تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

Summary

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Abstract

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia¹. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar². Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells³. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase^4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Introduction

مجالات البيولوجيا التطورية والخلايا قد تأثرت إلى حد كبير من قبل كائن نموذج: ذبابة الفاكهة السوداء البطن. ضمن هذا النموذج، وقد ساهمت الدراسات القرص العين على قدر كبير من المعرفة فيما يتعلق الإشارات، بيولوجيا الخلية وغيرها من المناطق. وقد درس الراحل ثالث اليرقات القرص الطور العين وعلى نطاق واسع هو نموذج قوي للاستفادة، كما أنه يعطي لمحة عن سلسلة من الفترات التنموية، مع كل جزيئاته الإشارات الفريدة الخاصة والعمليات، كما تقدم ثلم المخلق عبر القرص العين ^8. ومع ذلك، هناك حاجة إلى توسيع فهمنا للعمليات التنموية في مرحلة العذراء للتنمية. في حين كانت هناك دراسات على القرص عين العذراء ^3-7 والمعرفة لدينا لا تقترب من اتساع نطاق العمل الذي تم القيام بها على القرص الثالث الطور العين. ويرجع ذلك، في جزء منه، إلى صعوبة أكبر في تشريح العين القرص العذراء. لذا، عرضا للالأسلوب السليم للتشريح يمكن أن يتوسع كثيرا من البحوث في هذا المجال.

في حين أن هناك مراحل في تطوير القرص عين العذراء التي يتم تشريح بسهولة، وخاصة حول فترة منتصف العذراء، وفترات زمنية أخرى هي أكثر تحديا لتشريح. هذا البروتوكول يمثل طريقة واحدة لتشريح أقراص عين العذراء التي يمكن استخدامها عالميا لجميع الأطر العذراء الوقت التنموية. هذا البروتوكول يمكن استخدامها كبديل للبروتوكول آخر ⁹ يبين طريقة أسهل وأسرع لتشريح أقراص العين من النقاط الزمنية midpupal. تم تصوير هذا البروتوكول أصلا وضعت لتدريب طلاب المرحلة الجامعية المتقدمة في جامعة كاليفورنيا الجامعية اتحاد البحوث في علم الجينوم الوظيفي (URCFG) ^10،11 في تقنية العذراء تشريح العين. كانوا قادرين على الاستفادة من هذا الفيديو وطريقة لتعلم هذه التقنية الصعبة العديد من الطلاب الجامعيين.

Protocol

هذا الإجراء هو إجراء 2 يوم.

يوم 1 (2 ساعة + تشريح الوقت)

