чистые (воздушно-плазменной) крышка-слайд в течение 1 мин, так что раствор агарозы будет распространяться приятно на него. Используйте кавер-слайды в течение следующего 15 мин, как эффект плазменной очистки стирается быстро.
3. Применение 200 мкл теплой агарозном раствора в каждую 22 х 22 мм ² слайда так что раствор смачивает всю поверхность. Наклоните слайд вертикально и касаться нижнего края к ткани, чтобы удалить лишнюю жидкость и оставить только тонкий гладкий слой агарозы на слайде.
4. Поместите слайд на горячей плите или в духовке при температуре 60 ° С и оставить его сохнуть в течение по крайней мере 30 мин. Агарозном фильм едва заметны на глаз. После того, как скользит остыть до комнатной температуры, использовать их немедленно или хранить их в течение одной недели в закрытом контейнере при температуре 4 ° С.
5. Поместите в агарозном покрытием покровное в стандартном 3,5 см чашку Петри.
6. Подготовка внедорожника решение, как в разделе 3.2, и применить ~ 15 мкл внедорожник раствора (3 мг / мл липидов) в~ 30 очень мелкие капли мягко на агарозном поверхности. Будьте осторожны, не искажают агарозном слой слишком много.
7. Поместите слайд в слабом токе азота в течение приблизительно 10-15 мин и последующей испарение буфера на глаз, как капли высыхают.
8. Как только внедорожников высохли, добавить буфер роста, чтобы покрыть поверхность скольжения. Для небольшого 3,5 см чашку Петри использованием ~ 1 мл буфера.
9. Разрешить опухоль протекать в течение ~ 30 мин, а затем изучить рост GUVs в камере с использованием инвертированного микроскопа с фазовым контрастом или дифференциального интерференционного контраста (DIC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: эпифлуоресцентной наблюдение затруднено из-за сильного фоне флуорофорами в геле и автофлуоресценции агарозы.

5. Заготовка и наблюдений GUVs

1. Пассивировать наблюдения камеры (например, небольшой чашке Петри или покровного стекла), так что GUVs не придерживаться, распространение и взрыв на дно камеры. Обложка ЧамBER дно с бета-казеина раствором, инкубируют в течение 5 мин, промыть казеина раствор чистой водой, сушат в токе воздуха или азота, и, наконец, добавляют наблюдения буфер (например, ~ 5 мм глубина за небольшую чашку Петри).
2. Урожай GUVs. Отрежьте конец 100 мкл наконечники пипеток так открытие больше (~ 2 мм в диаметре), и стремятся медленно, как стресс сдвига пипетки может легко разрушить GUVs.
   1. Для электро-образована GUVs, откройте камеру роста, аккуратно удалив верхний покровное. Поместите кончик пипетки прямо над каждой проволоки и аспирации ~ 50 мкл при перемещении пипетки вдоль провода, чтобы отделить GUVs.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помочь повернуть провод, чтобы собрать GUVs на "другой стороне" провода.
   2. Для "Гель-помощь отек" GUVs, сначала нажмите на сторону Петри несколько раз, чтобы помочь GUVs оторваться от поверхности покровного. Расположите кончик пипетки прямо над покровным и аспирации 50 мкл а рulling наконечник обратно на поверхность. Непосредственно передача собранных GUVs на смотровую камеру, или магазин в 1,5 мл трубки микроцентрифужных при 4 ° С в течение 1 недели.
3. Поместите камеры для наблюдений на инвертированный микроскоп, добавьте GUVs на смотровую камеру и подождите несколько минут, для того GUVs, чтобы поселиться в дно камеры.
4. Рассмотрите камеру с фазовым контрастом или DIC, чтобы быстро найти гладкие, сферические ('бездефектных') "GuV кандидатов". Исследуйте каждый "GuV кандидата" в эпифлуоресцентной, чтобы исключить любые, содержащие мелкие липосомы, вложенные в. И, наконец, проверить, что интенсивность флуоресценции липидов является однородным и совместимы с одной мембраной (например, однослойные).
   Примечание: В некоторых bilamellar (или нескольких пластинчатых) пузырьков, мембраны слишком близко друг к другу должны быть решены, чтобы они появились однослойными в фазового контраста или DIC изображений. Тем не менее, эти объекты можно отличить от фактического unilameLlar GUVs по их липидного флуоресценции, что в два раза (или больше) ярче.

