Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

Abstract

הענק Unilamellar שלפוחית ​​(GUVs) היא מערכת פופולרית biomimetic לחקר התופעות הקשורות קרום. עם זאת, נפוץ פרוטוקולים לגדול GUVs חייב להיות שונה כדי ליצור GUVs המכיל חלבונים הטרנסממברני פונקציונליים. מאמר זה מתאר שתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation ונפיחות בסיוע ג '- כדי ליצור GUVs המכיל אשלגן ערוץ המתח מגודרת, KvAP. בשתי השיטות, פתרון של שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכיל חלבון מיובש באופן חלקי כדי ליצור ערימה של ממברנות, אשר לאחר מכן מותרת להתנפח בחיץ להחזרת נוזלים. לשיטת electroformation, הסרט מופקד על אלקטרודות פלטינה, כך ששדה AC יכול להיות מיושם בהחזרת נוזלי סרט. בניגוד לכך, שיטת הנפיחות בסיוע ג 'משתמשת במצע ג'ל agarose כדי לשפר את התייבשות סרט. שני שיטות יכולות לייצר GUVs ב( למשל, 100 מ"מ) ריכוזי מלח נמוכים (למשל, 5 מ"מ) ופיסיולוגיים. GUVs וכתוצאה מכך מאופיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, והפונקציה של ערוצים מחדש נמדדה באמצעות תצורת תיקון מהדק מבפנים החוצה. בעוד נפיחות בנוכחות שדה חשמלי משתנה חשמלי (electroformation) נותנת תשואה גבוהה של GUVs ללא פגם, שיטת הנפיחות בסיוע ג 'מייצרת הפצת חלבון הומוגנית יותר ולא דורשת ציוד מיוחד.

Introduction

כאשר לומדים את העקרונות הפיסיקליים ששולטים במערכות חיים, גישות מלמטה למעלה תאפשר לשלוט בניסויי הרכב מערכת ופרמטרים נוספים שאינם מניפולציות בקלות במערכות מבוססות תאים 1. לתהליכים מבוססי קרום, Giant Unilamellar שלפוחית ​​(GUVs, קוטר ~ 1-100 מיקרומטר) הוכיחו להיות מערכת biomimetic מאוד שימושית 2-7 כפי שהם מתאימים לבחינה מיקרוסקופית ומיקרומניפולציה 8-10. אמנם יש פרוטוקולים רבים ושונים כדי לייצר GUVs, רוב מתחלקים לשתי קטגוריות - תחליב המבוסס גישות 11,12 וטכניקות המבוססות על rehydrating סרט שומנים 13-16. בשיטות המבוססת על אמולסיה, העלונים הפנימיים וחיצוניים של קרומי הבוס הם התאספו ברצף מmonolayers שומנים בממשקים מים / שמן. גישה זו היא אידיאלית עבור מתמצת חלבונים מסיסים בבGUVs, וגיבוש GUVs עם הרכב שומנים עלון א-סימטרי. עם זאת, GUVs נוצר מתחליבים יכול לשמור עקבות של ממס שמשנות את התכונות מכאניות של הקרום 17, והגישה היא לא במיוחד מתאימה היטב לכינון מחדש חלבון טרנס-קרום.

שיטות להחזרת נוזלי סרט מסתמכות על העובדה שהייבוש (התייבשות) גורם תערובות שומנים רבות כדי ליצור ערימה רבת-שבשבת של ממברנות. אם זה ערימה ממוקמת אז במגע עם חיץ המימי, קרומים בערימה יעברו תזרים בנפרד ממס כביניהם ועל פני השטח של הערימה, קרומי אדם יכולים לנתק כדי ליצור GUVs 13,18 (כמו גם גן חיות אמיתית של אובייקטי lipidic אחרים). עם זאת, גם ליצירות חיץ ושומנים בדם אופטימליות, יש בשיטה זו קלסית "נפיחות ספונטנית" תשואה נמוכה יחסית של GUVs ללא פגם. שיטה נפוצה אחת כדי להגביר את התשואה של GUVs ללא פגם היא "electroformation221 ;, שבו שדה זרם חילופין (AC) מיושם בהחזרת נוזלי סרט. בעוד המנגנון נותר הבין היטב, "electroformation" יכול לתת תשואות בוס מרהיבות (> 90% בנסיבות חיוביות) למאגרי ריכוז נמוך מלח (<5 מ"מ) 14,19, ואפילו יכול לעבוד במאגרים פיסיולוגיים (~ 100 מ"מ) באמצעות תדירות גבוהה יותר (500 הרץ לעומת 10 הרץ) שדה AC ואלקטרודות פלטינה 15. גישה חלופית כדי להגביר את התשואה של GUVs ללא פגם היא "בסיוע ג 'נפיחות", שבו פתרון השומנים מופקד על מצע ג'ל פולימרים ולא פסיבי מצעים (למשל, זכוכית, PTFE) המשמשים ב" נפיחות ספונטנית קלסית ". כאשר סרט השומנים / ג'ל התוצאה הוא rehydrated, GUVs יכול במהירות ליצור אפילו למאגרים פיסיולוגיים 16,20.

