JoVE Logo

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Аннотация

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Введение

Поля развития и клеточной биологии были значительно повлияло на модель организма: дрозофилы. В рамках этой модели, исследования диска глазного способствовали большое знаний относительно сигнализации, клеточной биологии и других областях. Покойный третий личиночной диск возрастной стадии глаз хорошо изучена и является мощным модель для использования, так как она дает снимок серии периодов развития, каждый со своими молекулами и процессов уникальный сигнальных, как морфогенетические борозды прогрессирует по диску глаз 8. Тем не менее, существует необходимость дальнейшего расширения нашего понимания процессов развития в куколки фазе развития. В то время как были проведены исследования по куколки глаз диска 3-7, наши знания не подходит широту работы, которая была выполнена на третьем диске возрастной стадии глаз. Это связано, в частности, к большей сложности в рассекает куколки диск глаз. Таким образом, презентациясобственно метод рассечения может значительно расширить научные исследования в этой области.

В то время как есть этапы в рамках развития куколки глаз дисков, которые легко рассеченные, особенно вокруг периода середины куколки, другие временные периоды гораздо более сложной задачей, чтобы рассекать. Этот протокол представляет собой один способ рассечения куколки глаз диски, которые можно повсеместно используемые для всех куколок развития временных рамок. Этот протокол может быть использован в качестве альтернативы другим протоколом 9, который показывает более простой и быстрый метод рассекать глазные диски из midpupal моменты времени. Этот протокол изначально снимается и разработана для подготовки студентов старших курсов бакалавриата в UCLA Бакалавриат исследовательского консорциума в функциональной геномики (URCFG) 10,11 в технике куколки глаз вскрытия. Многие студенты бакалавриата смогли использовать это видео и метод, чтобы узнать эту сложную технику.

протокол

Эта процедура представляет собой процедуру, 2 день.

День 1 (2 ч + рассекает время)

1. куколки глаз Диск Рассечение

  1. Выберите куколку для вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: возраст куколки быть расчлененным будет определяться экспериментальным потребностей. Тем не менее, если изучение морфологии клеток, это часто делается на 42 ч после образования пупария (APF) при 25 ° С, что возраст куколок показано на видео. Собирают белый куколки (считается 0 ч APF) с увлажненной кистью и расположить их в хронологическом порядке (в зависимости от времени сбора) в новой муха пищевой флакон, поддерживаемой при 25 ° С. Рассеките возрасте куколки в этом же хронологическом порядке, чтобы сохранить разницу во времени между куколок как можно ближе.
  2. Передача куколки в каплю фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4, см материалы для рецепте) на силиконовой пластины вскрытии.
  3. Держите верхнюю часть куколки случае с пинцетом и проколоть и открыть лАуэр часть куколки случае с парой острых щипцов. Снимите куколку из дела во вновь образовавшуюся дыру.
  4. Сделайте диагональный срез ножницами, середине грудной клетки, в куколки. Снимите мусора или передавать куколка голову к новому падению PBS. Чистый помощью пипетки с грушей трубку (см материалы и рисунок 1 для деталей) и добавить дополнительную PBS по мере необходимости. Убедитесь, чтобы избежать обезвоживания.
  5. Надежно возьмитесь за верхнюю часть куколки головы кутикулы с парой щипцов. С помощью кончика трубы воздуходувки, осторожно нажмите на куколки случае выдавливать мозг и другие ткани, в том числе глазных дисков, из куколки случае. Будьте уверены, чтобы избежать захвата любой ткани в кутикулу.
  6. Использование вентилятора трубку, наполненную PBS, мягко удар жира ткани тела и другой мусор из головы случае четко отделить и идентифицировать мозговые и глазные диски.
    Примечание: Ведение мозг, прикрепленный к головной куколки случае позволит использовать исследователь онОбъявление случай как "ручки" для дальнейшего манипулирования ткани, не повреждая глаз диски или мозг. Тем не менее, оно является общим для сместить мозга и глаз диски из головного случае, и это не наносит ущерб общей процедуры и результаты. Это часто занимает несколько попыток дуть и толкает успешно извлекать глазные диски и мозг изнутри куколки случае головки и так, чтобы они четко отделены от окружающих тканей. Чище и отдельный можно получить глазные диски из окружающих тканей поможет предотвратить постороннее ткани от фиксации в глаза дисков.
  7. После вскрытия, немедленно передать ткани на стеклянную посуду 3 скважины на льду с 0,5 мл раствора Фикс (см материалы). Поплавок ткани на поверхности Fix решения в течение нескольких минут (обычно на время, необходимое для рассекать следующий набор глазных дисков).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не первый глаз диск, чтобы разрезать в этом раунде рассечение, completelу погрузить предыдущий глаз диск в Fix решения. При выполнении специальных процедур окрашивания (например, активные формы кислорода, лизосом и т.д.) это должно быть сделано до фиксации. Для того чтобы сделать это, хранить расчлененный глазные диски в ледяной PBS до продолжения соответствующего протокола окрашивания.
  8. После вскрытия и погружение всех глазных дисков, которые расчленены, переместите стекло блюдо 3 а к рокера и рок при комнатной температуре в течение 30 мин.

