Disección y montaje de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal discos Eye

Resumen

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Resumen

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia¹. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar². Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells³. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase^4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Introducción

Los campos de la biología celular y del desarrollo se han visto afectados en gran medida por el organismo modelo: Drosophila melanogaster. Dentro de este modelo, los estudios sobre el ojo disco han contribuido en gran medida de los conocimientos relativos a la señalización, la biología celular y otras áreas. El tercer disco ojo estadio larval tarde se ha estudiado ampliamente y es un modelo de gran alcance de utilizar, ya que da una instantánea de una serie de períodos de desarrollo, cada uno con sus propias moléculas y procesos de señalización único, como la morfogénesis surco progresa a través del disco ojo ^8. Sin embargo, hay una necesidad de ampliar aún más nuestra comprensión de los procesos de desarrollo en la fase de pupa de desarrollo. Si bien se han realizado estudios sobre el disco de ojo de pupa ^3-7, nuestro conocimiento no se acerca a la amplitud del trabajo que se ha realizado en el tercer disco de ojo estadio. Esto es debido, en parte, a la mayor dificultad en la disección de ojo disco de pupa. Por lo tanto, una presentación de lamétodo apropiado de disección podría ampliar en gran medida la investigación en esta área.

Mientras que hay etapas en el desarrollo del disco ojo de pupa que son fácilmente disecados, especialmente en torno al período de mediados de pupa, otros períodos de tiempo son mucho más difícil de diseccionar. Este protocolo representa un método para la disección de los discos de los ojos de pupas que se pueden utilizar de forma universal para todos los marcos de tiempo de desarrollo de pupas. Este protocolo se puede utilizar como una alternativa a otro protocolo ⁹ que muestra un método más fácil y más rápido para diseccionar ojo discos a partir de los puntos de tiempo midpupal. Este protocolo fue filmado y desarrollado para capacitar a los estudiantes avanzados de pregrado en el Consorcio de Investigación de Pregrado de la UCLA en Genómica Funcional (URCFG) ^10,11 en la técnica de disección del ojo de pupa originalmente. Muchos estudiantes universitarios fueron capaces de utilizar el vídeo y el método para aprender esta técnica difícil.

Protocolo

Este procedimiento es un procedimiento de 2 días.

Día 1 (2 horas + tiempo de disección)