כל השיטות הללו יכולים לייצר GUVs שומנים בדם היחיד שיכול לשמש כדי לחקור תופעות קרום הקשורים כגוןאינטראקציה בין חלבונים וקרומים מסיסים. עם זאת, כדי לשלב חלבון טרנס-קרום לGUVs, יש צורך בשינויים משמעותיים כדי להבטיח כי החלבון נשאר במצב תפקודי לאורך כל הליך הכינון מחדש. בעוד פתרונות של שומנים בממסים אורגניים (למשל, כלורופורם, cyclohexane) הם אידיאליים להפקת סרטי שומנים, חלבונים טרנס-קרום הם בדרך כלל יציבים רק כאשר תחום טרנס-הקרום הידרופובי שלהם מוטבע בbilayer שומנים בדם, או מוקף בmicelle חומרי ניקוי ( לדוגמא, במהלך טיהור חלבונים). לפיכך, החומר המוצא לכינון מחדש הוא בדרך כלל קרומי ילידים, חלבון מטוהר בתמיסת ניקוי, או שלפוחית ​​המכיל חלבון unilamellar קטנה (proteo-רכבי שטח) ו / או שלפוחית ​​רבת-שבשבת (proteo-MLVs) שהוקמו על ידי הסרת חומר ניקוי ב נוכחות של שומנים. רוב השיטות לשלב חלבונים בממברנה אלה לGUVs נחלקות לשלוש קטגוריות.

Insertio הישירn: החלבון חוצה הממברנה התלויה בחומר הניקוי מעורבב עם שומנים בדם בלבד, GUVs מראש יצר, בלשון המעטה חומר ניקוי solubilized, וחומרי הניקוי ולאחר מכן להסיר באמצעות biobeads 21. בעוד פשוט מבחינה מושגית, שיטה זו דורשת שליטה מדויקת של ריכוז חומר הניקוי, כגבוה מדי ריכוז חומר ניקוי יכול לפזר את GUVs בעוד נמוך מדי יכול לגרום לריכוז החלבון להתפתח או מצטבר.

בוס / Proteo-SUV Fusion: חלבון בproteo-רכבי שטח בשילוב עם, שומנים רק GUVs מראש יצר והיתוך הוא הקל עם פפטידים מיוחדים fusogenic 22 או חומר ניקוי 21. בדרך כלל היקף ההיתוך מוגבל מוביל לGUVs עם צפיפות חלבון נמוכה.

התייבשות / Rehydration: סרט המכיל שומני חלבון נוצר על ידי התייבשות חלקית של proteo-SUV (או proteo-MLV) פתרון וGUVs לאחר מכן גדל כמו לסרט שומנים טהור. האתגר הברור הוא להגן על החלבון במהלך dehydrati החלקיבשלב 23, אבל השיטה שמש בהצלחה כדי לשקם חלבונים טרנס-קרום כגון Bacteriorhodopsin, סידן-ATPase, integrin וVDAC לGUVs 7,23 - 25.

מאמר זה מתאר פרוטוקולי התייבשות / התייבשות לעשות GUVs המכיל את ערוץ המתח מגודרת אשלגן, KvAP, מpernix החיידקים הקדום, Aeropyrum היפר-thermophilic. יש KvAP רמה גבוהה של הומולוגיה לערוצי אשלגן תלויים מתח אוקריוטים 26 ומבנה הגבישי ידוע 27 , מה שהופך את מודל טוב ללימוד המנגנון של gating מתח. הייצור של proteo-רכבי השטח שתואר בפירוט בעבר ואינו חלק ממדריך זה 26,28,29. חשוב לציין, proteo-רכבי שטח KvAP לא צריך להיות מיוצרים עבור כל הכנת בוס, כפי שהם יכולים להיות מאוחסנים בaliquots הקטן (למשל, 10 μl) ב -80 מעלות צלזיוס למשך פרקי זמן ארוכים (> 1 שנה). Electroformationאו נפיחות בסיוע ג 'לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לגדול GUVs מproteo-רכבי השטח KvAP (או proteo-MLVs).