6. Патч зажима GUVs

1. Сделайте патч пипетки с диаметром кончика 1-2 мкм от стандартного боросиликатного капиллярного стекла с использованием программы рекомендуется для пипетки съемника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Специальные методы лечения, такие как пожар полировки не нужны, и пипетки можно использовать в течение нескольких дней после того, как были вытащил, если они хранятся в закрытом ящике.
2. Пассивации камеру путем инкубации с раствором бета-казеина (5 мг / мл), чтобы гарантировать, что GUVs не прилипают, распространение и разрыв на поверхности камеры. Промойте казеин отключается после 5 мин.
3. Вставьте заземляющий электрод, заполнить камеру со смотровой буфера, трансфер 10 мкл ГУВ суспензии, как описано в шаге 5.2 и 5.3, и подождите несколько минут, для того GUVs, чтобы поселиться в нижней части.
4. Заполните свежий патч пипетки раствором (наблюдение буфера или другого изо-осмотического раствора) изакрепить его на патч-зажим усилителя headstage.
5. Поиск через камеру, чтобы найти "бездефектной" GuV, как описано в разделе 5.4, и убедитесь, что она содержит флуоресцентный белок.
6. Нанесите постоянную положительную давление (> 100 Па, или примерно 1 см H ₂ O в манометром), чтобы сохранить патч пипетки салон чистый, и вставьте патч пипетки в камере. Принесите патч пипетки в поле зрения, применять тестовые импульсы для измерения / компенсации пипетки напряжение смещения и сопротивления, и изучить пипетку под флуоресцентным освещением, чтобы подтвердить, что наконечник чистый.
7. Принесите патч пипетки к GUV, и, если необходимо, одновременно снизить избыточное давление, так внешнем потоке из патча пипетки не делает ПРАВ "убежать". Когда патч пипетки близко к GUV, применять отрицательное давление (до 5 см H ₂ O), чтобы вытащить ПРАВ против патча пипетки. Монитор сопротивление как "; Язык "из ГУВ мембраны входит патч пипетки и gigaseal формы.
8. Если gigaseal не образуют, удалить патч пипетки из камеры и вернуться к шагу 6.4. Если мембрана патч сформировали gigaseal, но GUV остается прикрепленной к пипетки, вырезать патч, потянув от GUV, заливаясь в GuV против дно камеры, или, коротко, перемещая пипетку из раствора.
9. Когда наизнанку мембраны патч был вырезан из GUV и gigaseal является стабильным, выключите испытательных импульсов и применять протокол напряжения, таких как показано на рисунке 13.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 13 следует стандартной электрофизиологические конвенции о наизнанку патч, в котором ток, протекающий в патч-электрод "позитивный", и V = V _ванна - V _{пипетки.} Проведение патч под отрицательным потенциалом (например, V = -100 мВ) в течение ~ 30 сек мест KvAP в состоянии покоя, в то время как шаги (100 мс до 5 сек) до более положительных потенциалах (например, V = 100 мВ) может загонять его в проводящих (например, открытых) активных состояний.
10. После измерения на мембране патча закончена, разорвать патч с зап или импульса давления и убедитесь, что напряжение смещения патч электрода не дрейфовал. Удалить патч пипетки из камеры, и вернуться к шагу 6.4.

Результаты

Рост GUVs может быть быстро оценена путем анализа ростовой камере под микроскопом. Для electroformation, что GUVs как правило, растут в пучки по платиновых проводов, как показано на рисунке 4. В гель-помощь отек, GUVs появляются в виде сферических структур, которые быстро растут и сливаются вм...

Обсуждение

Биомиметические модели системы являются важным инструментом для изучения свойств и взаимодействия белков и мембран. По сравнению с другими восстановленных систем, таких как БЛМ или поддерживаемых липидных мембран, GUV основе системы представляют несколько возможностей, включая значи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840101P
18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375P
Cholesterol (ovine wool, >98%)	Avanti Polar Lipids	700000P
TRed-DHPE	Invirtogen	T-1395MP	labeled lipid
BPTR-Ceramide	Invirtogen	D-7540	labeled lipid
Choloroform	VWR	22711.290	AnalaR Normapur
Acetone	VWR	20066.296	AnalaR Normapur
Ethanol	VWR	20821.330	AnalaR Normapur
Kimwipe	Kimtech	7552
Hamilton syringes	Hamilton Bonaduz AG		diverse
Amber vials and Teflon cups	Sigma	SU860083 and SU860076
Parafilm	VWR	291-1214
Microcentrifuge tube	Eppendorf		diverse
Agarose	Euromex	LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
Sucrose	Sigma	84097-1kg
Glucose	Sigma	G8270-1kg
Trehalose	Sigma	T9531-25G
KCl	Sigma	P9333-1kg
Hepes	Sigma	H3375-100G
TRIS	Euromex	EU0011-A
Osmometer	Wescor	Vapro
pH meter	Schott instruments	Lab850
Sonicator	Elmasonic	S 180 H
Syringe filter 0.2 µm	Sartorius steim	Minisart 16532
Function generator	TTi	TG315
Platinum wires	Goodfellow	LS413074	99.99+%, d = 0.5 mm
Polytetrafluoroethylene	Goodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'	VWR	1597418
sealing paste	Vitrex medical A/S, Denmark	REF 140014	Sigillum Wax
Cover slides 22 x 40 mm No1.5	VWR	631-0136
Cover slides 22 x 22 mm No1.5	VWR	631-0125
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G	airplasma, setting 'high'
Petri dishes	Falcon BD	REF 353001	3.5 cm x 1 cm
patch clamp amplifier	Axon instruments	Multiclamp700B
DAQ Card	National Instruments	PCI-6221
Labview	National Instruments	version 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm	Harvard Apparatus	GC100-15
Electrode holder	Warner Instruments	Q45W-T10P
Micromanipulator	Sutter	MP-285
Pipette puller	Sutter	P-2000
Camera	ProSilica	GC1380
Zeiss microscope	Zeiss	Axiovert 135
Objective	Zeiss		40X long working distance, Phase contrast
Objective	Zeiss		100X Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488)	Horiba	XF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed)	Horiba	XF101-2
beta-casein	Sigma	C6905-1G
Confocal microscope	Nikon Eclipse TE 2000-E		D-Eclipse C1 confocal head
Objective	Nikon		Plan Fluor 100X NA 1.3
Matlab	Mathworks		for image processing and analysis of the current traces