Disección 1. Pupal Disco de ojos

1. Seleccione una pupa para la disección.
   NOTA: La edad de la pupa para ser diseccionado será determinado por las necesidades experimentales. Sin embargo, si el examen de la morfología celular, esto se hace con frecuencia en 42 horas después de la formación pupario (APF) a 25 ° C, que es la edad de las pupas se muestra en el video. Recoger pupas blanco (considerado APF 0 h) con un pincel mojado y organizar en orden cronológico (basado en el tiempo de recogida) en un nuevo vial de alimentos mosca se mantiene a 25 ° C. Diseccionar las pupas de edad en este mismo orden cronológico para mantener las diferencias de tiempo entre las pupas tan cerca como sea posible.
2. Transferir la pupa en una gota de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, ver materiales para la receta) en una placa de disección de silicona.
3. Mantenga la parte superior de la envoltura pupal con fórceps y perforar y abrir la lporción ower del caso pupal con un par de pinzas cortantes. Retire la pupa de la caja en el agujero recién formado.
4. Haga un corte diagonal con unas tijeras, a mediados de tórax, en la pupa. Retire los escombros o transferir la cabeza pupa a una nueva gota de PBS. Limpiar utilizando el tubo del soplador pipeta (ver materiales y Figura 1 para más detalles) y añadir PBS adicional según sea necesario. Asegúrese de que para evitar la deshidratación.
5. Agarre firmemente la parte superior de la cabeza de la cutícula pupal con un par de fórceps. Con la punta del tubo del ventilador, presione suavemente en el caso de pupa para extruir el cerebro y otros tejidos, incluyendo los discos de los ojos, fuera del caso de pupa. Asegúrese de evitar el acaparamiento de cualquier tejido dentro de la cutícula.
6. Usando el tubo del soplador lleno de PBS, soplar suavemente el tejido corporal grasa y otros residuos fuera de la caja de cabeza para separar claramente e identificar los discos cerebro y los ojos.
   NOTA: Mantener el cerebro unido a la cabeza de pupa caso permitirá al investigador a utilizar la quecaso del anuncio como un "mango" para la futura manipulación del tejido sin dañar los discos de los ojos o el cerebro. Sin embargo, es común para desalojar el cerebro y los ojos discos de la cabeza y este caso no es perjudicial para el procedimiento general y los resultados. A menudo se requieren múltiples intentos de soplado y empujando para extraer con éxito los discos ojo y el cerebro de la cabeza dentro de la caja de pupa y para que estén claramente separadas de tejido circundante. El más limpio y más uno por separado pueden conseguir los discos de los ojos desde el tejido circundante le ayudará a prevenir el tejido extraño de la fijación de los discos de los ojos.
7. Después de la disección, transferir inmediatamente el tejido a un plato de vidrio 3 y en hielo con 0,5 ml de solución de Fix (ver Materiales). Flotador el tejido en la superficie de la solución Fix durante unos minutos (típicamente el tiempo que tarda para diseccionar el siguiente conjunto de discos de ojo).
   NOTA: Si este no es el primer disco de los ojos para ser diseccionado en esta ronda de la disección, completely sumerja el disco anterior del ojo en la solución de Fix. Si la realización de procedimientos de tinción especiales (por ejemplo, especies reactivas del oxígeno, los lisosomas, etc.) esto se debe hacer antes de la fijación. Con el fin de hacer esto, almacenar los discos de los ojos disecados en PBS enfriado con hielo antes de continuar con el protocolo de tinción apropiada.
8. Después de la disección y la inmersión de todos los discos ojo que está siendo diseccionado, mover el plato de cristal 3 bien a un eje de balancín y el rock a temperatura ambiente durante 30 min.

2. La inmunotinción

1. Retire con cuidado la solución Fix y añadir 0,5 ml de PBS con 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, ver materiales) y lavar el tejido en una mecedora durante 10 minutos. Repita este paso tres veces más para un total de 4 lavados (10 minutos cada uno).
   NOTA: la eliminación cuidadosa de la solución desde el pozo se puede realizar bajo un microscopio de disección para evitar daños en los tejidos o pérdida. La solución se puede aspiró cuidadosamente con una pipeta; preferimos una multa-tipped, pipeta de transferencia desechable que ha tenido la apertura aplanado para reducir la posibilidad de aspirar el tejido.
2. Al final de la cuarta lavado, quitar el lavado y añadir 0,5 ml de solución de bloque (ver materiales) al pocillo e incubar durante 30 min.
   NOTA: Este período de tiempo puede extenderse de acuerdo a sus necesidades.
3. Al final del tiempo de bloque de 30 min, la pipeta 10 l de solución de anticuerpo primario (diluido en solución de Bloque) en el número apropiado de pocillos en una placa de micropocillos.
   NOTA: Un pocillo de una microplaca acomodará alrededor de 4 pares de discos de los ojos conectados con el caso de pupa o 8 pares aislados de los discos de los ojos con cerebros conectados. Los anticuerpos primarios utilizados en este protocolo para los datos representativos son anti-fosfotirosina (dilución 1: 500) y anti-Cut (dilución 1: 200).
4. Transferir el tejido diseccionado en los pocillos de la placa de micro pozos llenos de la solución de anticuerpo primario desde el plato de cristal 3 también.
5. Lugarla microplaca sobre una toalla de papel humedecida (para evitar la deshidratación) en una caja de pipeta vacía punta (u otro recipiente similar) y se almacena a 4 ° C durante la noche.