השלבים העיקריים לפרוטוקול electroformation הם באיור 1. טיפות של תמיסה של רכבי שטח המכילים החלבון מופקדות על חוטי פלטינה (שמוצגים באיור 2). התייבשות חלקית של ההשעיה SUV מובילה להיווצרות של סרט חלבון שומנים באמצעות השילוב של רכבי שטח. במהלך התייבשות, שדה AC מוחל על אלקטרודות לסייע לשכבות השומנים לdelaminate ויוצר GUVs. שדה 10 הרץ עובד היטב בעת שימוש "דל מלח" (<5 מ"מ) חיץ להחזרת נוזלים 28 וGUVs להימשך מספר שעות כדי לגדול. בניגוד לכך, מאגרים פיסיולוגיים (המכילים ~ 100 מ"מ מלח) לעבוד היטב עם מתח נמוך יותר, 500 הרץ שדה AC אך דורש ממושך (~ 12 שעות) נפיחות תקופה של 15. שיטה זו מבוססת על פרוטוקול קודם, באמצעות איטו מחליק 24, אבל משתמשת בהמשך קאמרי מותאם אישיתaining שני חוטי פלטינה כפי שמוצג באיור 2 (ראה דיון לפרטים עיצוב והצעות לפשוטים יותר, מאולתר תאים).

איור 3 ממחיש את שיטת נפיחות בסיוע ג '. הפרוטוקול עובד היטב עם מאגרים עם ריכוזי מלח פיסיולוגיים, הוא מהיר, ומייצר GUVs עם הפצת חלבון הומוגני יותר. עם זאת, התשואה של GUVs המבודד, כנראה פגם-חופשי (כלומר, קרום הבוס הוא אחידה באורך-קשקשים אופטיים ואינו מצרף כל עצמים) הוא נמוך יותר, על אף שהוא מספק מספר מספיק לתיקון מהדק וניסויים מיקרו-מניפולציה . שיטה זו מבוססת על פרוטוקול שימוש בג'ל agarose לייצר GUVs שומנים בדם רק 16 ודורש ציוד ייחודי פחות מאשר שיטת electroformation.

האפיון של GUVs עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתואר, כמו גם הליכים באמצעות הגדרת תיקון מהדק סטנדרטית ללמדוד את פעילות KvAP ב" מבפנים החוצה "נכרת תיקוני קרום.

GUVs המכיל חלבון גידול יכול להיות קשה יותר מGUVs שומנים בדם בלבד. בפרט, תשואת הבוס הסופית יכולה לסמוך ברגישות על איך בדיוק פתרון SUV מופקד ומיובש כדי ליצור ערימת הקרום. למישהו ללא כל ניסיון קודם עם GUVs, זה עשוי להיות מועיל לראשון לגדול GUVs שומנים בדם רק לאחר פרוטוקול קונבנציונלי 15,16 בי סרט הקרום נוצר על ידי הפקדת שומנים מממס אורגני. ברגע שהפרוטוקול הקונבנציונלי עובד היטב, בתצהיר SUV והתייבשות חלקית אז יכולים להיות שולטים באמצעות רכבי שטח שומנים בדם בלבד, שהם גם מאוד מועילים כאשר התאמת הפרוטוקול להרכב שומנים בדם חדש. כאשר GUVs לגדול באופן מהימן מרכבי שטח שומנים בדם בלבד, אז זה רק צעד קטן להפקת GUVs המכיל חלבון מproteo-רכבי שטח.