2. Иммуноокрашивание

  1. Осторожно снимите Fix решение и добавить 0,5 мл PBS с 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, ознакомиться с материалами) и мыть ткань на кресле-качалке в течение 10 мин. Повторите этот шаг еще три раза в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное удаление раствора из скважины может быть выполнена под микроскопом рассекает чтобы предотвратить повреждение тканей или потери. Решение может быть атмосферный тщательно пипеткой; мы предпочитаем тонкую tippeд, одноразовые передачи пипетки, что была на открытии сплющенный уменьшить шанс аспирационных ткани.
  2. В конце 4-й стирки, мыть удалить и добавить 0,5 мл раствора блок (см материалы) в лунку и инкубировать в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: этот период времени может быть продлен в соответствии с вашими потребностями.
  3. В конце времени блока 30 мин, пипетки 10 мкл первичного антитела раствора (разбавленного раствора в блок) в соответствующее числу скважин в планшете.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один лунку планшете будет разместить около 4 пары глаз дисков, подключенных к куколки случае или 8 изолированных пар глаз дисков с мозгами прилагается. В качестве первичных антител в этом протоколе для репрезентативных данных являются анти-фосфотирозина (1: 500 разведение) и анти-Cut (1: 200 разведение).
  4. Перенести расчлененный ткани в планшете скважин, заполненных промывочной первичного антитела Решение от стеклянной посуде 3 а.
  5. Местопланшета дл смачиваемой на бумажное полотенце (чтобы предотвратить обезвоживание) в качестве наконечника пипетки поле пустым (или другого подобного контейнера) и хранят при температуре 4 ° С в течение ночи.

День 2 (4 ч + монтаж время)

  1. Передача ткани из планшете к новому стеклянную посуду 3 скважины с 0,3% PBT (≈0.5 мл) и промывают ткань в течение 10 мин на качалке. Повторите этот шаг еще три раза в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый)
  2. Удалить последнюю стирку и добавить 0,5 мл раствора Блок к колодцу. Блок в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: этот период времени может быть продлен в соответствии с вашими потребностями.
  3. Удаление раствора Block и добавить 0,5 мл раствора вторичного антитела (из флуоресцентно меченых антител, соответствующих вашей первичного антитела и длина волны флуоресценции, разведенного в растворе блок) на лунку и защитить стеклянную посуду 3 также от света с крышкой или алюминия фольга и инкубировать в течение по крайней мере 2 ч при комнатнойТемпература.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть так же защищены от воздействия света. Это инкубирование может быть продолжено в течение ночи при 4 ° С, в установке, подобной первичной инкубации антитела, но она также может быть выполнена в стеклянной чашке 3 хорошо покрыты лабораторной пленкой, или планшете, если сохранение желаемого антитела.
  4. В конце инкубации антител, удалить вторичным антителом решение и добавить 0,5 мл 0,3% PBT к колодцу и мыть на качалке в течение 10 мин. Повторите этот шаг для в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивание DAPI желательно, перед началом первой стирки, добавить 0,5 мкл DAPI раствора (см материалы) к 500 мкл PBT, которые будут использоваться для первой стирки (1: 1000 разбавления).

3. Монтаж

  1. В конце последней стирки, монтировать усиков / глаз диски на слайде, используя 70% глицерина или PBS в качестве среды для удаления брAin и других нежелательных тканей в бассейне на одной стороне слайда.
  2. Осторожно переместить ткань с использованием гидростатического давления между щипцов, или очень аккуратно с наконечником щипцов, и выстраиваются глазные диски в колонну по направлению к центру слайда.
  3. Удалите все посторонние глицерин или PBS со всего ткани (используя влагу действие лаборатории салфеткой или щипцы работать для этого).
  4. Поместите небольшое количество (≈10 мкл) из монтажной среды вдоль одной стороны колонны глаз диска и поместить на покровное ткани таким образом, чтобы распространить монтажную среду на глаз дисков.
  5. Пусть слайд сидеть за 1 до 2 мин, чтобы ткань / монтажа средних распространяться полностью.
  6. Протрите каких-либо дополнительных крепления среду от от по краям покровного стекла и запечатать его с прозрачным лаком для ногтей.
  7. Захват флуоресцентные изображения глаз диски с использованием конфокальной микроскопии.

Результаты

В качестве примера использования этого протокола, иллюстрирующая результаты midpupal (42 ч АПФ при 25 ° С) глазные диски иммунному окрашиванию с различными антителами представлены на рисунке 2. С помощью антитело, направленное против фосфотирозиновых остатков, мембрана из клеток может быть ?...

Обсуждение

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs12, which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers13 so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We appreciate and would like to thank the Howard Hughes Medical Institute for the HHMI Professor award to U.B. which made this project possible. We thank the college at the University of California, Los Angeles for providing facilities and teaching infrastructure support for this work. The work was also supported with funding from Midwestern University and a generous donation from the Charity Fidelity Gift Fund. We thank John VandenBrooks for comments on the manuscript and Krista Pearman for her technical assistance.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100PromegaH5142Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solutionFisher ScientificF75P1GALCaution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. 
Fix Solution(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serumRockland antibodies & assaysB304Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solutionLife TechnologiesD3571For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting MediumVector LabsH-1000Mounting medium
GlycerolSigmaG5516For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixerVWR82007-202Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer KitKraydenNC9897184Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dishMix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dishCorning7220-85The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitrayNunc438733
Sharp forceps (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm bladeTed Pella1346
100 mm Borosilicate glass capillariesWorld Precision Instruments1B100-4Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine TipSamco Scientific231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)Nalgene8000-0010Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)Saint Gobain Performance PlasticsABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)Saint Gobain Performance PlasticsABW00001

Ссылки

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  2. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
  5. Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
  6. Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
  7. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
  8. Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
  9. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
  10. Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
  11. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
  12. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  13. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
  14. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  15. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

93Pupa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены