Dissection et de montage de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupes disques yeux

Résumé

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Résumé

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia¹. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar². Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells³. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase^4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Introduction

Les domaines de la biologie du développement et de la cellule ont été fortement touchés par l'organisme modèle: Drosophila melanogaster. Dans ce modèle, les études du disque de l'œil ont contribué beaucoup de connaissances sur la signalisation, biologie cellulaire et d'autres domaines. Le troisième disque stade de l'œil larvaire fin a été largement étudié et est un modèle puissant à utiliser, car il donne un aperçu d'une série de périodes de développement, chacun avec ses propres molécules et des processus de signalisation unique, comme le sillon morphogénétique progresse à travers le disque de l'oeil ^8. Cependant, il est nécessaire d'étendre notre compréhension des processus de développement dans la phase de chrysalide de développement. Bien qu'il y ait eu des études sur le disque d'œil pupe ^3-7, notre connaissance ne se rapproche pas de l'ampleur du travail qui a été effectué sur le troisième disque stade de l'œil. Cela est dû, en partie, à la plus grande difficulté à disséquer le disque d'oeil chrysalide. En conséquence, une présentation de labonne méthode de dissection pourrait grandement augmenter la recherche dans ce domaine.

Bien qu'il existe des étapes dans le développement du disque de l'œil des pupes qui sont facilement disséqués, en particulier autour de la période mi-pupe, d'autres périodes sont beaucoup plus difficiles à disséquer. Ce protocole représente une méthode pour disséquer disques oculaires de nymphose qui peuvent être universellement utilisés pour tous les délais de développement des pupes. Ce protocole peut être utilisé comme une alternative à un autre protocole que ⁹ montre un procédé plus facile et plus rapide à disséquer les disques de l'oeil à partir des points de temps midpupal. Ce protocole a été filmé et mis au point pour la formation des étudiants avancés de premier cycle dans le cycle UCLA Consortium de recherche en génomique fonctionnelle (URCFG) ^10,11 dans la technique de dissection de l'oeil chrysalide. Beaucoup d'étudiants de premier cycle ont pu utiliser cette vidéo et méthode pour apprendre cette technique difficile.

Protocole

Cette procédure est une procédure de deux jours.

Jour 1 (2 h + temps de dissection)