Protocol

1. פתרון הכנה

  1. להכין 5 מיליליטר של "חיץ SUV 'המכיל 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ HEPES (pH 7.4) או טריס (pH 7.5), ו -2 trehalose מ"מ. סנן את החיץ עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ומתחלק ל1 aliquots מיליליטר אשר ניתן לאחסן ב -20 ° C.
    הערה: פרטים נוספים לריאגנטים ומכשירים ניתנים ברשימת החומרים.
  2. הכן 40 מיליליטר של 'צמיחת המאגר' המושל שימלא את הפנים הבוס בהחזרת נוזלי סרט. לצמיחה "נמוך מלח ', לשלב 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ HEPES (pH 7.4) או 1 מ"מ טריס (pH 7.5), ו~ 400 מ"מ סוכרוז. לצמיחה "מלח פיסיולוגי", לשלב 100 מ"מ KCl, 5 מ"מ HEPES (pH 7.4) או 5 מ"מ טריס (pH 7.5), ו~ 200 מ"מ סוכרוז.
  3. הכן 40 מיליליטר של 'תצפית מאגר' לפתרון החיצוני בתא הניסוי על ידי שילוב של 100 מ"מ KCl, 5 מ"מ HEPES (pH 7.4) או 5 מ"מ טריס (pH 7.5), ו~ 200 מ"מ גלוקוז.
    הערה: מאגרים אלה הם רק EXAmples. ראה דיון על מנת להתאים את המאגרים לניסויים אחרים.
  4. מדוד את osmolarities של מאגרי הצמיחה והתבוננות עם osmometer. להוסיף גרגירים של סוכרוז או גלוקוז כדי להתאים אותם עד למרחק של 1%, כך שGUVs לא lyse או יקרוס כאשר הועבר מתא הצמיחה לתא התצפית.
    הערה: בטווח ריכוז זה, הוספת 1 מ"מ של סוכרוז (13.7 מ"ג לכל 40 מיליליטר) או גלוקוז (7.2 מ"ג לכל 40 מיליליטר) מגביר osmolarity על ידי ~ mOsm 1.
  5. סנן את מאגרי הצמיחה והתבוננות עם מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן אותם על 4 מעלות צלזיוס לעכב התפתחות חיידקים.
  6. לפזר 50 מ"ג של בטא-קזאין ב 10 מיליליטר של 20 מ"מ טריס (pH 7.5) כדי ליצור חיץ פתרון 5 מ"ג / מיליליטר beta-קזאין צריך passivate את פני השטח של תאי ניסוי כך שGUVs לא מקל, להפיץ ופרץ. ברגע שבטא-קזאין הוא נמס לגמרי (עד כמה שעות ב 4 ° C), מסנן (0.2 מיקרומטר) אותו ל0.5 מיליליטר aliquots שיכול להיות קפוא הבזק ומאוחסןב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר (aliquots מופשר מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בדרך כלל ניתן להשתמש עד שבוע 1).

2. הכנת SUV

  1. להכין ולהקפיא aliquots של proteo-רכבי שטח בעקבות הפרוטוקול מפורט שפורסם בעבר 28. השתמש KvAP שכותרתו fluorescently עם Alexa-488 maleimide, מחדש לתוך DPhPC רכבי השטח (10 מ"ג / מיליליטר) בחלבון ליחס שומנים של 1:10 (במסה).
    הערה: Wild סוג KvAP מכיל ציסטאין אחד למונומר ממוקם בסמוך לתחנה הסופי C-התוך תאי (חומצת אמינו 247).
  2. רכבי שטח פלורסנט, שומנים בדם בלבד:
    הערה: ידית כלורופורם מתחת למכסת מנוע קטר כפפות nitrile ומשקפי מגן. הימנע משימוש בכל פלסטיק כלורופורם יכול לפזר אותם. ניתן לאחסן פתרונות כלורופורם בבקבוקוני זכוכית ענבר עם כובעי טפלון והועברו באמצעות מזרקים זכוכית. תשמור על עצמך כדי לשטוף את כל כלי הזכוכית לפחות 5 עד 10 פעמים עם כלורופורם לפני ואחרי pipetting שומנים.
    1. הכן של 100 μl10 רכבי שטח מ"ג / מיליליטר DPhPC המכילים 0.5% mol של השומנים בדם אדום הניאון, טקסס האדומה-DHPE, על ידי ערבוב של פתרון DPhPC 100 μl (10 מ"ג / מיליליטר בכלורופורם) עם 8.2 μl של פתרון טקסס האדומה-DHPE (1 מ"ג / מיליליטר במתנול) בבקבוקון זכוכית 1.5 מיליליטר ענבר.
    2. ייבש את השומנים למטה תחת זרם של חנקן במנדף כימי תוך סיבוב הבקבוקון. כאשר הסרט נראה יבש, למקם את השומנים תחת ואקום במשך 3 שעות כדי להסיר כל ממס שיורי.
    3. הוספה של חיץ SUV 100 μl לשומנים, והמערבולת במרץ עד שלא שומנים נשאר תקועה על הקירות של הבקבוקון והפתרון הוא אחיד חלבי.
    4. Sonicate פתרון שומנים כדי ליצור רכבי שטח. להתאים את מיקום הבקבוקון עד אולטרסאונד גורם לתנועה ביותר וזרימה בתוך הבקבוקון, ולדאוג שלא לחמם את הפתרון שלא לצורך. המשך sonication עד הפתרון הופך שקוף, או במידת האפשר, (2-5 דקות לsonication קצה, ~ 20 דקות לsonication אמבטיה) שקופות.
    5. Aliquoרכבי שטח t (למשל, 10 או 20 μl μl) (-20 ° C) לשימוש מאוחר יותר והקפאה.
      הערה: שומנים, במיוחד שומנים בלתי רוויים, יכול בקלות פירוט. פתרונות שומנים חנות ב 20 ° C (או 80 ° C) תחת ארגון ולהשתמש תוך 6 חודשים. ניתן לאתרם תוצרי פירוק שומנים בכרומטוגרפיה בשכבה דקה.