1. العذراء القرص تشريح العين

1. حدد خادرة للتشريح.
   ملاحظة: عمر خادرة أن تشريح ستحدده الاحتياجات التجريبية. ومع ذلك، إذا فحص مورفولوجيا الخلية، وهذا كثيرا ما يتم في 42 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) عند 25 درجة مئوية، وهو عمر الشرانق يظهر في شريط الفيديو. جمع الشرانق الأبيض (APF اعتبر 0 ساعة) مع الفرشاة المبللة وترتيبها حسب التسلسل الزمني (على أساس جمع الوقت) في جديدة قارورة ذبابة المواد الغذائية حافظت على 25 درجة مئوية. تشريح الشرانق العمر في نفس هذا الترتيب الزمني للحفاظ على فروق التوقيت بين الشرانق في أقرب وقت ممكن.
2. نقل خادرة إلى قطرة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4، انظر المواد للصفة) على لوحة سيليكون تشريح.
3. عقد الجزء العلوي من حالة العذراء مع ملقط وبيرس وفتح لOWER جزء من حالة العذراء مع زوج من ملقط حادة. إزالة خادرة من الحال في حفرة تشكلت حديثا.
4. اجراء خفض قطري مع مقص، منتصف الصدر، في خادرة. إزالة الحطام أو نقل رئيس خادرة إلى انخفاض جديد من برنامج تلفزيوني. نظيف باستخدام ماصة أنبوب منفاخ (انظر المواد والشكل 1 لمزيد من التفاصيل) وإضافة برنامج تلفزيوني إضافية حسب الحاجة. تأكد لتجنب الجفاف.
5. قبضة آمن الجزء العلوي من رأسه إهاب العذراء مع زوج من ملقط. باستخدام غيض من أنبوب منفاخ، ودفع بلطف على حالة العذراء لبثق المخ والأنسجة الأخرى، بما في ذلك أقراص العين، للخروج من حالة العذراء. تأكد من تجنب الاستيلاء على أي نوع من الأنسجة داخل بشرة.
6. باستخدام أنبوب منفاخ مليئة PBS، ضربة بلطف أنسجة الجسم الدهون وغيرها من الحطام للخروج من حالة الرأس لفصل بوضوح والتعرف على أقراص الدماغ والعين.
   ملاحظة: سيتم الحفاظ على الدماغ تعلق على حالة رئيس العذراء يسمح الباحث لانه يستخدمحالة الإعلان بأنه "مقبض" للتلاعب في المستقبل من الأنسجة دون الإضرار أقراص العين أو الدماغ. ومع ذلك، فإنه من الشائع لإزاحة أقراص الدماغ والعين من الرأس وهذه الحالة ليست ضارة لإجراء الشامل والنتائج. وعادة ما يستغرق عدة محاولات للنفخ ودفع لاستخراج بنجاح الأقراص العين والدماغ من داخل حالة رئيس العذراء وبحيث تكون منفصلة عن الأنسجة المحيطة بوضوح. وأنظف وأكثر واحد منفصل يمكن الحصول على أقراص العين من الأنسجة المحيطة بها سوف تساعد على منع الأنسجة الغريبة من تحديد إلى أقراص العين.
7. بعد التشريح، ونقل على الفور إلى الأنسجة طبق زجاج 3 جيدا على الجليد مع 0.5 مل من محلول فيكس (انظر المواد). تطفو على الأنسجة على السطح من الحل فيكس لبضع دقائق (عادة الوقت الذي يستغرقه لتشريح المجموعة التالية من أقراص العين).
   ملاحظة: إذا لم يكن هذا أول قرص العين ليتم تشريح في هذه الجولة من تشريح، completelذ غمر القرص العين السابق في حل فيكس. إن القيام بإجراءات تلطيخ الخاصة (على سبيل المثال، أنواع الاكسجين التفاعلية، الجسيمات الحالة، الخ) يجب أن يتم ذلك قبل التثبيت. من أجل القيام بذلك، تخزين أقراص تشريح العين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة قبل الاستمرار مع بروتوكول تلطيخ المناسب.
8. بعد تشريح وغمر جميع أقراص يجري تشريح العين، تحريك الطبق الزجاجي 3 بالإضافة إلى الروك والروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

2. المناعية

1. إزالة بعناية الحل فيكس وإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون X-100 (0.3٪ PBT، انظر المواد) وغسل الأنسجة على الكرسي الهزاز لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما).
   ملاحظة: إزالة بعناية من الحل من البئر يمكن إجراء تشريح تحت المجهر لمنع تلف الأنسجة أو الخسارة. يمكن أن يستنشق الحل بعناية مع الماصة. نحن نفضل-tippe غرامةد، يمكن التخلص منها نقل الماصة التي تمت زيارتها فتح بالارض لتقليل فرصة الشفط الأنسجة.
2. في نهاية غسل 4، وإزالة غسل وإضافة 0.5 مل من محلول كتلة (انظر المواد) إلى البئر واحتضان لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن تمديد هذا الإطار الزمني وفقا لاحتياجاتك.
3. في نهاية الوقت كتلة 30 دقيقة، الماصة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الحل الابتدائية (مخففة في حل بلوك) إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة microwell.
   ملاحظة: سيكون أحد بئر من لوحة microwell تستوعب حوالي 4 أزواج من أقراص العين التي تعلق على حالة العذراء أو 8 أزواج منعزلة من أقراص العين مع العقول المرفقة. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول لبيانات تمثيلية هي مكافحة فسفوتيروزين (1: 500 تمييع) ومضادة للقطع (1: 200 تمييع).
4. نقل الأنسجة تشريح في الآبار لوحة microwell مليئة الجسم المضاد الحل الأساسي من الطبق الزجاجي 3 أيضا.
5. مكانلوحة microwell على منشفة ورقية مبللة (لمنع الجفاف) في علبة فارغة طرف الماصة (أو حاوية أخرى مماثلة) وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل.