Dissection 1. pupes yeux disque

1. Sélectionnez une nymphe pour la dissection.
   NOTE: L'âge de la nymphe à être disséqué sera déterminé par les besoins expérimentaux. Toutefois, si l'examen de la morphologie des cellules, cela est souvent effectué à 42 h après la formation de pupe (CSA) à 25 ° C, ce qui est l'âge de l'pupes montré dans la vidéo. Recueillir pupes blanc (considéré comme de l'APF 0 h) avec un pinceau mouillé et les disposer dans l'ordre chronologique (en fonction du temps de collecte) dans un nouveau flacon de nourriture à la mouche maintenue à 25 ° C. Disséquer les nymphes ans dans ce même ordre chronologique afin de maintenir les différences de temps entre les nymphes aussi près que possible.
2. Transférer la nymphe dans une goutte de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, voir matériaux pour la recette) sur une plaque de silicone de dissection.
3. Tenez le haut de la coque de nymphose avec une pince et percer et ouvrir la lpartie de tournesol de la pupe avec une paire de pinces coupantes. Retirer la nymphe de l'affaire dans le trou nouvellement formé.
4. Faire une coupe en diagonale avec des ciseaux, mi-thorax, à la nymphe. Retirer les débris ou transférer la tête de nymphe à une nouvelle baisse de PBS. Nettoyer avec le tube pipette de ventilateur (voir Figure 1 et matériaux pour plus de détails) et ajouter d'autres PBS selon les besoins. Assurez-vous d'éviter la déshydratation.
5. La poignée fermement le haut de la tête cuticule nymphale avec une paire de pinces. Avec la pointe du tube de ventilateur, poussez doucement sur la coque de nymphose à extruder le cerveau et d'autres tissus, y compris les disques de l'oeil, sur la coque de nymphose. Soyez sûr d'éviter l'accaparement tout tissu dans la cuticule.
6. Utilisation du tube de soufflage remplie de PBS, soufflez doucement le tissu de corps gras et d'autres débris sur le cas de la tête de séparer clairement et identifier les disques du cerveau et des yeux.
   REMARQUE: Garder le cerveau fixé au boîtier de la tête de pupe permettra au chercheur d'utiliser l'ilannonce cas comme une "poignée" de manipulation avenir du tissu sans endommager les disques des yeux ou le cerveau. Cependant, il est courant de déloger le cerveau et les yeux de disques le cas de la tête et ce ne nuit pas à l'ensemble de la procédure et les résultats. Il faut souvent plusieurs tentatives de souffler et pousser à extraire avec succès les disques œil et le cerveau de l'intérieur de la tête pupe et afin qu'ils soient clairement séparés du tissu environnant. Le nettoyeur et un plus séparé peuvent obtenir les disques d'oeil du tissu environnant aidera à prévenir les tissus étrangers de fixation sur les disques de l'oeil.
7. Après dissection, transférer immédiatement le tissu dans un plat en verre de 3 bien sur la glace avec 0,5 ml de solution Fix (voir matériaux). Flotter le tissu sur la surface de la solution Fix pendant quelques minutes (généralement le temps qu'il faut pour disséquer le prochain jeu de disques de l'œil).
   REMARQUE: Si ce ne sont pas le premier disque d'oeil à être disséqué dans cette ronde de dissection, Completely immerger le disque de l'œil précédente dans la solution Fix. Si l'exécution des procédures de coloration spéciales (par exemple, les espèces réactives de l'oxygène, les lysosomes, etc.) cela doit être fait avant la fixation. Pour ce faire, stocker les disques oculaires disséqués dans du PBS glacé avant de continuer avec le protocole de coloration appropriée.
8. Après dissection et l'immersion de tous les disques de l'oeil étant disséqué, déplacer le plat en verre de 3 à bien un rocker et le rock à la température ambiante pendant 30 min.

2. Immunocoloration

1. Retirez délicatement la solution Fix et ajouter 0,5 ml de PBS avec 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBT, voir matériaux) et laver le tissu sur une bascule pour 10 min. Répétez cette étape trois fois pour un total de 4 lavages (10 minutes chacun).
   REMARQUE: élimination soigneuse de la solution dans le puits peut être réalisée sous un microscope à dissection pour prévenir les lésions tissulaires ou de la perte. La solution peut être aspiré soigneusement avec une pipette; nous préférons une amende-tipped, jetable pipette de transfert qui a eu l'ouverture aplatie pour réduire le risque de tissus aspiration.
2. A la fin de la 4ème lavage, retirer le lavage et ajouter 0,5 ml de solution de bloc (voir matériaux) pour le bien et incuber pendant 30 min.
   NOTE: Ce délai peut être prolongé en fonction de vos besoins.
3. A la fin du temps de blocage de 30 min, la pipette 10 ul de la solution d'anticorps primaire (dilué dans une solution Block) dans le nombre approprié de puits dans une plaque de microtitration.
   REMARQUE: Un puits d'une microplaque pourra accueillir environ 4 paires de disques oculaires attachés à la coque de nymphose ou 8 paires isolées de disques oculaires avec des cerveaux connectés. Les anticorps primaires utilisés dans ce protocole pour les données représentatives sont antiphosphotyrosine (dilution 1: 500) et anti-Cut (dilution 1: 200).
4. Transférer le tissu disséqué dans les puits de plaques de microtitration remplies de la solution d'anticorps primaire de la boîte de verre de 3 puits.
5. Lieula microplaque sur une serviette en papier mouillée (pour prévenir la déshydratation) dans une boîte vide de la pipette de pointe (ou d'autres contenants similaires) et conserver à 4 ° C pendant la nuit.