3. בוס צמיחה על ידי Electroformation

  1. להכין את חדר electroformation.
    1. אם התא לא נוקה, להסיר את החלונות, לסלק את כל איטום והשומן, לחלץ את החוטים, ולשטוף ולקרצף את החדר עם רקמות באמצעות מים ואתנול (≥70%) לסירוגין.
    2. לשפשף את החוטים גם, להטביע את החוטים וקאמריים באצטון, וsonicate במשך 5 דקות. נגב את הכל עם רקמה שוב באמצעות אצטון. שים את התא באתנול וsonicate במשך 5 דקות.
    3. להרכיב את התא על ידי החדרת החוטים דרך החורים, ולסובב ולנגב את החוטים כדי לוודא שהם arדואר נקי. שים את התא במים מזוקקים, sonicate במשך 5 דקות ולייבש את החדר עם זרם של חנקן או אוויר.
  2. הכן 30 μl של 3 מ"ג / מיליליטר ההשעיה SUV במאגר SUV. כדי ליצור GUVs המכיל חלבון, לשלב 8 μl של proteo-רכבי שטח (DPhPC 10 מ"ג / מיליליטר KvAP 1:10), 2 μl של רכבי שטח ניאון (10 מ"ג / מיליליטר DPhPC, 0.5 mol% TexasRed-DHPE) ו -20 μl של SUV חיץ בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge לחלבון סופי לשומני יחס (מסה) של 1: 12.5 ו -0.1% mol TexasRed-DHPE. מערבבים את הפתרון במרץ.
    1. לחלופין, לתרגל את הפרוטוקול עם השומנים רק רכבי שטח, פשוט לשלב 10 μl של רכבי שטח ניאון (10 מ"ג / מיליליטר DPhPC ו 0.5 mol% TexasRed-DHPE) עם חיץ SUV 20 μl.
  3. להפקיד את SUV הפתרון.
    1. השתמש פיפטה 2 μl או מזרק זכוכית 5 μl להפקיד טיפות קטנות (<0.2 μl) של פתרון SUV בחוטים. כ נדרש 1 μl של פתרון כדי ליצור סדרה של טיפות לאורך1 סנטימטר של חוט. ודא הטיפות קטנות מספיק ומרווחים מספיק רחוק זה מזה, שהם לא נוגעים או פתיל.
    2. בואו רכבי השטח הופקד להתייבש במשך ~ 30 דקות באוויר פתוח. כאשר כל הטיפות התיישבו, לסובב את החוט כל כך פיקדונות השומנים קלים יותר להתבונן במיקרוסקופ.
      הערה: אם רכבי השטח לא לייבש מספיק, הם יכולים פשוט לשטוף את החוטים כאשר מאגר הצמיחה נוסף, תוך ייבוש יותר מדי עלול לגרום נזק לחלבון. בגלל לחות באוויר משפיע על השיעור של ייבוש, זמן הייבוש ו / או לחות באוויר יכול להיות מותאם לתוצאות אופטימליות 30. סרט השומנים בחוטים צריך להיות גלוי תחת מיקרוסקופ.
  4. להרכיב את התא.
    1. לאטום את תחתית החדר: השתמש במזרק ללמרוח משחה ואקום לחלק התחתון של החדר סביב שלוש הבארות ולחץ coverslip x 22 מ"מ 40 מ"מ בעדינות נגדה לאטום את תחתית התא, כך שהוא שומר ללא פער. חותם את הצדדים של החדר (שבו יציאת חוטים) עםאיטום דבק. למרוח משחה ואקום על גבי התא מתאר שלוש בארות.
    2. לאט לאט להוסיף למאגר צמיחה עד כל טוב מלא לראש. הימנע מכל תנועה מהירה של הפתרון בבארות כמו זה יכול להתפשט סרט השומנים מהאלקטרודות.
    3. סגור את התא על ידי לחיצה על כיסוי השקופית העליונה בעדינות על הגריז, נזהר שלא לעקור את coverslip התחתון. השתמש במטלית כדי להסיר כל טיפות של חיץ בקצוות של להחליק את המכסה העליון.
      הערה: זהו זמן טוב לבחון את התא מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שסרט השומנים נשאר בחוטים.
  5. חבר את מחולל אותות לחוטים באמצעות שני קליפים תנין. הגדר את התדירות (גל סינוס 10 Hz / 500 הרץ לחיץ מלח נמוך / גבוה) ולהשתמש במודד למדוד ולהתאים את המתח על פני החוטים 0.7 / 0.35 V שורש ממוצע ריבועים (VRMS) לחיץ מלח הנמוך / גבוה. מכסה את החדר עם רדיד אלומיניום כדי להגן על fluorophores מן האור. השאר tהוא GUVs לגדול במשך 2-3 שעות לחיץ מלח הנמוך, ו -12 שעות או O / N לחיץ מלח הגבוה.
  6. נתק את התא מגנרטור ולמקם אותו בזהירות על מיקרוסקופ הפוכה להעריך צמיחת בוס. השתמש ב, תנועות איטיות או יציבים זרימת נוזל בבארות עשויים בטרם עת לנתק GUVs מהחוטים.
    הערה: GUVs על קצות החוט הוא בדרך כלל גלוי בניגוד שלב (40X אובייקטיבי מרחק עבודה ארוכה), ואילו ניתן לראות GUVs כל מקום במחצית התחתונה של החוטים עם epifluorescence. אם לא GUVs גלוי, נסה לסובב את החוטים להסתכל על פני השטח העליונים. ניתן לאחסן GUVs על 4 מעלות צלזיוס בתא צמיחה במשך כמה ימים.

