ال<em&gt; في البيضة</em&gt; الفرخ مشيمائي غشاء (CAM) الفحص بمثابة طعم أجنبي نموذج فعال لسرطان الكبد

Summary

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Abstract

غشاء مشيمائي الفرخ (CAM) يبدأ في تطوير بعد يوم 7 بعد الإخصاب وينضج بعد يوم 12. وCAM هو العوز المناعي بشكل طبيعي وأوعية دموية للغاية، مما يجعله نظام مثالي للورم زرع. علاوة على ذلك، CAM يحتوي على البروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل فبرونيكتين، laminin، الكولاجين، إنتغرين ألفا (V) beta3، وMMP-2، مما يجعلها نموذجا جذابا لدراسة غزو الورم والانبثاث. وقد أخذ العلماء منذ فترة طويلة الاستفادة من علم وظائف الأعضاء من CAM عن طريق استخدامه كنموذج من الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة، تم تعديل مقايسة CAM في العمل بوصفه في الجسم الحي طعم أجنبي نظام نموذجي لمختلف أنواع السرطان الذي يسد الفجوة بين العمل الأساسي في المختبر ونماذج سرطان الحيوانات أكثر تعقيدا. مقايسة CAM يسمح لدراسة نمو الورم، والعلاجات المضادة للورم، والمؤيدة للورم المسارات الجزيئية في نظام بيولوجيا في آن معا من حيث التكلفة وفعالة في الوقت المحدد. هنا، نحن تصف تطوير CAM كسيننموذج ograft من سرطان الخلايا الكبدية (HCC) مع معدلات البقاء على قيد الحياة الجنينية لمدة تصل إلى 93٪ والورم موثوق تأخذ يؤدي إلى نمو ثلاثية الأبعاد، وأورام أوعية دموية.

Introduction

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو السبب الرئيسي ^الثالث 3 وفيات السرطان في العالم ^1. حاليا 30٪ فقط من المرضى HCC مؤهلة للحصول على العلاجات الجراحية يحتمل العلاجية ^2، والعلاج الكيميائي النظامية ليس فعال ^3. ولذلك، هناك حاجة ملحة السريرية غير الملباة لعلاجات HCC جديدة، وتطوير نظم نموذج مناسبة لاختبار كفاءة وكلاء الجديد. يوفر فرخ مشيمائي غشاء (CAM) فحص واستنساخه وفعالة من حيث التكلفة، وسريع طريقة متوسطة مرت من اختبار العقاقير المحتملة المضادة للورم في الجسم الحي.

وقد استخدمت مقايسة CAM على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية ^4. كما تم وضع بنجاح في نموذج طعم أجنبي الورم من السرطانات، بما في ذلك ورم أرومي ^{5، 6} سرطان البنكرياس، سرطان الجلد ^7-9، وعظمية ^10-11. سواء في البيضة والبيضة السابقين ¹²وقد تم استخدام ¹³ تقنيات في الأدب، مع تفاصيل متفاوتة من بروتوكول للبروتوكول. واحد تحديا كبيرا للنموذج CAM طعم أجنبي هو معدلات عالية نسبيا من وفاة الجنين بعد التلاعب في البيض، مع نشر معدلات وفيات الأجنة الفرخ تتراوح 25-50 في المئة ^11-14.

في هذه المقالة، نحن تصف وضع البيضة في نموذج طعم أجنبي من سرطان الكبد الذي ينتج موثوق نمو ثلاثية الأبعاد، وأورام أوعية دموية تشبه تشريحيا HCC غير متمايزة. تكيفنا بروتوكول وصف لأول مرة من قبل Ossowski وآخرون. ¹⁴ وحققت الفرخ الجنينية معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 93٪ مع ارتفاع للغاية engraftment الورم.

Protocol

الحضانة 1. البيض

1. الحصول على 8 يوم البيض خالية من مسببات الأمراض المحددة القديمة المحتوي.
2. وضع البيض في الدورية علبة البيض، وينتهي ختمها تواجه صعودا، ووضع علبة الدورية داخل حاضنة البيض. احتضان البيض لمدة 48 ساعة على 36 درجة مئوية والرطوبة 50٪.