Jour 2 (4 h + temps de montage)

6. Transférer le tissu de la microplaque à un nouveau plat en verre de 3 et de 0,3% de PBT (≈0.5 ml) et laver le tissu pendant 10 min sur la bascule. Répétez cette étape trois fois pour un total de 4 lavages (10 min chacun)
7. Retirez le dernier lavage et ajouter 0,5 ml de solution de blocs pour le bien. Bloquer pendant 30 min.
   NOTE: Ce délai peut être prolongé en fonction de vos besoins.
8. Retirer la solution de bloc et ajouter 0,5 ml de la solution d'anticorps secondaire (fait à partir d'anticorps marqués par fluorescence correspondant à votre anticorps primaire et longueur d'onde fluorescente, dilué dans une solution Block) pour le bien et protéger le plat en verre de 3 et de la lumière avec une couverture ou aluminium déjouer et incuber pendant au moins 2 h à la salletempérature.
   NOTE: Toutes les étapes suivantes devraient également être protégés contre l'exposition de la lumière. Cette incubation peut être prolongée pour une nuit à 4 ° C, dans une configuration similaire à l'incubation d'anticorps primaire, mais il peut également être effectuée dans un récipient en verre 3 de puits recouvert d'un film de laboratoire, ou une plaque de microtitration, si la conservation de l'anticorps est souhaitée.
9. À la fin de l'incubation d'anticorps, enlever la solution d'anticorps secondaire et ajouter 0,5 ml de 0,3% PBT pour le bien et laver sur la bascule pour 10 min. Répétez cette étape pour un total de 4 lavages (10 min chacun).
   NOTE: Si la coloration DAPI est souhaité, avant de commencer le premier lavage, ajouter 0,5 pi de solution DAPI des stocks (voir matériaux) pour les 500 pi de PBT qui seront utilisés pour le premier lavage (1: 1000 dilution).

3. Montage

1. A la fin de la dernière lavage, monter les disques yeux des antennes / sur une diapositive en utilisant 70% de glycérol ou PBS comme un moyen de supprimer le largeain et d'autres tissus non désirés dans une piscine d'un côté de la lame.
2. Déplacez doucement le tissu en utilisant la pression hydrostatique entre les forceps, ou très doucement avec une pointe forceps, et aligner les disques d'oeil dans une colonne vers le centre de la diapositive.
3. Retirer tous glycérol étrangère ou PBS à travers le tissu (en utilisant effet de mèche d'un laboratoire lingette ou les forceps travailler pour cela).
4. Placer une petite quantité (≈10 pi) de milieu de montage sur un côté de la colonne de disque de l'oeil et placer une lamelle couvre-objet sur le tissu de façon à répartir le milieu de montage sur les disques de l'oeil.
5. Laissez diapositive sit pendant 1 à 2 minutes pour permettre le / milieu de montage de tissu pour étaler complètement.
6. Essuyez tout support de montage de congé supplémentaire autour des bords de la lamelle et le sceller avec du vernis à ongles transparent.
7. Capturer des images fluorescentes des disques de l'oeil à l'aide de la microscopie confocale.

Résultats

A titre d'exemple de l'utilisation de ce protocole, des résultats illustrant midpupal (42 heures APF à 25 ° C) des disques de l'oeil immunocolorées avec des anticorps différents sont présentés dans la figure 2. En utilisant un anticorps dirigé contre les résidus de phosphotyrosine, la membrane des cellules peut être observée (figure 2A). Ceci peut être utilisé pour identifier l'agencement régulier de cellules dans l'œil ommatidial nymphal suivant les procédés de mise...

Discussion

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs¹², which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers¹³ so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)			80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100	Promega	H5142	Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT			1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.
Fix Solution			(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum	Rockland antibodies & assays	B304	Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution			10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution	Life Technologies	D3571	For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting medium
Glycerol	Sigma	G5516	For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer	VWR	82007-202	Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Krayden	NC9897184	Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish			Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish	Corning	7220-85	The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray	Nunc	438733
Sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade	Ted Pella	1346
100 mm Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip	Samco Scientific	231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001