4. צמיחת בוס על ידי נפיחות סייעו-ג'ל

  1. הכן 10 מיליליטר של פתרון agarose 1% על ידי ערבוב של agarose 100 מ"ג עם 10 מיליליטר של מים טהורים. מחממים אותו עד לנקודת רתיחה על ידי הצבתו במיקרוגל ב 480 W ל~ 20 שניות. מערבבים לוודא agarose הוא נמס לגמרי.
    הערה: הפתרוןיכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ומחוממת בעת צורך.
  2. פלזמה נקייה (פלזמה אוויר) כיסוי שקופית 1 דקות, כך שפתרון agarose יתפשט יפה על זה. השתמש בכיסוי-שקופיות בתוך 15 דקות הבאות כאפקט של ניקוי פלזמה פג במהירות.
  3. החל 200 μl של פתרון agarose החם לכל 22 x 22 מ"מ 2 שקופיות כך הפתרון מרטיב את כל פני השטח. הטה את השקופית אנכית ולגעת בקצה התחתון לרקמות להסרת נוזל עודף ולהשאיר רק שכבה חלקה דקה של agarose בשקופית.
  4. מניחים את השקף על צלחת חמה או בתנור ב 60 ° C ולהשאיר אותה לייבוש לפחות 30 דקות. סרט agarose הוא בקושי נראה לעין בעין. לאחר השקופיות להתקרר לRT, להשתמש בם באופן מיידי, או לאחסן אותם לעד שבוע בכלי סגור על 4 מעלות צלזיוס.
  5. מניחים את coverslip מצופה agarose בצלחת פטרי 3.5 סנטימטר סטנדרטית.
  6. הכן את פתרון SUV כמו בסעיף 3.2 ולהחיל ~ 15 μl של פתרון SUV (3 מ"ג / מיליליטר שומנים בדם) ב~ 30 טיפות קטנות מאוד בעדינות על גבי משטח agarose. הקפד לא לעוות את שכבת agarose יותר מדי.
  7. מניחים את השקף תחת זרם עדין של חנקן כ 10-15 דקות ובצע את האידוי של החיץ על ידי העין כטיפי ייבוש.
  8. ברגע שהרכבים השטח התייבשו, להוסיף למאגר צמיחה כדי לכסות את פני השטח השקופיות. לשימוש קטן 3.5 סנטימטרים פטרי צלחת ~ 1 מיליליטר של חיץ.
  9. לאפשר לנפיחות כדי להמשיך ל~ 30 דקות, ולאחר מכן לבחון את הצמיחה של GUVs בתא באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם שלב בניגוד או ניגודיות דיפרנציאל התערבות (DIC).
    הערה: תצפית epifluorescence קשה בשל הרקע החזק של fluorophores בג'ל והאוטומטית הקרינה של agarose.