2. اسقاط CAM وفتح البيض

1. جمع البيض من الحاضنة. مكان البيض في رف البيض، يختم حتى الجانب، وتقديمهم إلى غطاء تدفق الصفحي.
2. إيقاف الغرفة وغطاء محرك السيارة أضواء.
3. عقد نهاية مختومة من البيض برفق إلى كاندلر البيض لفضح الأوعية الدموية من CAM فضلا عن كيس الهواء.
   ملاحظة: كاندلر البيض هو مصدر الضوء المستخدمة لتصور الجنين النامي وما يرتبط بها من كيس الهواء والأوعية الدموية.
4. وضع علامة قلم رصاص بين اثنين من الأوعية الدموية الرئيسية.
5. بدوره عن الاضواء واستخدام دبوس معقم دفعة لجعل ثقب واحد في طرف البيضة فوق كيس الهواء (النهاية ختمها) وثقب واحد في المؤسسة العامةncil علامة. لا دفع دبوس دفع كل طريق. حفرة حوالي 3 ملم عميق لن يكون كافيا عادة.
6. أطفي الأنوار. ضغط مصباح سلامة، والضغط على نهاية مفتوحة بحزم ضد الثقب فوق كيس الهواء. تطبيق الشفط لسحب الهواء في حفرة في علامة قلم رصاص، مما تسبب في CAM لإسقاط بعيدا عن قذيفة على علامة قلم رصاص.
7. تأكد من أن كيس الهواء قد انتقلت من نهاية مختومة من البيضة إلى الحفرة بعلامات قلم رصاص باستخدام كاندلر. إذا كان لديه لا، استخدم دبوس دفعة لجعل كل الثقوب أعمق قليلا ثم إعادة تطبيق الشفط باستخدام لمبة السلامة.
8. تشغيل الأضواء. عقد البيض في يد واحدة، بدوره على أداة دوارة DREMEL مع 15/16 بوصة قطع عجلة المرفقة وجعل اثنين من التخفيضات عرضية فقط عميقة بما فيه الكفاية لقطع طريق الصدفة لكن ليست عميقة بما فيه الكفاية لقطع كل الطريق وصولا الى الاكتئاب CAM. جعل التخفيضات حوالي 2 سم في الطول و 1 سم بعيدا عن بعضها البعض. جعل تخفيضات واسعة بما فيه الكفاية بحيث حلقة سيليكون 1 سم في القطر يمكن أن تمر من خلالولكن أرق من عرض الشريط سكوتش القياسية.
9. بعد ذلك، جعل 1 قطع طولية بين وفي نهايات اثنين من التخفيضات عرضية عن طريق لمس طفيفة عجلة قطع للقذيفة.
10. الشريحة ملقط معقم تحت قطعة قذيفة وبالتوازي مع قذيفة. الاستيلاء على قطعة قذيفة مع ملقط وإزالة قطعة كاملة نظيفة.
11. وضع لاصق شفاف على النافذة التي فتحت حديثا، والتأكد من أن يطوي نهاية واحدة على أكثر من نفسه لسهولة إزالة.
12. مكان البيض مرة أخرى في حاضنة في علبة البيض (وليس في رفوف البيض بالتناوب) حتى وقت التلقيح.

3. التلقيح

1. إبقاء الطابق السفلي خليط من البروتين الغشاء، مثل matrigel، على الثلج (لمنع البلمرة) ومكان في غطاء محرك السيارة.
2. استخدام 2 مم EDTA لفصل الخلايا (4-5 مل لكل قارورة T75) وقوارير مكان في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 5 دقائق.
3. resuspend الخلايا فصل في وسائل الإعلام والعد باستخدام عدادة الكريات والأزرق التريبان. استخدام بين 500،000 طنس 2،000،000 الخلايا للتطعيم على CAM، اعتمادا على خط الخلية. تحسين عدد مناسب في التجارب الأولية.
4. حجم التدبير اللازمة لعدد الخلايا المناسبة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
5. تجاهل وطاف resuspend ثم بيليه الخلية في 40 μ لتر من PBS ++ و 20 μ لتر من خليط الغشاء القاعدي.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، والخلايا يمكن علاجها بالعقاقير أو وكلاء اختبارات أخرى حسب الحاجة لإجراء التجارب عن طريق إعادة التعليق في الخلية / الطابق السفلي خليط غشاء تعليق. بدلا من ذلك، وكلاء يمكن pipetted على الخلية / الطابق السفلي خليط غشاء تعليق بعد التطعيم.
6. استرداد رف البيض مع البيض من الحاضنة ومكان في غطاء تدفق الصفحي.
7. الشريط انزع من النافذة، استرداد 1 مم حلقة من السيليكون من الغطاء من قارورة المبردة باستخدام ملقط معقم، وإسقاط عصابة من خلال النافذة.
8. الماصة 60 μ حل ل خلية من برنامج تلفزيوني ++ والغشاء القاعدي mixturالبريد مباشرة في وسط الحلبة سيليكون يستريح على CAM.
9. إعادة الشريط النافذة ونقل رف البيض إلى الحاضنة. عند هذه النقطة، يجب توخي الحذر عند نقل البيض كما الحلبة وتعليق الخلية يمكن بسهولة يصبحون مشردين.
10. السماح أورام لتنمو لمدة 5 إلى 7 أيام.