Día 2 (4 horas + tiempo de montaje)

6. Transferir el tejido de la microplaca a un nuevo plato de cristal 3 bien con 0,3% PBT (≈0.5 ml) y se lava el tejido durante 10 minutos en el balancín. Repita este paso tres veces más para un total de 4 lavados (10 minutos cada uno)
7. Retire el último lavado y añadir 0,5 ml de solución Bloquear al pozo. Bloquear durante 30 minutos.
   NOTA: Este período de tiempo puede extenderse de acuerdo a sus necesidades.
8. Eliminar la solución de bloqueo y añadir 0,5 ml de la solución de anticuerpos secundaria (hecha a partir de anticuerpos marcados con fluorescencia adecuadas para su anticuerpo primario y longitud de onda fluorescente, diluido en solución de Block) para el bienestar y proteger el plato de vidrio 3 y de la luz con una cubierta o aluminio papel de aluminio y se incuba durante al menos 2 horas en la sala detemperatura.
   NOTA: Todos los pasos subsiguientes deben ser protegidos de manera similar de exposición a la luz. Esta incubación se puede extender a toda la noche a 4 ° C, en una configuración similar a la incubación primaria de anticuerpos, pero también se puede realizar en un plato de vidrio 3 y cubierta con la película de laboratorio, o una placa de micropocillos si se desea la conservación de anticuerpos.
9. Al final de la incubación del anticuerpo, retire la solución de anticuerpo secundario y añadir 0,5 ml de 0,3% de PBT para el bien y lavar en el rockero de 10 min. Repita este paso para un total de 4 lavados (10 minutos cada uno).
   NOTA: Si se desea tinción DAPI, antes de comenzar el primer lavado, añadir 0,5 l de solución de DAPI Stock (ver Materiales) a los 500 l de PBT que se utilizarán para el primer lavado (1: 1000 dilución).

3. Montaje

1. Al final de la última de lavado, montar los discos antenales / ojo en una diapositiva utilizando 70% de glicerol o PBS como un medio para eliminar el brain y otros tejidos no deseados en una piscina en un lado de la diapositiva.
2. Mover con cuidado el tejido utilizando la presión hidrostática entre las pinzas, o muy suavemente con una punta de pinzas, y la línea de los discos de los ojos en una columna hacia el centro de la diapositiva.
3. Eliminar todo glicerol extraña o PBS de todo el tejido (utilizando acción de mecha de un laboratorio toallita o los fórceps trabajar para esto).
4. Colocar una pequeña cantidad (≈10 l) de medio de montaje a lo largo de un lado de la columna de ojo de disco y colocar un cubreobjetos sobre el tejido a fin de repartir el medio de montaje sobre los discos de los ojos.
5. Deje reposar de diapositivas durante 1 a 2 minutos para permitir que el medio de tejido / montaje para moverse por completo.
6. Limpie cualquier medio de montaje adicional de descanso de alrededor de los bordes del cubreobjetos y sellarlo con esmalte de uñas transparente.
7. Captura imágenes fluorescentes de los discos de los ojos utilizando microscopía confocal.

Resultados

Como un ejemplo de la utilización de este protocolo, los resultados que ilustra midpupal (42 hrs APF a 25 ° C) ojo discos immunostained con diferentes anticuerpos se presentan en la Figura 2. Mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra los residuos de fosfotirosina, la membrana de las células puede ser observado (Figura 2A). Esto puede ser usado para identificar la disposición regular de las células ommatidial en el ojo pupal después de los procesos de modelado finales que se producen antes d...

Discusión

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs¹², which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers¹³ so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)			80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100	Promega	H5142	Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT			1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.
Fix Solution			(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum	Rockland antibodies & assays	B304	Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution			10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution	Life Technologies	D3571	For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting medium
Glycerol	Sigma	G5516	For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer	VWR	82007-202	Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Krayden	NC9897184	Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish			Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish	Corning	7220-85	The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray	Nunc	438733
Sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade	Ted Pella	1346
100 mm Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip	Samco Scientific	231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001