5. קציר והתבוננות GUVs

  1. Passivate קאמרי תצפית (למשל, צלחת פטרי קטנה או coverslip זכוכית), כך שGUVs לא מקל, להפיץ ופרצו בתחתית התא. מכסה את צ'אםבער תחתון עם פתרון beta-קזאין, דגירה של 5 דקות, לשטוף את פתרון קזאין עם מים טהורים, יבש עם זרם של אוויר או חנקן, ולבסוף להוסיף למאגר תצפית (למשל, ~ 5 מ"מ עומק לצלחת פטרי קטן).
  2. לקצור את GUVs. חותך את הקצה של 100 טיפים פיפטה μl כך היא הפתיחה (~ 2 מ"מ קוטר) גדול יותר, ולשאוף לאט כמאמץ הגזירה של pipetting בקלות יכולה להרוס GUVs.
    1. לGUVs-נוצר אלקטרו, לפתוח את תא הצמיחה בעדינות על ידי הסרת coverslip העליון. הנח את קצה פיפטה ישירות מעל כל חוט ולשאוב ~ 50 μl תוך כדי התנועה את קצה פיפטה לאורך החוט כדי לנתק את GUVs.
      הערה: זה עשוי לעזור כדי לסובב את החוט כדי לאסוף GUVs על "הצד השני" של החוט.
    2. לGUVs "נפיחות בסיוע ג '", הקש ראשון בצד של צלחת פטרי כמה פעמים כדי לעזור GUVs להתנתק ממשטח coverslip. מקם את קצה פיפטה בדיוק מעל coverslip ולשאוב 50 μl תוך pulling הקצה אחורי על פני השטח. ישירות להעביר GUVs שנקטפו לחדר תצפית, או בחנות בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1.
  3. מניחים את חדר התצפית במיקרוסקופ הפוכה, להוסיף GUVs לתא התצפית, ולחכות כמה דקות לGUVs להתיישב בתחתית התא.
  4. סקר קאמרי עם ניגוד שלב או DIC כדי לאתר במהירות ("פגם חופשי ')" מועמדי בוס "חלקים, כדוריים. לבחון כל "מועמד בוס" בepifluorescence שלא יכלול יפוזומים קטנים יותר המכילים מקוננים בתוך. לבסוף, ודא שעוצמת הקרינה שומנים היא אחידה ותואמת עם קרום אחד (כלומר, unilamellar).
    הערה: בחלק מbilamellar (או רב-שבשבת) שלפוחית, הקרומים קרובים מדי זה לזה להיפתר כל כך שהם מופיעים unilamellar בניגוד שלב או תמונות DIC. עם זאת, ניתן להבחין אובייקטים אלה מunilame בפועלGUVs llar על ידי הקרינה השומנים שלהם, שהוא פי שניים (או יותר) בהיר יותר.

6. GUVs הידוק-תיקון

  1. הפוך טפטפות תיקון בקוטר טיפ 1-2 מיקרומטר מזכוכית נימי ורוסיליקט סטנדרטית באמצעות התכנית המומלצת לחולץ פיפטה.
    הערה: טיפולים מיוחדים כגון ליטוש אש אינם נחוצים, וטפטפות יכולה לשמש במשך כמה ימים אחרי שהם כבר משכו אם הם נשמרים בקופסא סגורה.
  2. Passivate התא על ידי דוגרים עם פתרון beta-קזאין (5 מ"ג / מיליליטר), כדי להבטיח שGUVs אינו דבק, להפיץ וקרע על משטחים קאמריים. לשטוף את קזאין לאחר 5 דקות.
  3. הכנס את האלקטרודה הקרקע, למלא את התא עם חיץ תצפית, להעביר 10 μl של ההשעיה הבוס כמתואר בשלב 5.2 ו -5.3, ולחכות כמה דקות לGUVs להתיישב בחלק התחתון.
  4. מלא פיפטה תיקון טרי עם פתרון (חיץ תצפית או פתרון iso-האוסמוטי אחר) ולעלות אותו על headstage מגבר תיקון מהדק.
  5. חיפוש דרך החדר לאיתור בוס "ללא פגם" כאמור בסעיף 5.4, ולבדוק שהוא מכיל חלבון פלואורסצנטי.
  6. החל לחץ חיובי קבוע (> 100 אבא, או בערך 1 סנטימטר H 2 O במד לחץ) כדי לשמור על פיפטה תיקון פנים נקיים, והכנס את פיפטה התיקון לתוך התא. להביא את פיפטה התיקון לשדה הראייה, יחול דופקי בדיקה למדידה / לפצות את מתח פיפטה קיזוז והתנגדות, ולבחון את פיפטה תחת תאורת ניאון כדי לאשר שהקצה הוא נקי.
  7. להביא את פיפטה התיקון כלפי הבוס, ובמידת צורך, בו זמנית להפחית את הלחץ החיובי כל כך את הזרימה החוצה מפיפטה את התיקון לא עושה הבוס "לברוח". כאשר פיפטה את התיקון היא קרובה לבוס, להחיל לחץ שלילי (עד 5 סנטימטרים H 2 O) כדי למשוך את הבוס נגד פיפטה את התיקון. לפקח על ההתנגדות כ"; לשון "של קרום הבוס נכנסה פיפטה את התיקון וצורות gigaseal.
  8. אם gigaseal לא יוצר, להסיר את פיפטה התיקון מהחדר ולחזור לשלב 6.4. אם תיקון הקרום יצר gigaseal, אבל הבוס נשאר מחובר לפיפטה, תחתוך את התיקון על-ידי התרחקות הבוס, מתפוצצים הבוס אל תחתית החדר, או בקצרה נע פיפטה מתוך פתרון.
  9. כאשר תיקון הקרום מבפנים החוצה כבר נכרת מן הבוס וgigaseal יציב, לכבות את דופקי הבדיקה וליישם פרוטוקול מתח כמו זה שמוצג באיור 13.
    הערה: איור 13 להלן אמנת אלקטרו סטנדרטית לתיקון מבפנים החוצה שבזרם לתיקון-אלקטרודה הוא "חיובי", ו- V = V אמבטיה - פיפטה V. מחזיק את התיקון בפוטנציאל שלילי (לדוגמא, V = -100 mV) ל~ 30 מקומות שניות KvAP במצב המנוחה, ואילו צעדים (100 msec ל 5 שניות) לפוטנציאל חיובי יותר (לדוגמא, V = 100 mV) אז יכול לנהוג בה ל( מדינות) כלומר, פתוחות ניהול פעילה.
  10. לאחר מדידות על תיקון קרום נסיים, לשבור את התיקון עם דופק zap או לחץ ובדוק שמתח היסט של האלקטרודה התיקון לא נסחף. הסר את פיפטה התיקון מהחדר, ולחזור לשלב 6.4.