4. حصاد الأورام

1. وضع تحت وسادة في غطاء محرك السيارة. إعداد 35 × 10 ملم وحاويات لوحات امتصاص العرق حسب الحاجة لالأنسجة. وضع 1 مل PBS ++ في كل 35 × 10 ملم لوحة.
2. ضع حقيبة واقية في غطاء محرك السيارة. خذ مقص تشريح العقيمة وادخال الطرف المدبب في البيض في حفرة قرب نهاية ختمها.
3. خفض حول البيض كله طوليا.
   ملاحظة: CAM والورم مع عصابة يجب ان يلتزم النصف العلوي من وعاء مع النافذة.
4. باستخدام مقص تشريح وملقط، تشريح الورم بعيدا عن CAM ومكان الورم في ملم لوحة 35 × 10. قياس ووزن الأورام. الأورام الثابتة في paraformaldehyدي ثم البارافين تضمين-لاستخدامها في الأنسجة والمناعية التجارب.

5. (اختياري): ورم الخلية تفارق

1. استخدام مقص تشريح لتخطر على الورم في ملم لوحة 35 × 10. صب الورم مفروم في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وإزالة PBS قدر ++ ممكن من خلال pipetting ل.
2. إضافة 2 مل من كولاجيناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني ++)، وتحويل أنبوب على مدى عدة مرات، واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل (تصل إلى عدة ساعات).
3. إضافة 5 مل وسائل الإعلام إلى كل أنبوب و resuspend بدقة من قبل pipetting صعودا وهبوطا من 20 - 40X. pipetting لشامل هو أمر حاسم لكامل تفكك خلية.
4. السماح الرواسب ليستقر، وطاف لنقل أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، تاركا وراءه بيليه الخلية فصلها.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، والكريات الخلايا يمكن استخدامها لتجارب مختلفة (التدفق الخلوي، تحلل للاستخدام في الغرب النشاف، والعزلة RNA، الخ). كما يمكن الحصول على العدد الكلي للخلية السرطانية باستخدام عدادة الكريات وتلطيخ التريبان الأزرق. لاحظ أن الخلايا أصغر بيضاوية الشكل هي خلايا الدجاج من CAM، وينبغي ألا تحسب الخلايا السرطانية. يجب أن يكون هناك عدد ضئيل من تلويث غير ورم (CAM) الخلايا إذا تم تشريح الورم بعيدا عن CAM بعناية.

النتائج

وتظهر الصور التمثيلية من الخطوات الرئيسية في البروتوكول هنا. الشكل 1A يدل على استخدام كاندلر لتصور الجنين النامي، كيس الهواء، والأوعية الدموية من CAM إظهار الشكل 1B-1C عملية اسقاط CAM بجعل اثنين من الثقوب ثم الضغط السلبي باستخدام لمبة السلامة، و1D ال...

Discussion

العديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول على الأرجح حساب لتحسين البقاء على قيد الحياة الجنينية، وكذلك زيادة موثوقية نمو الورم. اسقاط CAM بعيدا عن قذيفة من خلال تطبيق الشفط لكيس الهواء هو أقل الغازية من الطرق الأخرى القائمة (باستخدام إبرة لإزالة الزلال من البيضة، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium incubated eggs	Charles River	N/A	http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx
Egg incubators	GQF	Hova-Bator 2362N
Rotating egg trays	GQF	1611 Automatic Egg Turner
Egg candler	Lyon	Hi-Power 950-070
Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel	Dremel	100-N/7
Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape
Matrigel	BD Biosciences	356234
Cryogenic vials, external thread with silicone washer	Corning	430659
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C9891