يوم 2 (4 + ساعة الوقت التركيب)

6. نقل الأنسجة من لوحة microwell إلى 3 جيدا طبق زجاج جديد مع 0.3٪ PBT (≈0.5 مل)، وغسل الأنسجة لمدة 10 دقيقة على الروك. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما)
7. إزالة غسل الماضي وإضافة 0.5 مل من محلول بلوك إلى البئر. منع لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن تمديد هذا الإطار الزمني وفقا لاحتياجاتك.
8. إزالة كتلة الحل وإضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (مصنوعة من الأجسام المضادة fluorescently المسمى المناسبة لالضد الخاص الابتدائي والطول الموجي الفلورسنت، مخففة في حل بلوك) إلى البئر وحماية طبق زجاج 3 جيدا من الضوء مع غطاء أو الألومنيوم احباط واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة في غرفةدرجة الحرارة.
   ملاحظة: جميع الخطوات اللاحقة ينبغي حماية بالمثل من التعرض للضوء. هذه الحضانة يمكن تمديدها ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية، في الإعداد مماثل للحضانة الأجسام المضادة الأولية، ولكن يمكن أيضا أن يؤديها في طبق زجاج 3 جيدا مغطاة فيلم المختبر، أو لوحة microwell إذا كان المطلوب المحافظة على الأجسام المضادة.
9. في نهاية الحضانة الضد، وإزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل وإضافة 0.5 مل من 0.3٪ PBT إلى البئر وتغسل على الروك لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما).
   ملاحظة: إذا كان المطلوب تلوين دابي، قبل البدء في غسل الأولى، إضافة 0.5 ميكرولتر من محلول المخزون دابي (انظر المواد) إلى 500 ميكرولتر من PBT التي سيتم استخدامها لغسل الأولى (1: 1،000 التخفيف).

3. تركيب

1. في نهاية غسل الماضي، تركيب أقراص antennal / العين على شريحة باستخدام 70٪ الجلسرين أو برنامج تلفزيوني كوسيلة لإزالة رعين والأنسجة الأخرى غير المرغوب فيها في بركة على جانب واحد من الشريحة.
2. تحرك بحذر الأنسجة باستخدام الضغط الهيدروليكي بين ملقط، أو بلطف شديد مع طرف الملقط، ويصطف على أقراص العين في عمود نحو وسط الشريحة.
3. إزالة جميع الجلسرين دخيلة أو برنامج تلفزيوني من جميع أنحاء الأنسجة (باستخدام إجراءات فتل مختبر مسح أو ملقط لهذا العمل).
4. ضع كمية صغيرة (≈10 ميكرولتر) من تصاعد المتوسطة على طول جانب واحد من العمود قرص العين ووضع ساترة على الأنسجة وذلك لنشر المتوسطة المتزايدة على أقراص العين.
5. ترك الجلوس الشريحة من 1 إلى 2 دقيقة للسماح للأنسجة / متوسطة متزايدة لتنتشر بشكل كامل.
6. يمسح أي وسيلة إضافية متصاعدة خارج من حول حواف ساترة وختم ذلك مع طلاء الأظافر واضحة.
7. التقاط الصور الفلورسنت من أقراص العين باستخدام متحد البؤر المجهري.

النتائج

كمثال لاستخدام هذا البروتوكول، توضح النتائج midpupal (42 ساعة APF عند 25 درجة مئوية) أقراص العين immunostained مع الأجسام المضادة المختلفة ترد في الشكل 2. باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد بقايا فسفوتيروزين، غشاء الخلايا يمكن أن يكون الملاحظ (الشكل 2A). وهذا يمكن أن تستخد...

Discussion

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs¹², which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers¹³ so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)			80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100	Promega	H5142	Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT			1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.
Fix Solution			(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum	Rockland antibodies & assays	B304	Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution			10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution	Life Technologies	D3571	For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting medium
Glycerol	Sigma	G5516	For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer	VWR	82007-202	Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Krayden	NC9897184	Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish			Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish	Corning	7220-85	The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray	Nunc	438733
Sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade	Ted Pella	1346
100 mm Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip	Samco Scientific	231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001