תוצאות

הצמיחה של GUVs ניתן להעריך במהירות על ידי בחינה קאמרי הצמיחה מתחת למיקרוסקופ. לelectroformation, GUVs נוטה לגדול בצרורות לאורך חוטי הפלטינה, כפי שמוצג באיור 4. במהלך נפיחות בסיוע ג ', GUVs יופיע כמבנים כדוריים שבמהירות לגדול ופתיל יחד (איור 5).

Discussion

מערכות מודל Biomimetic הן כלי חשוב ללימוד התכונות והאינטראקציות של חלבונים וקרומים. בהשוואה למערכות אחרות כמו מחדש BLMs או ממברנות שומנים בדם נתמכים, בוס מערכות מספר הזדמנויות הנוכחיות כוללים שליטה ניכרת של הרכב קרום, מתח וגיאומטריה, כמו גם להיות באמת ללא שמן בסיס. עם זאת, ב...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of the
Material/Equipment		CompanyCatalog NumberComments/ Description
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids 850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids 850375P
cholesterol (ovine wool, >98%) Avanti Polar Lipids 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPlabeled lipid
BPTR-CeramideInvirtogenD-7540 labeled lipid
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
AcetoneVWR20066.296AnalaR Normapur
EthanolVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Hamilton syringes Hamilton Bonaduz AGdiverse
Amber vials and teflon cupsSigmaSU860083 and SU860076
ParafilmVWR291-1214
microcentrifuge tubeeppendorfdiverse
AgaroseEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SucroseSigma84097-1kg
Glucose SigmaG8270-1kg
TrehaloseSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1kg
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A
OsmometerWescorVapro
pH meterSchott instrumentsLab850
SonicatorElmasonicS 180 H
Syringe filter 0.2µmSartorius steimMinisart 16532
Function generatorTTiTG315
Platinum wiresGoodfellowLS41307499.99+%, d=0.5mm
PolytetrafluoroethyleneGoodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'VWR1597418
sealing pasteVitrex medical A/S, DenmarkREF 140014Sigillum Wax
Cover slides 22x40 mm No1,5VWR 631-0136
Cover slides 22x22 mm No1,5VWR 631-0125
plasma cleanerHarrickPDC-32Gairplasma, setting 'high'
petri dishesFalcon BDREF 3530013.5 cmx1cm
patch clamp amplifierAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ CardNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsversion 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mmHarvard ApparatusGC100-15
Electrode holderWarner Instruments Q45W-T10P
MicromanipulatorSutter MP-285
pipette pullerSutter P-2000 
CameraProSilica GC1380
Zeiss microscopeZeissAxiovert 135
ObjectiveZeiss40x long working distance, Phase contrast
Objective Zeiss100x Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488)HoribaXF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed)HoribaXF101-2
beta-caseinSigma C6905-1G
confocal microscopeNikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 confocal head
ObjectiveNikonPlan Fluor 100× NA1.3
matlabMathworksfor image processing and analysis of the current traces

References

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BiomimeticGiant UnilamellarKvAPelectroformationagarose95

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved